ĆWICZENIE 4
KINETYKA REAKCJI
ENZYMATYCZNEJ
61
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA
Ćwiczenie 4
4. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ  STAA
A MICHAELISA
4.1. Podstawy teoretyczne
4.2. Wykonanie ćwiczenia
Podczas wykonywania poniższego ćwiczenia zamiast kolb miarowych stosujemy
probówki. Wykorzystując rozcieńczone roztwory można zaniedbać zjawisko kontrakcji
(popełniany błąd jest minimalny) i przyjąć, że suma objętości poszczególnych
roztworów stanowi całkowitą objętość roztworu.
Przed rozpoczęciem ćwiczenia studenci w grupie ustalają zakres czynności które będzie
wykonywał każdy z nich, ponieważ w trakcie wykonywania ćwiczenia należy dokładnie
kontrolować czas, którym wykonywane są poszczególne czynności.
A. Czynności wstępne
Student 1: Roztwór inwertazy
Drożdże świeże (0.5g) rozetrzeć w moz
dzierzu z piaskiem, dodać 100ml wody
destylowanej, następnie przesączyć przez lejek zawierający niewielką ilość Celitu.
Pozostałość w zlewce i na lejku przemyć 100ml wody destylowanej. Supernatant,
zawierający inwertazę, stanowi materiał do ćwiczeń.
Student 2: Roztwory sacharozy o różnych stężeniach
Przygotować 100ml 0.2M roztworu sacharozy (M = 342 g/mol) w buforze octanowym.
Następnie należy przygotowany roztwór rozcieńczyć w krótkich probówkach według
poniższego schematu.
Rysunek 1
62
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA
Ćwiczenie 4
Student 3: przygotowanie probówek z 10% roztworem NaOH (do zakończenia reakcji)
Przygotować 20 suchych, długich probówek i do każdej wprowadzić 2ml 10% r-ru
NaOH. Probówki opisać zgodnie z poniższym schematem:
Rysunek 2
B. Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej
Student 1: Krzywa kalibracji
Do 5 długich probówek wprowadzić podane niżej objętości poszczególnych roztworów,
a następnie każdą probówkę poddać inkubacji przez 5 minut we wrzącej łaz
ni wodnej.
Po tym czasie zmierzyć wartość absorbancji (A) przy  = 530nm wobec próby kontrolnej
(nr 0) (pomoc asystenta). Wyniki pomiarów zamieścić w tabeli.
Tabela 1
Nr V V V V A C
wz buforu NaOH (10%) kw.pikr. 530 glukozy-fruktozy
probówki [ml] [ml] [ml] [ml] [g*dm-3]
0 0.0 1.0 2.0 2.0
1 0.2 0.8 2.0 2.0
2 0.4 0.6 2.0 2.0
3 0.6 0.4 2.0 2.0
4 0.8 0.2 2.0 2.0
5 1.0 0.0 2.0 2.0
63
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA
Ćwiczenie 4
Student 2 i Student 3: Badanie kinetyki reakcji (wykonanie doświadczenia)
Każdy ze studentów wykonuje pomiar dla dwóch stężeń sacharozy (roztwory wcześniej
przygotowane przez Studenta 2)
Do 4 probówek należy odmierzyć po 3ml wcześniej przygotowanych roztworów
sacharozy o różnym stężeniu (przygotowanych wcześniej przez Studenta 2) dodać 3ml
supernatantu zawierajÄ…cego enzym (przygotowanego przez Studenta 1). Natychmiast
po wymieszaniu pobrać 1 ml roztworu z każdej probówki i dodać do odpowiednio
oznaczonej probówki zawierającej 2ml 10% r-ru NaOH (t = 0) oraz dokładnie
wymieszać. Kolejne próbki należy pobrać po upływie 3, 7, 12 i 20 minut. Następnie do
wszystkich roztworów należy dodać 2ml r-ru kwasu pikrynowego. Wszystkie probówki
poddać inkubacji 5 minut we wrzącej łaz
ni wodnej.
Rysunek 3
64
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA
Ćwiczenie 4
Rysunek 3  cd
Pomiar absorbancji dla poszczególnych próbek wykonuje Student 1 zaraz po tym gdy
cała seria dla danego stężenia jest gotowa.
Dla każdej próby wykonać pomiar absorbancji (A) przy  = 530nm wobec próby
kontrolnej (t = 0). Wyniki pomiarów zamieścić w poniższej tabeli.
Tabela 2
nr. C Absorbancja (A) po czasie t [min]
n
r-ru [mol*dm-3] 3 7 12 20
1 0.2
2 0.1
3 0.05
4 0.025
65
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA
Ćwiczenie 4
Po zakończeniu swoich czynności należy dokładnie umyć sprzęt wielokrotnego użytku
umyć wodą z płynem do mycia (zmazać oznaczenia), wodą oraz acetonem i wysuszyć w
suszarce.
4.3. Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej
(przygotowanie sprawozdania)
·ð Napisanie równaÅ„ reakcji przeprowadzanych podczas doÅ›wiadczenia (hydroliza
sacharozy, reakcja glukozyz kwasem pikrynowym: bilans jonowo-elektronowy
reakcji redoks).
·ð Zamieszczenie uzupeÅ‚nionych tabel 1-3. Z krzywej wzorcowej należy odczytać
stężenie [g*dm-3] glukozy-fruktozy odpowiadających poszczególnym wartościom
absorbancji.
Tabela 3
nr. C C [g*dm-3]
n glukozy-fruktozy
r-ru [mol*dm-3] 3 7 12 20
1 0.2
2 0.1
3 0.05
4 0.025
·ð SporzÄ…dzenie wykresów dla każdego ze stężeÅ„: C = f(t) (4 wykresy).
glukozy-fruktozy
Wyznaczenie v dla każdego ze stężeń (tangens kąta nachylenia stycznej do wykresu
0
C = f(t) w punkcie t = 0).
glukozy-fruktozy
v = tg Ä… = x/y = c/t [g*dm-3*min-1]
0
·ð WykreÅ›lenie krzywej Michaelisa- Menten (zależność v = f(C ) ).
0 substratu
·ð Wyznaczenie z wykresu Michaelisa-Menten staÅ‚ej K (stężenie substratu, przy którym
m
szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę wartości szybkości maksymalnej
½*v ).
max
·ð WykreÅ›lanie prostej Lineweavera- Burka (1/v = f(1/C ) ).
0 substratu
·ð Wyznaczenie staÅ‚ej Miachaelisa (K ) z prostej Lineweavera Burka
m
(tg ą = K /v ; w punkcie przecięcia prostej z osią rzędnych można odczytać wartość
m max
1/ v , natomiast w punkcie przecięcia z osią odciętych wartość  1/K ).
max m
Uwaga:
W sprawozdaniu należy umieścić wszystkie wzory wykorzystywane podczas obliczeń,
obliczenia itp.
66