KINETYKA REAKCJI
ENZYMATYCZNYCH
Krzysztof W. Szewczyk
ENTROPIA
d qrev
d qrev
d S =
" S =
+"
T
T
Dla przemian spontanicznych "S e" 0
Potencjał termodynamiczny
energia Gibsa
G = H -T S
T = const.
"G = "H -T "S = qP - qrev
C
G = G0 + RT ln
C0
C0 = 1 mol/dm3
G = G0 + RT ln C
Potencjał termodynamiczny
przemiany
a A + b B �! c C + d D
"G = cGC + d GD - aGA - bGB
c d
�ł �ł
�łCC CD �ł
"G = "G0 + RT ln�ł a b �ł
CA CB łł
�ł
"G0 = cG0,C + d G0,D - aG0,A - bG0,B
W stanie równowagi "G = 0
c d
�ł �ł
CC CD �ł
�ł
" G0 = - RT ln�ł a b �ł = - RT ln K
CA CB łł
�ł
KINETYKA REAKCJI
CHEMICZNYCH
A + B �! C + D
Prawo działania mas
d CC d CA
r = = - = r+ - r- = k+ CA CB - k- CC CD
d t d t
Stała równowagi
-"G0
CC CD
K =
RT
K = e
CA CB
- "H0 "S0
ln K = +
"G0 = "H0 - T"S0
RT R
PRZYKA
AD
IZOMERAZA GLUKOZOWA
t= 50 oC
K = 0,98 "H = 5,73 kJ/mol
Obliczyć stałą równowagi w 70oC
- "H0 "S0
�ł �ł
K2 - "H0 �ł 1 1
ln K = +
ln = - �ł
�ł
RT R K1 R T2 T1 �ł
�ł łł
K2 -5,73�"103 1 1
�ł �ł
ln = - = 0,124
�ł �ł
K2 = 0,98�"e0,124 = 1,11
K1 8,31
�ł343 323łł
KATALIZA
G
E
substrat
"G
produkt
reakcja katalityczna
reakcja niekatalityczna
PROSTA REAKCJA
ENZYMATYCZNA
k+1
k+2
S + E
[SE] E + P
k-1
k-2
d CS
r1 = - = k+1CS CE - k-1 CES
d t
d CP
r2 = = k+2 CES -k-2 CE CP
d t
d CES
= k+1 CS CE + k-2 CE CP - k-1 CES - k+2 CES
d t
PROSTA REAKCJA
ENZYMATYCZNA
stała równowagi
�ł �ł
�ł �ł
CP �ł k+1 k+2 "G0
�ł
�ł �ł
K = = = exp�ł-
�ł
�ł
CS �ł R T
�ł łł
�ł łłeq k-1 k-2
hipoteza stanu pseudo-ustalonego
d CES
H" 0
r1 = r2
d t
Prosta reakcja enzymatyczna
k+1CS + k-2 CP
CES = CE,0
k+2 + k-1 + k+1CS + k-2 CP
CE,0 = CE + CES
rS = r1 = k+1 CS CE - k-1 CES = k+1 CS (CE,0 - CES ) - k-1 CES
Prosta reakcja enzymatyczna
k+1 k+2 CS - k-1 k-2 CP
rS = CE,0
k-1 + k+2 + k+1 CS + k-2 CP
k+1 k+2 1
k-2 =
k-1 K
CP
�ł
k+1 k+2 CE,0 �łCS -
�ł �ł
K
�ł łł
rS =
�ł �ł
k+2 CP �ł
�ł
k-1 + k+2 + k+1 �łCS +
�ł
k-1 K
�ł łł
Prosta reakcja enzymatyczna
CS >> CE,0
* *
rm (CS - CS )
rS =
* *
Km + (CS - CS )
1
�ł
k+1 *
k2 CE,0 �ł1 +
�ł �ł
1+ CS
CS,0
K
* k-1 + k+2 k-1
* �ł łł
*
CS =
Km
rm =
k+1 1- k+2
1+ K
k+2
1 -
k-1 K
k-1 K
Kinetyka Michaelis - Menten
K "
k-2 = 0
rm CS
rS =
Km + CS
k-1 + k2
rm = k+2 CE,0 Km =
k1
Kinetyka Michaelis - Menten
rs 1
0,8
0,6
rm CS
0,4
rS =
Km + CS
0,2
0
02468 10 12
Cs/Km
HIPOTEZA PSEUDO-
RÓWNOWAGI
CE CS k-1
K1 = =
CES k+1
rm CS
rS =
K1 + CS
Kinetyka Michaelis - Menten
dCS rm CS
= -
dt Km + CS
CS,0
rm t = (CS,0 - CS ) + Km ln
CS
Wyznaczanie wartości parametrów
kinetycznych
1,2
1
1
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0246810 12
t
Cs
szybkość reakcji  stężenie substratu stężenie substratu - czas
s
r
C
s
METODA NAJMNIEJSZYCH
KWADRATÓW
2
"(y - yobl ) min
i
i
y = a x + b
_ _
"x yi - N x y
i
i _ _
a =
_
-
b = y - a x
"(x )2 N (x)2
i
i
N
N
yi
"x
i
_
"
_
1
1
x =
y =
N
N
Wyznaczanie parametrów równania
Michaelis-Menten
Wykres Lineweavera - Burka
1 Km 1 1
= +
rS rm CS rm
1/rS
1/rm
1/CS
Wyznaczanie parametrów równania
Michaelis-Menten
Wykres Woolfa-Langmuira
CS 1 Km
= CS +
rS rm rm
CS/rS
Km/rm
CS
Wyznaczanie parametrów równania
Michaelis-Menten
wykres Eadie - Hofstee ego
rS
rS
rS = rm -Km
rm
CS
rS/CS
rm/Km
AKTYWACJA I INHIBICJA
SUBSTRATEM
n
rm CS rm CS
r
rS = rS =
r
n 2
Km + CS CS
Km + CS +
KI
CS
CS
inhibicja
aktywacja
HAMOWANIE
WSPÓA
ZAWODNICZ
CE
k+1
k+2
S + E
[SE] E + P
k-1
k+3
EI
E + I
rm = k+2 CE,0
k-3
k-1 + k+2
Km =
rm CS
k+1
rS =
�ł �ł
CI �ł
k-3
�ł
Km �ł1+ + CS
KI =
KI �ł
�ł łł k+3
HAMOWANIE
NIEWSPÓA
ZAWODNICZ
CE
k+1
k+2
S + E
[SE] E + P
k-1
I
k+3
k-3
ESI
rm CS
rS =
�ł �ł
CI �ł
�ł
Km + CS �ł1 +
KI �ł
�ł łł
OKREŚLANIE TYPU HAMOWANIA
wykres Lineweavera-Burka
1/rS
1/rS
CI
CI
1/CS
1/CS
hamowanie współzawodniczące hamowanie niewspółzawodniczące
OKREŚLANIE TYPU HAMOWANIA
wykres Woolfa
CS/rS
CS/rS
CI
CI
CS
CS
hamowanie współzawodniczące hamowanie niewspółzawodniczące
OKREŚLANIE TYPU HAMOWANIA
wykres Hoftee ego
rS rS
CI CI
rS/CS rS/CS
hamowanie współzawodniczące
hamowanie niewspółzawodniczące
OKREŚLANIE TYPU
HAMOWANIA
metoda Dixona
1/rS 1/rS
CS,1
CS,1
CS,2 CS,2
CI CI
- KI
hamowanie współzawodniczące
hamowanie niewspółzawodniczące
WPA
YW TEMPERATURY
�ł �ł
ER �ł
�ł
rm = CE,0 k+2,0 exp�ł-
�ł
RT
�ł łł
ln(r)
1/T
DEZAKTYWACJA
ODWRACALNA
E �! Ed
CE �ł �ł
�ł �ł " G0,d �ł
d
�ł �ł
Kd = = exp�ł-
�ł
�ł �ł
CE �ł RT
�ł łłeq
�ł łł
�ł �ł
ER
�ł �ł
k+2,0 exp�ł-
�ł
CE,0
RT
�ł łł
rm = k+2 = CE,0
1 + Kd �ł �ł
"G0,d �ł
1 + exp�ł-
�ł �ł
RT
�ł łł
WPA
YW TEMPERATURY
ln(r)
1/T
DEZAKTYWACJA
NIEODWRACALNA
E Ed
d
CE = CE,0 e-k t
ED
ln2
-
o RT
�1/2 =
kd = kd e
kd
Wpływ pH
+ +
H H
E �!�ł E- �!�ł E2-
�ł �ł
rm
k+2 CE,0 CH +
rm =
2
CH +
Kh + CH + +
KI
pH
STABILIZACJA ENZYMÓW
" dodatek związków stabilizujących
 ą - amylaza  50 % sorbitol
 ą - amylaza  Ca2+
" chemiczna modyfikacja białka
 papaina  sieciowana aldehydem glutarowym
" unieruchomianie na powierzchni nośnika
lub wewnątrz polimeru
UNIERUCHOMIANIE ENZYMÓW
Liczba Damk�hlera
rm
substrat
NDa =
kC CS,"
wnikanie do
powierzchni
dyfuzja wewnątrz
ziarna
NDa >>1 zakres dyfuzyjny
E
E
NDa <<1 zakres kinetyczny
E
Współczynnik efektywności
CS
CS.,"
rS
CS,0
� =
rs(Cs,0)
LIPAZY
OH
HO + 3 R-COOR'
OH
+ R'-OH
alkoholiza
OH R'
R
+ HO +R'
OH R R' R
OH R'
R + HO R + R'
R
transestryfikacja
gliceroliza
OH R R' R
R
acidoliza
+ R'-COOH
R'
R' + 3 R-COOH
R'
tetraed ryczn y
Asp Asp
stan przejś ciowy
aktywny enzym
O
C C
G O
G
O C
O O O O
O C
R
R
H O H O
H H
+
N N N N
Ser Ser
His His
O
A
O C
Mechanizm
R
G
O
alkoholizy
H
Asp Asp
C C
O O
A
O O O O
O C C
R R
H O O
H H
+
N N N N
Ser Ser
A
O
tetraed ryczn y
H
His His
acyloenzym
stan przejściowy
ENZYMATYCZNA
ALKOHOLIZA
1,2-diacyloglicerol 2-monoacyloglicerol
O
1,3  r e g i o s e l e k t y w n a
1,3  r e g i o s e l e k t y w n a
1,3  r e g i o s e l e k t y w n a
O C O
H2C O R H2C OH
C C
R O CH R O CH
H2C OH H2C OH
O
O C
izomeryzacja
H2C O R H2C OH
C
R O CH HO CH
- - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - -
H2C O R H2C OH
O O
C
C C
O
H2C O R H2C O R
triacyloglicerol glicerol
HO CH HO CH
H2C O R H2C OH
C
O
n i e s e l e k t y w n a
n i e s e l e k t y w n a
n i e s e l e k t y w n a
1,3-diacyloglicerol 1-monoacyloglicerol
MODEL ENZYMATYCZNEJ
ALKOHOLIZY
EB
ki k-i
A
- rmax
k1
B
E AE
rA =
k-1
KM ,A KM ,B KM , A CB
D 1+ + +
k2
CA CB Ki CA
k4
C
k-3
E'
E'B
k3
B
PROPANOLIZA TRIOCTANU
GLICEROLU
0,4
0,2
0,0
0 6 12 18 24
czas reakcji [h]
triC (exp) diC (exp) monoC (exp) glyOH (exp)
triC (m) diC (m) monoC (m) glyOH (m)
3
stężenie reagenta [mol/dm ]
Zadania
" Zadanie 2.1
 Wyznaczyć równowagowy stopień przemiany glukozy we
fruktozę, jeżeli stała równowagi wynosi 0,98
" Zadanie 2.2.
 Obliczyć parametry równania Michaelis-Menten dla reakcji
enzymatyczne na podstawie danych doświadczalnych
CS (mmol/dm3) rs mmol/dm3 min
0,01 0,9
0,02 2,0
0,05 4,2
0,1 7,6
0,2 12,1
0,3 14,9
0,5 18,7
WYKAZ OZNACZEC

" C  stężenie (mol/dm3)
 CE,0  początkowe stężenie enzymu
 CH+ - stężenie jonów wodorowych
 CES  stężenie kompleksu aktywnego
 CP  stężenie produktu reakcji
 CS - stężenie substratu
" ER  energia aktywacji reakcji
" ED  energia dezaktywacji
" "G  zmiana potencjału termodynamicznego reakcji
 "GR  reakcji enzymatycznej
 "Gd  dezaktywacji enzymu
" "H  entalpia reakcji
" k  stała kinetyczna
 indeksy oznaczają nr reakcji i kierunek
 np. k+1  stała kinetyczna dla przemiany 1 z lewa na prawo
" kd  stała szybkości dezaktywacji
" K  stała równowagi reakcji
" Km  stała Michaelis  Menten
" KI  stała inhibicji
" Kh  stała w równaniu Michaelis (stała nasycenia dla jonów wodorowych)
Wykaz oznaczeń cd
" NDa  liczba Damk�hlera
" r  szybkość reakcji
" rm  maksymalna szybkość reakcji
" R  stała gazowa (8,31 J/mol deg)
" "S  entropia reakcji
" T  temperatura ( K )
" t  czas
" � - współczynnik efektywności