Ćwiczenie 3

(MOiŚ)

Techniki mikroskopowe.

1.

Budowa mikroskopu.

2.

Podstawowe pojęcia w mikroskopii

3.

Mikroskop

jasnego pola

ciemnego pola

kontrastowo-fazowy

fluorescencyjny

4.

Preparat przyżyciowy

5.

Preparat utrwalony

1. Budowa mikroskopu jasnego pola

elementy mechaniczne: statyw, rewolwer, tubus, stolik przedmiotowy, przysłona żarówki, głowica
binokularowa, śruby ogniskowania (mikrometryczna i makrometryczna), pokrętła kondensora (posuw
pionowy i przesuwy XY)

elementy optyczne: układ oświetleniowy, przysłona aperturowa, , okular, obiektyw, kondensor

2. Podstawowe pojęcia w mikroskopii

a) powiększenie mikroskopu – stosunek wielkości obrazu pozornego A’’, widocznego w mikroskopie

do obrazu rzeczywistego A. Wartość powiększenia to wypadkowa (iloczyn) powiększenia okularu i
obiektywu oraz długości tubusa.

b) zdolność rozdzielcza – minimalna odległość pomiędzy dwoma punktami, przy której widać je jeszcze

jako oddzielne. Wartość ta jest charakterystyczna dla danego układu optycznego. Im mniejsza
wartość zdolności rozdzielczej tym dokładniejszy obraz.

Uproszczony wzór na zdolność rozdzielczą:

d = λ/NA
d = zdolność rozdzielcza
λ = długość fali świetlnej
NA = apertura numeryczna (liczbowa) obiektywu

c) apertura numeryczna – zdolność układu optycznego do przyjmowania strumieni światła

NA = n × sin.u

sin.u = sinus połowy kąta aperturowego

n – współczynnik załamania światła w środowisku pomiędzy preparatem, a obiektywem

d) kąt aperturowy – kąt zawarty pomiędzy skrajnymi promieniami światła biegnącymi od obiektu do

soczewki obiektywu. Teoretycznie maksymalna wartość może mieć 180°, w praktyce tylko 143°36’.
Wtedy wartość apertury numerycznej wynosi maksymalnie 0,95.

3. Możliwości polepszenia rozdzielczości

Im mniejsza wartość zdolności rozdzielczej tym lepiej (dwa punkty rozróżniane już przy niewielkich
odległościach). Tak więc na podstawie poniższego wzoru, w celu polepszenia zdolności rozdzielczej układu
optycznego należy obniżyć licznik i powiększyć mianownik:

d = λ↓/NA↑

W praktyce można to osiągnąć poprzez:

a)

zmniejszenie długości fali świetlnej – zmiana filtru zółtozielonego na niebieski (rozdzielczość z 0,2
µm poprawia się na 0,17µm przy ustalonej aperturze o wartości NA =1,3) lub zastosowanie światła
UV i obiektywu kwarcowego (rozdzielczość 0,1 µm)

b)

zwiększenie współczynnika załamania światła poprzez zastosowanie immersji (rodzaje immersji –
woda, glicerol, olejek cedrowy). Substancje immersyjne mają wyższy współczynnik załamania
światła od powietrza.

................

Kąt aperturowy zależy od parametrów technicznych zastosowanego układu optycznego (tutaj
mikroskopu) i nie ma możliwości jego polepszenia.

4. Mikroskop ciemnego pola

Budową przypomina zwyczajny mikroskop jasnego pola. Ma jednak zamontowany specjalny element:
kondensor ciemnego pola z przysłoną.

Do przesłony kondensora docierają promienie równoległe, biegnące od źródła światła. Budowa
przesłony pozwala na docieranie do preparatu tylko tym promieniom, które zostały odchylone. Jeżeli taki
odchylony promień trafi na obiekt biologiczny ulega załamaniu i wpada do obiektywu. Jeżeli promień nie
natrafi na obiekt biologiczny to nie zostanie skierowany do obiektywu. W ten sposób widoczne dla
obserwatora mogą być tylko biologiczne obiekty w postaci jasnych elementów na ciemnym tle.

Rys.

W trakcie korzystania z mikroskopu ciemnego pola niezbędne jest zastosowanie odpowiedniej immersji.
Substancję immersyjną umieszczamy nie tak jak w przypadku klasycznych mikroskopów jasnego pola
pomiędzy preparatem, a obiektywem ale pomiędzy kondensorem, a preparatem.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu ciemnego pola jest podobna do rozdzielczości mikroskopu jasnego
pola.

Zastosowanie mikroskopu ciemnego pola: obserwacja żywych organizmów (m.in. bakterii)

5. Mikroskop kontrastowo – fazowy

a) Specjalne elementy budowy:



pierścień fazowy w kondensorze (służy do kierowania promieni świetlnych pod odpowiednim

kątem na preparat)



Obiektyw z płytką fazową napyloną węglem

b) Obiekty amplitudowe – obiekty, które zmieniają amplitudę przechodzącej przez nie fali świetlnej

czyli jej natężenie. Zmiana ta jest widoczna dla oka ludzkiego.

Obiekty fazowe to takie, które nie powodują zmiany amplitudy fali przez nie przechodzącej, a
jedynie zmieniają jej fazę . Oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować różnicy.

c) Promień, który napotkał obiekt biologiczny zostaje poddany przesunięciu fazowemu o ¼ dł. fali. W

wyniku tej zmiany długości fali następuje zmiana kąta załamania i promień wpada do obiektywu w
miejsce nienapylone na płytce fazowej. Promienie nie przechodzące przez obiekty biologiczne
kierują się do obiektywu w miejsce napylone płytki fazowej i dzięki niej również zostaje przesunięta
ich faza o ¼ dł fali. Ponadto przejście przez napylone miejsce w płytce fazowej powoduje zagięcie
fali świetlnej i może ona napotkać promień światła, który biegł od obiektu biologicznego. Jeżeli
zetkną się takie dwie fale o tej samej fazie następuje ich interferencja (wzmocnienie) i zmienia sie
amplituda fali co skutkuje tym, że oko ludzkie ma możliwość zarejestrowania tej zmiany.

Rys.

6. Mikroskop fluorescencyjny

a) Źródłem światła jest lampa rtęciowa. Światło UV nie tworzy obrazu, a jedynie dostarcza energii i

wzbudza fluorescencję.

Filtry wzbudzające – formują wiązkę promieni UV
Filtry zaporowe (odcinające) – chronią ludzkie oko przed wpływem światła UV

b) fluorescencja naturalna: chlorofil, witamina A

fluorescencja wtórna: oranż akrydyny

c) wykorzystanie mikroskopu fluorescencyjnego w mikrobiologii



ocena żywotności hodowli



ocena fazy wzrostu hodowli (lag, log, stationary, death)

d) oranż akrydyny – barwnik wiążący się głównie z kw. nukleinowymi. Żywa komórka nie wybarwia

się oranżem akrydyny.

7. Przygotowanie preparatu przyżyciowego i utrwalonego

W każdym przypadku czynności wykonujemy w warunkach jałowych (w pobliżu palnika lub w komorze
z laminarnym przepływem powietrza)

Preparaty przyżyciowe:

a) odtłuszczamy szkiełko w płomieniu palnika
b) nanosimy na szkiełko kroplę z hodowli płynnej lub kroplę NaCl 0,89% i 1 kolonię z hodowli

stałej

c) przykrywamy szkiełkiem nakrywkowym

Preparaty utrwalone

a) odtłuszczamy szkiełko w płomieniu palnika
b) nanosimy na szkiełko kroplę z hodowli płynnej lub kroplę NaCl 0,89% i 1 kolonię z hodowli

stałej

c) czekamy aż szkiełko wyschnie (ok 10 min.)
d) utrwalamy materiał biologiczny, przeciągając szkiełko 5 razy w płomieniu palnika

8. Metody barwienia

a) barwienie proste (jeden barwnik)
b) barwienie złożone



metoda Gram’a



barwienie endospor metodą Shaeffera-Fultona



barwienie prątków metodą Ziehl-Nielsena



barwienie endospor i toksyn krystalicznych Bth wg Smirnoff’a

................

Barwienie pozytywne – wybarwiona jest komórka



proste – jeden barwnik np. błękit metylenowy



złożone – 2 lub więcej barwników

Barwienie negatywne – wybarwione tło

9. Metoda Gram’a

a) fiolet krystaliczny (f.gencjan) 1-2 min
b) spłukujemy wodą i zalewamy płynem Lugola na 1 min
c) odbarwiamy alkoholem 30 s
d) spłukujemy wodą
e) fuksyna karbolowa 30s
f) spłukujemy wodą
g) suszymy na bibułce

W ścianie komórkowej tworzy się kompleks fioletu krystalicznego i płynu Lugola (podstawienie małego jonu chloru w
fiolecie krystalicznym przez dużo większy jon jodu powoduje wytrącanie się kompleksu). Pod wpływem alkoholu łańcuchy
peptydoglikanu ulegają odwodnieniu i denaturacji przez co zacieśniają się zatrzymując kompleks. Po spłukaniu kompleks
zawarty pomiędzy licznymi łańcuchami peptydoglikanu nie zostaje wymyty. Jeżeli jednak komórka bakteryjna ma niewiele
warstw peptydoglikanu (1-3) jak w przypadku bakterii G(-) to barwny kompleks łatwo ulega wymyciu ze ściany
komórkowej. Drugi barwnik służy do dobarwienia tych gramujemnych bakterii. G(+) są więc w tej metodzie wybarwione na
fioletowo, a G(-) na różowo.

Endospory – formy przetrwalnikowe bakterii. Gatunki sporulujące:
Bacillus cereus (laseczka woskowa), B. subtilis (laseczka sienna), B. anthracis (laseczka wąglika)
B. thuringiensis („laseczka z Turyngii”), Clostridium tetani (laseczka tężcowa), C. botulinum (laseczka jadu
kiełbasianego), C. perfingens (laseczka zgorzeli gazowej), C. difficile.