Ćw. 13 Metody miareczkowania wirusów. Test hemaglutynacji.

Miareczkowanie wirusów:

• Miano wirusa – jest to liczba zakaźnych cząstek wirusa zawartych w 1 ml zawiesiny tkanek zwierzęcia, 1 ml płynu

z zarodka kurzego lub w 1 ml pożywki z hodowli komórek; określa się go po namnożeniu wirusa w odpowiedniej
wrażliwej hodowli komórek

• Technika miareczkowania wirusów – polega na wykonywaniu wielu kolejnych rozcieoczeo badanego materiału i

szczepieniu materiałem z każdego rozcieoczenia pewnej liczby zwierząt doświadczalnych, zarodków kurzych lub
wrażliwych hodowli komórkowych

-

Użycie 4-10 obiektów dla każdego rozcieoczenia jest niezbędne, aby wyeliminowad odchylenia
wynikające z biologicznej niejednorodności komórek, zwierząt i wirusów

• Działanie wirusa jako wskaźnika reakcji zachodzącej między nim a gospodarzem może byd obserwowane w

różnych postaciach, w zależności od destruktywnej aktywności czynnika patogennego i typu wrażliwości obiektu
doświadczalnego

•

Dodatni efekt działalności wirusa

określa się na podstawie rodzaju wywołanych przezeo reakcji, a wartośd

efektu oblicza się na podstawie najmniejszej dawki zdolnej do ujawnienia tej wskaźnikowej cechy wirusa

ED

50

:

 effective dose – 50% dawka efektu, jest to taka najmniejsza ilośd czynnika działającego, która swą typową

reakcję wywołuje u 50% obiektów doświadczalnych

• Powszechnie stosowana jest metoda obliczania dawki 50% efektu, oznaczonej jako ED

50

• W zależności od rodzaju obiektów biologicznych używanych do mianowania wirusa wielkośd ED

50

może byd

oznaczona jako:

-

LD

50

(lethal dose) –

50% dawka śmiertelna

, czyli takie rozcieoczenie badanego wirusa, które wywołuje

śmierd 50% zakażonych zwierząt

-

ID

50

(infectious dose) –

50% dawka zakaźna

, czyli takie rozcieoczenie badanego wirusa, które wywołuje

objawy zakaźne u 50% obiektów biologicznych

 U zwierząt na przykład porażenia, ale nie śmierd
 W hodowlach komórek, jeśli wirus namnaża się bez efektu cytopatycznego, obecnośd wirusa

stwierdza się za pomocą hemaglutynacji, hemadsorpcji lub immunofluorescencji

-

CCID

50

(cell culture infectious dose) –

50% dawka zakaźna dla hodowli komórek

, czyli takie rozcieoczenie

badanego wirusa, które wywołuje efekt cytopatogenny u 50% zakażonych hodowli komórek (obserwacja
w mikroskopie świetlnym)

-

PFU (plaque forming unit) –

jednostka łysinkowa

, jest to takie największe rozcieoczenie badanego

wirusa, które wywołuje zniszczenie hodowli komórek w postaci pól („łysinek”) dających się policzyd
(jednostki podaje się w skali logarytmicznej)

Jednostka hemaglutynacji i hemadsorpcji:

• Jednostka hemaglutynacji (JHA) – jest to największe rozcieoczenie badanego wirusa, które wywołuje

hemglutynację określonej ilości komórek

-

Ilośd jednostek hemaglutynacyjnych wirusa w 1 ml (czyli

miano hemaglutynacyjne

) nie jest

równoznaczne z mianem zakaźnym wirusa, ponieważ krwinki są hemaglutynowane także przez wirusy
niekompletne lub przez częśd kapsydu wirusa.

• Jednostka hemadsorpcji – jest to największe rozcieoczenie badanego wirusa, które daje dodatni odczyn

hemadsorpcji u 50% zakażonych hodowli komórek

Odczyn hemaglutynacji i zahamowania hemaglutynacji:

Serologiczna identyfikacja wirusów:

• Jedną z ważnych właściwości, charakterystyczną dla wielu wirusów, jest hemaglutynacja wirusowa

• Wirusy należące do różnych grup taksonomicznych mają zdolnośd wiązania się z powierzchnią erytrocytów

• Podstawą wystąpienia tego zjawiska jest obecnośd odpowiednich receptorów u wirusów i na powierzchni

krwinek

• Po przyłączeniu się wirusa do powierzchni krwinki jego wolna częśd może związad się z powierzchnią innego

erytrocytu

• Następstwem tego procesu jest aglutynacja (zlepianie, zgrupowanie) dużych ilości krwinek czerwonych w

widoczne grudki lub osad

Odczyn hemaglutynacji:

• Adsorpcja wirusa do powierzchni krwinki czerwonej zachodzi w bardzo krótkim czasie (2-5 min.), w

temperaturze od 0 °C do 37 °C i w odpowiednich warunkach jonowych

• W ciągu następnych 30-60 min. Następuje widoczna gołym okiem aglutynacja erytrocytów

• W przypadku niektórych wirusów dochodzi do enzymatycznego strawienia mukopolisacharydowych receptorów

krwinkowych, mieszczących się w mukoproteinach powierzchni krwinki

-

Zjawisko to zachodzi w wyniku działania enzymu wirusowego – neuraminidazy

-

Następstwem tego jest elucja wirusa z powierzchni krwinki

Elucja wirusa z powierzchni krwinki:

• Czynniki sprzyjające elucji:

-

duża liczba cząstek wirusa przypadająca na 1 komórkę

-

pH 6.8-7.7

-

temperatura 37 °C

• Oprócz działania enzymatycznego odłączanie się wirusa jest również w pewnym stopniu następstwem czysto

mechanicznego uszkodzenia połączeo wirusa z krwinką na skutek ruchów Browna

• Uwolniony wirus zdolny jest do aglutynowania nowych krwinek, zaś erytrocyty po elucji wirusa nie mogą byd

zlepiane przez ten sam jego gatunek

• Hemaglutynację uwolnionych krwinek mogą natomiast wywoład inne wirusy, które reagują z innymi receptorami

znajdującymi się na powierzchni krwinek

Gradient receptorowy Burnetta:

• Obejmuje on w kolejności wzrostu aktywności enzymatycznej, następujące wirusy:

• Oznacza to, że krwinki po aglutynacji i elucji nie ulegają ponownej aglutynacji zarówno pod wpływem tego

samego wirusa, jak i wirusów stojących od niego na lewo, ale ulegają jej pod wpływem wirusów mieszczących się
na prawo w podanym szeregu

Aktywnośd hemaglutynacyjna

• Wirusy różnią się znacznie pod względem aktywności hemaglutynacujnej:

-

Niektóre zlepiają krwinki różnych warunkach

-

Inne zlepiają krwinki tylko w ściśle określonych warunkach

• Czynniki wpływające na hemaglutynację:

-

szczep wirusa

-

miano wirusa

-

liczba pasaży wirusa

-

rodzaj komórek gospodarza

-

krwinki (gatunek dawcy, rasa i jego wiek)

Warunki przebiegu odczynu to:

• Odpowiednia temperatura

• Odpowiednie pH

• Obecnośd lub brak jonów

• Inhibitory hemaglutynacji:

-

To nieswoiste czynniki różnego typu (białka, mukoproteiny, lipidy, polisacharydy) występujące w
surowicy i wydzielinach

-

Wiążąc się z receptorami wirusów uniemożliwiają im łączenie się z erytrocytami – przez co hamują
hemaglutynację

1. Odczyn hemaglutynacji jakościowej:

• Cel: wykrycie hemaglutynin (wirusa) w badanym płynie omoczniowym i owodniowym zarodka kurzego lub w

płynie z hodowli komórek

Wynik dodatni cechuje powstanie charakterystycznych strontów i grudek zlepionych krwinek, przy czym płyn staje

się zupełnie klarowny.

2. Odczyn hemaglutynacji ilościowej – odczyn Salka:

• Cel: oznaczenie miana wirusa w jednostkach hemaglutynacyjnych (JHA) – jest to najwyższe rozcieoczenie

badanego wirusa, które wywołuje hemaglutynację określonej ilości krwinek



Wynik (w zależności od wyjściowej objętości wirusa) należy odpowiednio przeliczyd na 1 ml.



Ilośd JHA wirusa w 1 ml (czyli miano hemaglutynacyjne) nie jest równoznaczne z mianem zakaźnym wirusa.

Wykonanie:

1) Sporządzid kolejne, dwukrotnie wzrastające rozcieoczenia (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 itd.) wirusa NDV w PBS:

a) Do kolejnych 11 dołków w płytce plastykowej wprowadzid po 0,5ml PBS.

b) Do pierwszego dołka w szeregu dodad 0,5ml zawiesiny NDV.

c) Świeżą pipetą wymieszad dokładnie zawartośd dołka, a następnie 0,5ml otrzymanego rozcieoczenia (1:2)

przenieśd do kolejnego dołka.

d) Wykonad w ten sposób kolejne rozcieoczenia wirusa aż do 1:1024.

e) Z 10 dołka odrzucid 0,5ml rozcieoczenia.

f) W 11 dołku pozostawid 0,5ml PBS jako kontrolę krwinek.

2) Do wszystkich dołków dodad po 0,5ml 1% zawiesiny krwinek kurzych w PBS.

3) Wszystkie składniki wymieszad dokładnie pipetą, rozpoczynając od kontroli krwinek w kierunku

najmniejszego rozcieoczenia wirusa.

4) Po 30-60 min odczytad wynik odczyny hemaglutynacji.

Odczytanie wyników:

1) Przy braku hemaglutynacji krwinki przybierają kształt małego czerwonego guziczka umiejscowionego

pośrodku dołka płytki (KONTROLA KRWINEK)

2) W wypadku silnej hemaglutynacji całe dno dołka pokryte jest jednolitą warstewką krwinek

3) Przy częściowej hemaglutynacji można otrzymad obraz pośredni między opisanymi powyżej, powstaje wtedy

różnej wielkości pierścieo ( w zależności od stopnia hemaglutynacji) z pustym środkiem