33

dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanowa

OH

H

H

OH

H

H

HO

C

C

O

C

C

C

CH

2

O

O

P

lakton kwasu 6-fosfoglukonowego

glukozo-1-fosforan

OH

H

H

H

OH

H

H

HO

C

C

O

C

C

C

CH

2

OH

P

O

fruktozo-6-fosforan

C

O

C

C

C

H

H

H

OH

OH

OH

CH

2

OH

OH

2

C

P

izomeraza

heksozofosforanowa

fosfoglukomutaza

glukozo-6-fosforan

OH

OH

H

H

H

OH

H

H

HO

C

C

O

C

C

C

CH

2

O

P

ROZDZIAŁ 2. ELEMENTY ENZYMOLOGII

Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi zachodzące w przyrodzie ożywionej reakcje

chemiczne. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termody-
namicznie możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząste-
czek substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym nie wchodzi w skład końcowych
produktów reakcji i zasadniczo pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji.

Zdecydowana większość dotychczas poznanych enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich

są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w
przeważającej liczbie przypadków składają się one z części białkowej (a p oe n zy mu ) i niebiałkowej
(witamin i ich pochodnych, jonów metali oraz małocząsteczkowych związków organicznych) tzw.
gr u p p r o s t et yc zn yc h i ko e n zy mó w . Pod nazwą gr u p a p r os t et yc zn a rozumie się
różnorodne niebiałkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny) i jony metali luźno związane
z apoenzymem oraz silnie związane z częścią białkową koenzymy. K o e n zym y są witaminami lub
ich pochodnymi. Połączenie koenzymu z apoenzymem określa się mianem h o l o e n zymu . Trwałość
tego połączenia jest różna; bardzo często koenzym łatwo oddysocjowuje od apoenzymu.

A p o e n zym jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i

decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i
transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach.

Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów

nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).

2.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów

Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy

swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność
kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność
substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną
substratu, działając wyłącznie na jedną z nich – tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż
enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie
można dokonać w inny znany sposób.

Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę

ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych
reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec
wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji
(do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).

Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanu, drugą – izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza.

34

Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego

specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej
tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące
absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując
jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy
wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy
hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu
niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują
szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej
specyficzności (wysoko specyficzne).

Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków

chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w
stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub
trans, α- lub β-,

D

- lub

L

-, itp. Klasycznym

przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa,
która przekształca bursztynian do fumaranu
(odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-
1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu
etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie
powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.

Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest

α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-

D

-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w

reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-

D

-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei

subtilizyna

(serynowa

proteinaza

z

B.subtilis)

z

mieszaniny

racemicznej

estrów

N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę

L

-aminokwasu.

Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku

chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod
działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego
specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in.
monooksygenazy, które mogą selektywnie wbudowywać atom tlenu w
jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z
nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie
stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji

 lub

 oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy, z
jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii
B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują
progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji

 i  Monooksygenazy

szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku
pozycjach: 15

 i  6  oraz 11.

Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi.

Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP–1-glukozę w UDP-1-
galaktozę.

2.2. Istota katalizy enzymatycznej

Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem

międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą
przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego
enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań
kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza
produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada
się na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcję
taką można zapisać równaniem:

Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest

przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli

H

2

C COOH

H

2

C COOH

HC

CH

COOH

HOOC

bursztynian

fumaran

FAD

FADH2

dehydrogenaza
bursztynianowa

O

C H

3

Progesteron





C

O

15

11

6



E + S

ES

E + P

EP

35

E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz
L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego
czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego
nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp.

Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie

enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel*. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych)
dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej.
Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako źródło
aktywności katalitycznej enzymów:



naprężenia steryczne;



desolwatację reagentów;



optymalne nakładanie orbitali (OS);



wiązania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB);



efekty dynamiczne;



zmiany entropii w wyniku wiązania z enzymem,



oddziaływania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.

Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić

schematycznie jak na rysunku obok. Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego
wyznacza barierę energetyczną dla całej
reakcji.

Ta

bariera

dla

reakcji

enzymatycznej jest wyraźnie niższa (o ∆G

E

)

niż bariera energetyczna dla reakcji
niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszając
energię

swobodną

tworzenia

stanu

przejściowego

znacznie

przyspieszają

przekształcenie substratów w produkty.

2.2.1. Mechanizm działania enzymów

W czasie reakcji enzymatycznej

cząsteczka substratu jest wiązana w
określonym obszarze do cząsteczki enzymu
w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym–substrat. Dzięki specyficznemu
rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu
rozluźniając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca
się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy
pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy
nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd.

Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem,

polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym
enzym może zniekształcić substrat wymuszając
w nim konformację podobną do stanu
przejściowego. Przykładem może być wiązanie
glukozy z heksokinazą.

Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka

enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego
przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa
enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego.
Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka
w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w
przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie,
panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej

*

[Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns,

Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]

+

E

S

S

E

Postęp reakcji

E

ne

rg

ia

s

w

ob

od

na

stan przejściowy

∆G

E

produkty

substraty

reakcja enzymatyczna

36

dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe
jest rozluźnienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w
inne układy wiązań.

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią – dzieli się

na cztery kategorie:

1. aminokwas lub a mi n o kw a s y b e zp o ś r e d ni o dzi a ł aj ą ce ; w enzymach złożonych ich

rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,

2. a mi n o kw a s y w s po ma gaj ą ce ,
3. a mi n o kw a s y ko n t a kt ow e , zwane również w i ą żą c ymi ,
4. a mi n o kw a s y p o mo c ni c ze .
A mi n o kw a s y p o mo c ni c ze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są

do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego
(można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).

A mi n o kw a s y ko n t a kt o w e (wi ą żąc e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i

„wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach
kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów.

Rola a mi no kw a s u b e zp o ś r ed ni o d zi ał aj ącego i a mi n o kw a s ó w w s p o ma ga j ą c ych

zostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te
hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane
są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle
określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku).

Mechanizm działania centrum katalitycznego proteinaz serynowych (opis w tekście).

W centrum katalitycznym wszystkich proteinaz serynowych występuje triada aminokwasów.

Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w
łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są
histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa
karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu
przenosi się poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia się silny ładunek ujemny; w
konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie
powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony
przestrzennie węgiel wiązania peptydowego – naładowany dodatnio – to oba przeciwnie naładowane
atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w
tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do
atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum

Asp

CH

2

C

O

O

-

32

His

N

N

H

CH

2

64

Ser

221

CH

2

O

H

Asp

CH

2

C

O

OH

32

His

N

N

CH

2

H

64

Ser

221

CH

2

O-

C

NH

R

2

R

1

O 

-



+

-

Ser

221

CH

2

O

Ser

221

CH

2

O

C

R

2

O

H

2

O

OH

-

R

2

COOH

R

1

NH

2

+

-

Ser

221

CH

2

O

37

Lip

S
S

aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą
seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH

-

i też

oddzieli się od centrum aktywnego proteinazy.

2.2.2. Koenzymy i grupy prostetyczne.

W enzymach złożonych rolę aminokwasu bezpośrednio działającego pełnią koenzymy lub grupy

prostetyczne. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup
chemicznych. Biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego
substratu grupę chemiczną, w drugiej oddają ją drugiemu substratowi, odtwarzając się w pierwotnej
postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej
samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu. Trwałość połączenia
apoenzymu z koenzymami jest różna; jeśli koenzym łatwo dysocjuje, reakcje przenoszenia grup
chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje układ złożony z 2 enzymów o wspólnym
koenzymie; jeśli koenzym jest związany z enzymem trwale (pełniąc rolę grupy prostetycznej), enzym
ten katalizuje kolejno obie reakcje. Uogólniając, niebiałkowe składniki enzymów można traktować,
jako kosubstraty reakcji enzymatycznej. W tabeli 2.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy
prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej.

Tabela 2.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne

Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej

Skrót

Przenoszone grupy lub

charakterystyczna cecha

Koenzymy oksydoreduktaz
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
Fosforan dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego
Dinukleotyd flawinoadeninowy
Mononukleotyd flawinowy
Metaloflawoproteidy
Flawoproteidy transportujące elektrony
Ubichinon
Liponian
Porfiryny

Koenzymy transferaz
Adenozynometionina
Adenozynotrifosforan

Biotyna
Difosfotiamina
Fosforan pirydoksalu

Koenzym A
Koenzym B

12

Kwas foliowy

Siarczan fosfoadenilowy
Urydynodifosforan

NAD
NADP

FAD
FMN
Me-Fp
ETF
Q

-

-

ATP

-

DPT
TPP

CoASH
B

12

FH

4

PAPS
UDP

Atomy wodoru i epimeryzacja
Atomy wodoru

Atomy wodoru i koenzym oksydaz
Atomy wodoru
Transport elektronów
Transport elektronów
Transport elektronów
Atomy wodoru i grupy acylowe
Cytochromy, oksydaza cytochromowa
koenzym katalazy i peroksydaz

Grupy metylowe
Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i
AMP
CO

2

(koenzym karboksylaz)

Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja
Przemiany aminokwasów (w tym
deaminacja)
Grupy acylowe
Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie
grupy -COOH
Grupy formylowe, hydroksymetylowe,
formimidowe
Reszta kwasu siarkowego
Grupy glikozylowe

38

Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz
Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających

lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD

+

)

lub jego fosforan - NADP

+

. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te są dinukleotydami

zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego
fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid
kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną
pirydyny i jest jedną z witamin z grupy B o nazwie witamina PP.

Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego

oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w
wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne
zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.

Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD

+

, a

jego forma zredukowana NADH + H

+

. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne

zapisy NAD (zamiast NAD

+

) i NADH

2

(zamiast NADH+H

+

).

Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie

obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd
dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej
komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora).
W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są
przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraźne. Np. dehydrogenaza
alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd
rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami:

Zredukowane formy NADH

2

– wyjątkowo również NADPH

2

- w żywych komórkach

regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH

2

może też regenerować się w

reakcjach, w których staje się donorem wodoru
(w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z
pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.).
Większość

reakcji

katalizowana

przez

dehydrogenazy

sprzężone

z

NAD

jest

odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę
nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego
wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6).
Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza
bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1).

Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju

apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami

N

C

O
NH

2

amid kwasu

nikotynowego

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)

i jego fosforan (NADP)

P

P

+

N

CONH

2

HO

OH

CH

2

O

O

O

OH

OH

OH

2

C

(

P

)

N

N

N

N

NH

2

N

Ryb

CONH

2

H

H

P

P

Aden

N

CONH

2

Ryb

P

P

Aden

+

+

H

+

XH

2

X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH

2

przez NAD

NAD

NADH + H+

NADPH

2

+ NAD

NADP + NADH

2

transdehydrogenaza

EC 1.6.1.1

NADH+H

+

NAD

reduktaza fumaranowa

H

2

C COOH

H

2

C COOH

kwas bursztnowy

HC

CH

COOH

HOOC

kwas fumarowy

(EC 1.3.1.6)

39

H

ryboflawina

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

CH

2

O

O

CHOH
CHOH
CHOH
CH

2

O

Lip

S
S

szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również
aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej.

Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony

metali Mg

2+

, Zn

2+

, Mn

2+

. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg

2+

lub

Zn

2+

odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu

alkoholanowego.

Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego „właściwego” działania, czyli

utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego d e k a r b o k s y l a c j i . Takiej dekarboksylacji ulegają
tylko α-ketokwasy lub α-hydroksykwasy. Utlenianie α-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się
α - o k s y d a c j ą i katalizowane jest przez u k ł a d y w i e l o e n z y m a t y c z n e (sprzężone z ,DPT, FAD,
CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez
d e h y d r o g e n a z ę p i r o g r o n i a n o w ą ( d e k a r b o k s y l u j ą c ą ) , o czym będzie mowa dalej. Natomiast
przykładem dekarboksylacji α-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz
jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD
lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących:
EC 1.1.1.37 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do

szczawiooctanu,

EC 1.1.1.38 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z

NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność
dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.39 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NAD, podczas

utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji
szczawiooctanu,

EC 1.1.1.40 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z

NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność
dekarboksylacji szczawiooctanu.

Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi r yb of l a wi na . Związek ten

zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu,
pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B

2

.

Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje

zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się,
zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w
drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.

Fosforan ryboflawiny – m o n o nu kl e ot yd f l a wi no w y – zapisuje się symbolicznie FMN, a

jego połączenie z nukleotydem adeninowym – d i nukl e ot yd f l a w i n o ad en i n o w y – oznacza się
skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami
enzymatycznymi, tworząc f l a w o pr ot e i d y , będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych.

FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru.

Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą
atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH

2

-CH

2

-→ -CH=CH-. Przykładem może być

wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

O

OH

OH

N

N

N

N

NH

2

OH

2

C

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

CH

2

O

O

CHOH
CHOH
CHOH
CH

2

O

P

P

40

ubichinon (Q)

O

O

H

3

C

H

3

C

CH

3

)

(

n H

symbolicznie zapisuje się FADH

2

. Podobnie jak zredukowany NADH

2

, zredukowany FADH

2

w

komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym.

Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność

bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen – uaktywnianie
cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta
przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego
enzymu może być o ks yd a za a mi n o w a
za w i er aj ąc a F A D (EC 1.4.3.4). Reakcję taką
symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias
dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po
zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD
lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa się je kofaktorami reakcji utlenienia.

FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego c yt o chrom u

P 450. Zredukowany FADH

2

może z kolei być donorem wodoru dla oks ygenaz z

podpodklasy EC 1.14.14.

Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub

FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe

2+

, Zn

2+

lub Mo

2+

, które

współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu
nazywa się metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp.
Transportują one przede wszystkim elektrony.

Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany

też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam
witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). Łańcych boczny
zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od źródła
pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się
symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach
drobnoustrojowych waha się od 5 do 13.

Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji

pierścienia chinonowego.

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

O

O

R

Fe

2+

metaloflawoproteid

H

2

O

oksydaza

O

2

(FAD)

+

+ H

2

O

2

CH

2

NH

2

R

C

O

H

R

NH

3

aminowa

przez FAD

XH

2

X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH

2

FAD

FADH2

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

O

O

rybitol

P

P

Aden

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

O

O

rybitol

H

H

P

P

Aden

Q

O

O

H

3

C

H

3

C

R

CH

3

QH2

H

3

C

H

3

C

R

CH

3

OH

OH

XH

2

X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH

2

przez ubichinon

41

Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bądź reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z

nielicznych przykładów może być d e h yd r o ge n a za N A D H ( u bi c hi no n o wa ) –EC 1.6.5.3, która
katalizuje reakcję utlenienia NADH

2

do NAD z jednoczesną redukcją ubichinonu do ubichinolu.

Ciekawym enzymem jest d e h yd r o ge n a za me t ano l o wa (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych
metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ).

Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym

ł ań c uc ha o dd ec h o w e go .

Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze

sobą mostkami metinowymi (=CH–). Przy atomach węgla β (3 i 4) pierścieni pirolowych zamiast
atomów wodoru występują różne grupy
chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i
inne). W celu ujednolicenia zapisu związków
tego typu Fisher zaproponował symboliczny,
uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki
metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczano
kodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano
cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w
pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe
literami alfabetu łacińskiego od α do δ, jak to
przedstawiono na rysunku obok.

Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi

podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w
naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy
IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i
nazwany jest on przez Fishera pr ot op or f i r yn ą IX . Izomer ten jest prekursorem me t a l o po r f i r yn
wchodzących w skład he m o p r o t e i n i c hl or of i l i .

M e t a l o p o r f i r y n y to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi)

centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych.
Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w
h e mo p r ot ei na ch . Metaloporfiryny z wbudowanym Mg

2+

są składnikami c h l or of i l u .

H e m o p r o t e i n y to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę.

H e m to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe

2+

) z protoporfiryną IX.

Hem jest barwną grupą prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierząt,
hemoglobina – czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO

2

a także jonów

wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu.

H e m i n y to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia

(Fe

3+

). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu

oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi katalaz i peroksydaz,
katalizując procesy utleniania. Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta
służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi.

HC

N

CH

N

N

HC

CH

N

porfiryna

I

II

III

IV

1

2

5

7

6

8

4









H

H

3

3

I

II

IV

III

1

2

4

5

6

7

8

symboliczny, uproszczony

zapis wzoru porfiryny

M =

P =

V =

CH

3

CH=CH

2

CH

2

CH

2

COOH

I

II

IV

III

V

M

M

M

M

V

P

P

I

II

IV

III

V

M

M

M

M

V

P

P

Fe

2+

Fe

2+

protoporfiryna IX

hem

ferrochelataza

EC 4.99.1.1

enzymatyczna transformacja protoporfiryny IX w hem

42

fragment łańc

ń

ucha polipeptydowego

cytochromu c

His

Liz

S

S
Cys Ser

Cys

Glu(NH

2

)

miejsce przyłączenia heminy

N

CH

3

HC

CH

N

CH

3

N

CH

2

CH

2

HOOC

H

3

C

Fe

+3

CH

3

HOOC CH

2

CH

2

HC

CH

N

CH

2

H

2

C

CH

2

CH

2

hemina

cytochrom c

C y t o c h r o m y to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza

grupy heminowej (z Fe

2+

na Fe

3+

) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym

w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim
miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz
podgrupy (np. cytochromy a

3

). Kompleks hemoprotein a + a

3

jest enzymem znanym jako o ks yd a za

c yt o ch r o mo w a .

O k s y d a z a c y t o c h r o m u c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a

3

,

składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych
oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego;
aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony.

C h l o r o f i l e , pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących

roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu
zwanego chloroplastyną. Są to metaloporfiryny, zawierające wbudowany w centrum jon magnezu
(Mg

2+

). Połączone są wiązaniem estrowym z

fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U
wszystkich roślin wyższych i glonów
występuje chlorofil a (niebieskozielony, co
najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 -
liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy
której występuje maksimum absorpcji światła).
Chlorofil b - żółtozielony, występujący u
roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil
c — występuje w małych ilościach w
czerwono zabarwionych roślinach wodnych
(m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach,
niektórych

okrzemkach

i

wiciowcach.

Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów.
Chlorofil a absorbuje głównie światło
fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie
i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II.

Kwas liponowy (tiooktanowy). Związek ten uczestniczy w transporcie elektronów, a także w

przenoszeniu grup acylowych w reakcjach α-oksydacji (oksydacyjnej dekarboksylacji α-ketokwasów).
Jest elementem składowym układów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w
dehydrogenazie pirogronianowej (dekarboksylującej). Jest to kwas 6,8-ditiolooktanowym. Łatwo
ulega odwracalnemu utleenieniu i redukcji.

C

20

H

39

OOC

CH

3

fityl

chlorofil a

N

CH

3

H

C

CH

N

CH

3

N

HC

CH

N

CH

3

CH

CH

3

CH

2

CH

2

C

2

H

5

CH

2

CH

OOC

C

O

H

Mg

2+

43

C

Enzym-NH

CH

2

CH

2

CH

2

CH

2

CH

CH

2

S

CH

2

S

O

liponian

Lip

S
S

Lip

S
S H

~

C

O

CH

3

DPT

enzym

DPT CH

CH

3

OH

enzym

Lip

S
S

H

H

FAD

FADH2

CoASH

CH

3

C

O

~

SCoA

O

OH

OH

N

N

N

N

NH

2

CH

2

S

CH

2

CH

2

CHNH

2

COOH

CH

3

+

adenozynometionina

H

H

kwas tetrawodorofoliowy (H

4

folian)

1

2

3

4

5 6

7

8

9

10

COOH

CH

2

CH

2

COOH
CH

O

NH

NH

C

CH

2

H

2

N

OH

N

N

N

N

Jak już wspomniano, liponian jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych,

jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe.

Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz
Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę –CH

3

.

Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw. „aktywny metyl”). I dlatego, w formie
jonu CH

3

+

, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne

(najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach
anabolicznych, metylując m.in. grupę aminową (np. w biosyntezie choliny).

Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pterydyny, heterocyklicznego dipierścieniowego

związku, do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu
p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu
glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do
pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka
dostarczany jest przez bakterie jelitowe.

Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H

4

folian) -

jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:

 CH

3

–

 HOCH

2

–

 –CH

2

–

 –CH=
 HOC–
 HN=CH–

Miejscem przyłączenia grup C

1

są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast źródłem

ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.

Lip

S
S

XH

2

X

Lip

S
S

H

H

liponian

uteniony

liponian

zredukowany

44

Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy

-COO

-

do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP, który transformuje

do aż AMP.

Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany

psychomotoryczne: depresję, brak łaknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.

Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże

koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3’-fosforanu–5’-
pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem
peptydowym z cystoaminą. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy
jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasłowego i β-alaniny. Symbolicznie koenzym A
zapisuje się jako CoASH.

Kwas pantotenowy jest witaminą B

5

. Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i

tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran,
zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w
wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w
organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym źródłem tego związku są drożdże,
grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka,
mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły,
ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę podczas aktywacji i

przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH
do kwasu karboksylowego katalizują syntetazy, które do swego
działania wymagają dostarczenia energii, której źródłem jest
ATP.

Powstałe

wiązanie

tioestrowe

jest

wiązaniem

wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych
tyldą

„~”

). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez

syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego

połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie
grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem.
Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę
zapisuje się jako DPT.

HN

NH

O

S

C
O

NH-Enzym

biotyna

HN

NH

O

S

R

biotyna

NH

O

N

R

S

HOOC

ATP

AMP+PP

CO

2

karboksylaza

karboksybiotyna

adenozyno-3'-fosforan-5`-pirofosforan

koenzym A (CoA-SH)

P

O CH

2

C

CH

3

CH

3

CH

OH

C

O

NH CH

2

CH

2

C

O

NH CH

2

CH

2

SH

P

O

OH

CH

2

O

N

N

N

N

NH

2

P

cysteoamina

kwas pantotenowy

ATP

AMP+PP

syntetaza

X-CoA

CoASH

X COOH

~

SCoA

X C

O

45

N

N

H

3

C

NH

2

CH

2

N

S

CH

2

CH

3

CH

2

O

P

P

+

difosfotiamina (DPT)

Tiamina jest w i t a m i n ą B

1

. Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu

nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet
depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn),
zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak
apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B

1

może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się

bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraźną niewydolnością układu krążenia. Etanol
powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej
do organizmu. Ź r ó d ł e m t e j w i t a m i n y są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby,
owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.

Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i

semialdehyd bursztynowy.

Jako grupa prostetyczna k e t o l a z , DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo-

5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan.

Jako e l e m e n t u k ł a d ó w w i e l o e n z y m a t y c z n y c h - podczas α-oksydacji - np.

pirogronianu lub α-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako
dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-transportująca) – EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylację
pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (bursztynian-
transporująca) – EC 1.2.4.2, dekarboksyluje α-ketoglutaran do semialdehydu bursztynianowego, które
dalej przenosi na kwas liponowy.

Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych związków: pirydoksyny, pirydoksalu i

pirydoksaminy. Są one pochodnymi pirydyny.

DPT

N

S

CH

2

CH

3

R

H

CH

2

O

+

PP

Enzym

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

P

CH OH
CH

2

O

C

O

H

transketolaza

ksylulozo-5-fosforan

CH

2

OH

C O
CH

HO

CH OH
CH

2

O

P

N

S

CH

2

CH

3

R

CH

2

O

+

PP

Enzym

~

C

H

HO

CH

2

OH

aktywny aldehyd glikolowy

~

DPT

N

H

3

C

HO

CH

2

OH

CH

2

OH

N

H

3

C

HO

CH

2

OH

CH

2

NH

2

N

H

3

C

HO

CH

2

OH

C

O

H

pirydoksyna

pirydoksamina

pirydoksal

DPT

N

S

CH

2

CH

3

R

H

CH

2

O

+

PP

Enzym

~

DPT

CH

3

C O
COOH

pirogronian

hydroksyetylo

CO

2

fragment dehydrogenazy

pirogronianowej

(dekarboksylującej)

N

S

CH

2

CH

3

R

CH

2

O

+

PP

Enzym

~

C

OH

H

CH

3

46

5 - F o s f o r a n p i r y d o ks a l u (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50

enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z
aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na α-ketokwasy i odwrotnie. Jest
koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid
kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące
reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym
metabolizm aminokwasów.

Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminą B

6

. Wszystkie trzy związki

ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy
B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez
matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do
najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka
i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia,
bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B

6

wytwarzana jest

przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.

Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie

z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu
noszą nazwę ko b al a mi ny. Zamiast jonu CN

-

, z kobalaminą może być połączony inny anion, np.

hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku związek nosi nazwę
nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus.

Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.

Witamina B

12

, znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik

przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, związane z anemią
złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i
zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć u niektórych
mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę
witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba.
Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu
pokarmowego. Źródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do
zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego
człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane
przez normalną dietę.

Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają

przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są
koenzymami, a właściwie poprawniej definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji
katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków bogatych w energię chemiczną;
tzw. związków makroergicznych lub inaczej związków wysokoenergetycznych. Wśród nich
najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa a de n o zyn o t r i f os f or a n – ATP. Jest
on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7.,

H

+

CN

P

N

N

CH

3

CH

3

O

OH

O

HOH

2

C

CH

3

CH

CH

2

NH

CO

CH

2

Co

H

3

C

H

2

NOH

2

C

H

2

NOH

2

CH

2

C

H

2

NOH

2

C

CH

2

CH

3

CH

2

CH

2

CONH

2

CH

3

CH

3

CH

3

CH

2

CH

2

CONH

2

CH

2

CONH

2

H

3

C

CH

3

CH

3

N

CH

N

C

N

C

N

cyjanokobalamina

47

O

OH

CH

2

O

O

P O

OH

N

N

N

N

NH

2

H

adenozyna

AMP

ADP

ATP



O



P O

OH

P

OH

OH

O

O

przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz
(enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.).

T e r m o d y n a m i k a r e a kc j i e n z y m a t y c z n y c h . Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje

endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego
typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii
swobodnej ΔG była równa zero lub ujemna.
Przykładowo reakcja glukozy z kwasem
fosforowym jest reakcją endoergiczną; zmiana
energii swobodnej ΔG = 12 kJ/mol. Stąd
równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta
na

lewą

stronę;

glukozo-6-fosforan

praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy
ATP do ADP + P

i

* jest z kolei silnie egzoergiczna; ΔG = −29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości

ΔG jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych
reakcji suma energii swobodnej ΔG = −17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta
jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P.

W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy –OH rybozy

zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi ΔG = −14 kJ/mol.
Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym.
Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi:

Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną.

Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że
dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu związku do
makroergicznych jest ΔG zbliżone do −29 kJ/mol.

W tabeli 2.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy

kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+P

i

wynosi ΔG = −29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem
należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków
wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla
związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o ΔG >−29 kJ/mol. Z tego samego
powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się
na tej liście powyżej, o ΔG <−29 kJ/mol.

* umownie P

i

oznacza fosforan nieorganiczny

ATP

G= -29 kJ/mol

ADP + P

i

,

G= -28 kJ/mol

ADP

AMP + P

i

glukoza

G= -17 kJ/mol

ATP

ADP + P

i

glukozo-6- P

G= -29 kJ/mol

ATP

ADP

glukoza + H

3

PO

4

glukozo-6- P

-H

2

O

+H

2

O

G= 12 kJ/mol

48

Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana

reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż
rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji.

Tabela 2.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów

Nazwa związku

ΔG [kJ/mol]

1

Fosfoenolopirogronian
Karbamoilofosforan
1,3-difosfoglicerynian
Fosfokreatyna
Acetylo~SCoA

−62
−51
−49
−43
−34

ATP

AMP+PP

ATP

ADP+P

ADP

AMP+P

PP (pirofosforan)

−31
−29
−28
−27

Glukozo-1-fosforan
AMP
Glukozo-6-fosforan

−21
−14
−14

1

cytowane dane są przybliżonymi wartościami ΔG

ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiązania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowa-

dzące do powstania ADP, powoduje utratę jednego z nich (ΔG =−29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od
ADP prowadzi do powstania AMP (ΔG =−28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia
swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o ΔG =−57 kJ/mol*. Ale od
ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana
energii swobodnej ΔG takiej przemiany równa jest −31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak
uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie
(ΔG =−27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje ΔG =−58 kJ/mol*. Ta
swobodna energia zawarta w PP

i

jest uwalniana podczas jego

enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1).

W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu

specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3)
przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na
AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak
to przedstawiono na rysunku obok.

Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach

enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg

2+

. Stąd jony Mg

2+

są aktywatorami enzymów

współdziałających z ATP.

Reasumując, r o l a A T P j a k o k o s u b s t r a t u w reakcjach enzymatycznych jest następująca:

1. ATP jako d o n o r e n e r g i i s w o b o d n e j w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W

większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PP

i

. Jak już wspomniano,

ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna ΔG =−58 kJ/mol, co
wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków
wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez
syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

*

Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP

oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości ΔG.

PP

i

2P

i

pirofosfataza

nieorganiczna

ATP + AMP

2 ADP

kinaza

adenylanowa

49

NADH

ADP

ATP

NADPH

kinaza NADH

metionina + ATP

adenozynotransferaza

metioninowa

EC 2.5.1.6

PP + P

adenozynometionina

ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym
niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się
jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład
podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworząca) – EC 6.2.1.13. Wybrano ją celowo,
gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego „punktu
widzenia” komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA.

2. ATP jako d o n o r o r t o f o s f o r a n u . Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszą rodnik

fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy,
glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z
NADH katalizowana przez kinazę NADH (EC 2.7.1.86).

Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach
źródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem
energia swobodna jego hydrolizy ΔG =−27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa
(pirofosforanowa) – EC 2.7.2.12, katalizująca przeniesienie fosforanu z PP

i

na kwas octowy z

wytworzeniem acetylofosforanu.

3. ATP jako d o n o r p i r o f o s f o r a n u . W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie

do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcję katalizują
pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza
difosfotiaminy

z

tiaminy.

Reakcję

katalizuje

pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2).

4. ATP jako d o n o r r o d n i ka a d e n yl i l o w e g o . Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika

adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PP

i

. Reakcja ta ma

podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej
budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy
(zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN
katalizowana przez adenylilotransferazę FMN (EC 2.7.7.2).

Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe
rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla
procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest
przez urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanową (EC 2.7.7.9).

5. ATP jako d o n o r a d e n o z y n y . W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się

donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten
powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazę metioninową
(EC 2.5.1.6).

Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z

nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano.
Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) są koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA

ATP

AMP+PP

syntetaza

acetylo-CoA

CoASH

~

SCoA

C

O

CH

3

CH

3

COOH

ATP

ADP+P

CoASH

~

SCoA

C

O

CH

3

CH

3

COOH

syntetaza

acetylo-CoA

(ADP-tworzaca)

FMN

ATP

PP

i

FAD

adenylilotransferaza FMN

tiamina

ATP

AMP

pirofosfokinaza

tiaminowa

difosfotiamina

glukozo-1- P

UTP

PP

i

urydylilotransferaza

glukozo-1-fosforanowa

UDPG

50

(patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod
postacią cytydylodifosfocholiny.

Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleotydotrifosforanami występuje zależność:

2.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

S z y b k o ś ć r e a k c j i e n z y m a t y c z n e j , podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się

ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów:

dt

P

d

dt

S

d

v

]

[

]

[







(2.1)

R ó w n o w a g a r e a k c j i e n z y m a t y c z n y c h . Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne

(również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga
pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania
produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v

1

jest

proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-

1

jest

proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi:

2

1

v

v



]

[

]

[

1

1

B

A

k

v









]

[

1

1

AB

k

v









(2.2)

gdzie: A,B – substraty; AB – produkt; k

+1

, k

-1

– stałe szybkości reakcji

Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz

ze wzrostem temperatury reakcji.

Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów

spełniają zależność:

K

B

A

AB

k

k









]

[

]

[

]

[

1

1

gdzie: K jest stałą równowagi konkretnej reakcji.

(2.3)

Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji

bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest
stała równowagi reakcji K.

Jeszcze raz należy wyraźnie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości

stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1
to reakcja jest spontaniczna.

Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie

równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami
energii swobodnej ∆G a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:

K

ln

-RT

G







gdzie: R - stała gazowa, T – temperatura bezwzględna

(2.4)

Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa

stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów
i produktów. I odwrotnie: im większe ∆G, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść
produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość ∆G jest bardzo duża cały substrat ulega
przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna.

Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G (w chemii fizycznej znanej pod słuszną

nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:

S

T

H

G











(2.5)

S z y b k o ś ć p o c zą t k o w a r e a k c j i e n z y m a t y c z n e j .

Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed
powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał
zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji
enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu.

nukleozydotrifosforan + ADP

kinaza

nukleozydodifosforanowa

nukleozydodifosforan + ATP

EC 2.7.4.6

S

P

enzym

A + B

AB

v

+1

, k

+1

v

-1

, k

-1

V

[E]

Wpływ stężenia enzymu [E] na
szybkość reakcji enzymatycznej V

[S]>>[E]

51

m

K

[S]

2

max

V

max

V

V

Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na
pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim
układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego.

A k t y w n o ś ć e n z y m a t y c z n a . Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub

molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu
homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego
aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat
enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest
ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu.
Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.

Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano ka t al e m (Kat). 1 Kat to taka ilość

enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30

C.

Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię

Biochemiczną, nazwana została m i ę d z y n a r o d o w ą j e d n o s t ką e n z y m a t y c z n ą (w skrócie
m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty
w temperaturze 30

C.

Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego

zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z
odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów
a nawet grup enzymów.

Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swoją

koncepcję katalizy enzymatycznej. Model Michaelisa–Menten opiera się na założeniu powstawania
przejściowego kompleksu enzymu-substrat:

(2.6)

Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom

enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do
stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji
będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość
reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres.

Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych

enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną V

max

. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie

przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy
od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (2.6) wynika, że w stanie
równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu:

1

2

2

1











v

v

v

v

(2.7)

]

[

]

[

1

1

S

E

k

v









]

[

1

1

ES

k

v









]

[

2

2

ES

k

v







]

[

]

[

2

1

P

E

k

v











(2.8)

Po podstawieniu zależności (2.8) do równania (2.7) i po prostych matematycznych

przekształceniach otrzymuje się:

E + S

ES

E + P

k

-1

k

1

k

2

k

-2

52

[S]

v

V

max

K

m2

K

m1

S

1

S

2

V

max



1
v

-1
K

m

1
[S]

tgα = K

m

/V

max

2

1

2

2

1

1

]

[

]

[

]

[

]

[

























k

k

P

k

k

k

S

k

E

ES

(2.9)

Uwzględniając fakt, że na początku reakcji [P]

 0 oraz po dalszych prostych przekształceniach

równania (2.9), otrzymuje się:

m

K















1

2

1

]

[

]

[

]

[

k

k

k

ES

S

E

(2.10)

Wielkość K

m

nosi nazwę s t a ł e j M i c h a e l i s a . J est ona charakterystyczna dla danego układu

enzym-substrat. Łatwo zauważyć, że im mniejsza wartość K

m

, tym większe stężenie kompleksu

przejściowego [ES].

Analizując równania (2.6)

 (2.10) należy zauważyć, że

1. stężenie enzymu [E] w równaniu (2.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w

danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym
etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E

0

] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana

w ES. Stąd [E]= [E

0

]-[ES].

2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak

naprawdę od szybkości rozpadu kompleksu ES, czyli od v

+2

. Stąd: v = v

+2

=k

+2



[ES].

3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E

0

]=[ES] szybkość reakcji

enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość V

max

.

Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (2.10) otrzymuje się r ó w n a n i e

m a t e m a t y c z n e M i c h a e l i s a - M e n t e n :

]

[

]

[

max

S

K

S

V

v

m







(2.11)

Równanie (2.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa K

m

:

gdy: v= 1/2

V

max

to

K

m

= [S]

Stała Michaelisa K

m

jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji

enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej V

max

.

Łatwo wykazać, że:

1. Jeśli [S]<<K

m

(czyli przy małych stężeniach substratu), to reakcja jest I rzędu: v= f([S]),

2. Jeśli [S]=K

m

, to v=1/2

V

max

3. Jeśli [S]>>K

m

, to reakcja jest 0 rzędu i v=V

max

.

Odwrotność stałej Michaelisa 1/K

m

nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu.

Im mniejsza stała Michaelisa K

m

, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje

poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S

1

i S

2

– przyjęto identyczne szybkości maksymalne

reakcji V

max

. K

m2

>K

m1

, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S

1

aniżeli do S

2

. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S

1

aniżeli S

2

.

Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji

Wykres Lineweavera-Burka

enzymatycznej

Stałe Michaelisa K

m

dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od

10

–2

mola/dm

3

do 10

–7

mola/ dm

3

.

Stałą K

m

można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..

53

max

max

1

]

[

1

1

V

S

V

K

v

m







Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znaleźć więcej danych

odnośnie tematu.

2.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów

Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych

nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W późniejszym okresie nazwę enzymu wywodzono od
typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano
końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.).

Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie

s y s t e m a t y c z n y c h n a zw e n z y m ó w , składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest
utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza,
itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w
reakcji. Np.:

maltohydrolaza 1,4-α-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo β-amylazą) - EC 3.2.1.2,
oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazą alkoholową) - EC 1.1.1.1.
Nazwy systematyczne enzymów są długie i niekiedy bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich

stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły
nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne
jest stosowanie nazw zwyczajowych. Ostatnio (po 2000 roku) pojawiła się koncepcja wprowadzenia
tzw. nazw oficjalnych enzymów wywodzących się od nazw zwyczajowych. I tak np. nazwa α-amylaza
jest w świetle tej koncepcji nazwą oficjalną enzymu sklasyfikowanego pod numerem EC 3.2.1.1.

Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza,

maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania.
Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np.
tyrozynaza. Nazwa „tyrozynaza” dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną.

W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i

zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim.

Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system

klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z
czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC
1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć
nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich
specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono
na sześć głównych klas:



EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące reakcje odłączania lub przyłączania atomów

wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów.



EC.2. Transferazy - enzymy przenoszące grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty cząsteczek itp.



EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujące reakcje hydrolizy.



EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywające wiązania.



EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujące przemiany wewnątrzcząsteczkowe (racemizacja,

izomeryzacja, przenoszenie grup itp.).



EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujące, katalizujące tworzenie wiązań.

Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon

numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na
przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących
wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru
klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa
grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz -
typ hydrolizowanego wiązania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter
przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.

54

Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature

Database) można znaleźć pod adresem

http://www.expasy.org/enzyme/

. Na następnej stronie

przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej – EC 1.1.1.1.

55

Wzór strony E xP A S y dla EC 1.1.1.1 – dehydrogenaza alkoholowa.

Official Name

Alcohol dehydrogenase.

Alternative Name(s)

Aldehyde reductase.

Reaction catalysed

An alcohol

+

NAD(+)

<=>

an aldehyde or ketone

+

NADH

Cofactor(s)

Zinc or Iron.

Comment(s)



Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals.



The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols.

Cross-references

Biochemical
Pathways; map
number(s)

D8

;

E6

;

J10

PROSITE

PDOC00058

;

PDOC00059

;

PDOC00060

BRENDA

1.1.1.1

PUMA2

1.1.1.1

PRIAM enzyme-
specific profiles

1.1.1.1

Kyoto University
LIGAND chemical
database

1.1.1.1

IUBMB Enzyme
Nomenclature

1.1.1.1

IntEnz

1.1.1.1

MEDLINE

Find literature relating to 1.1.1.1

Swiss-Prot

P80222

, ADH1_ALLMI;

P49645

, ADH1_APTAU;

P06525

, ADH1_ARATH;

P41747

, ADH1_ASPFL;

P12311

, ADH1_BACST;

Q17334

, ADH1_CAEEL;

P43067

, ADH1_CANAL;

P48814

, ADH1_CERCA;

P23991

, ADH1_CHICK;

P23236

, ADH1_DROHY;

P48586

, ADH1_DROMN;

P09370

, ADH1_DROMO;

P22246

, ADH1_DROMT;

P07161

, ADH1_DROMU;

P12854

, ADH1_DRONA;

P08843

, ADH1_EMENI;

P05336

, ADH1_HORVU;

P20369

, ADH1_KLULA;

Q07288

, ADH1_KLUMA;

P00333

, ADH1_MAIZE;

P80512

, ADH1_NAJNA;

Q9P6C8

, ADH1_NEUCR;

P20306

, ADH1_ORYSA;

P12886

, ADH1_PEA;

P14219

, ADH1_PENAM;

P25141

, ADH1_PETHY;

O00097

, ADH1_PICST;

Q03505

, ADH1_RABIT;

P22797

, ADH1_RANPE;

P14673

, ADH1_SOLTU;

P80338

, ADH1_STRCA;

P13603

, ADH1_TRIRP;

P00330

, ADH1_YEAST;

Q07264

, ADH1_ZEALU;

P20368

, ADH1_ZYMMO;

P42327

, ADH2_BACST;

O45687

, ADH2_CAEEL;

O94038

, ADH2_CANAL;

P48815

, ADH2_CERCA;

P27581

, ADH2_DROAR;

P25720

, ADH2_DROBU;

P23237

, ADH2_DROHY;

P48587

, ADH2_DROMN;

P09369

, ADH2_DROMO;

P07160

, ADH2_DROMU;

P24267

, ADH2_DROWH;

P37686

, ADH2_ECOLI;

P54202

, ADH2_EMENI;

Q24803

, ADH2_ENTHI;

P10847

, ADH2_HORVU;

P49383

, ADH2_KLULA;

Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach.
Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na

jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo
występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy – enzymy

56

wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o
„oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym
wybudowaniem atomów tlenu”.

Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej

klasie enzymów.

EC 1. Oksydoreduktazy

EC 1.1. działające na grupę –CH

2

-OH jako donor

EC 1.2. działające na grupę –CHO lub >C=O jako donor
EC 1.3. odrywające atomy wodoru od –CH

2

-CH

2

, prowadząc do –CH=CH

EC 1.4. działające na grupę –CH

2

-NH

2

jako donor

EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor
EC 1.6. działające na NADH lub NADPH
EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory
EC 1.8. działające na związki siarki jako donory
EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor
EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory
EC 1.11. działające na H

2

O

2

jako akceptor

peroksydazy

Są to p e r o k s y d a z y . W tej podklasie brak jest pod-podklas, stąd ich numer zaczyna się od
EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do k a t a l a z y .

EC 1.12. działające na wodór jako donor
EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagają

dodatkowego donoru wodoru

EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowują dwa atomy tlenu
EC 1.13.12. monooksygenazy – wbudowują jeden atom tlenu

EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagają

dodatkowego donoru wodoru

Schematycznie, reakcje katalizowane przez te enzymy można przedstawić następująco:

EC 1.14.11. dioksygenazy, DH

2

= 2-ketoglutran

EC 1.14.12. dioksygenazy, DH

2

= NADH

EC 1.14.13. monooksygenazy, DH

2

= NADH

EC 1.14.14. monooksygenazy, DH

2

= FADH

2

lub zredukowany FMN

EC 1.14.15. monooksygenazy, DH

2

= zredukowane żelazowo-siarkowe białka

EC 1.14.16. – EC 1.14.20. monooksygenazy, DH

2

= inne zredukowane związki

EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory
EC 1.16. utleniające jony metali
EC 1.17. działające na grupy =CH

 lub –CH

2

 jako donory

EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory
EC 1.19. – EC 1.21. działające na inne związki jako donory
EC 1.97. inne oksydoreduktazy

W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub

akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z
klasy oksydoreduktaz.

EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP,

dehydrogenazy i reduktazy

EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy
EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy,

oksydazy

Oksydazy są flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bądź hemoproteidami. Znane są
dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają
nadtlenek wodoru.

XH

X-OH

O

2

DH

2

D

H

2

O

mechanizm działania

monooksygenazy z podklasy EC 1.14.

XH

2

O

2

DH

2

D

mechanizm działania

dioksygenazy z podklasy EC 1.14.

X

OH

OH

XH

2

O

2

H

2

O

(koenzym)

X

1/2

oksydazy typu I

XH

2

O

2

(koenzym)

X

oksydazy typu II

H

2

O

2

57

Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II
oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4).

EC 1.x.4. akceptorem są związki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujące)
EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon

dehydrogenazy

EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka
EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD)

dehydrogenazy

Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę

funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla o jaki rodnik
chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy.

EC 2. Transferazy

EC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C

1

)

EC 2.1.1. metylotransferazy (

CH

3

)

EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (

CH

2

OH, CHO)

EC 2.1.3. karboksy

 i karbamoilotransferazy

EC 2.1.4. amidynotransferza (

CONH

2

)

EC 2.2. transportujące grupy aldehydowe lub ketonowe
EC 2.3. Acylotransferazy

EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe
EC 2.3.2. aminoacylotransferazy
EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu

EC 2.4. glikozylotransferazy

EC 2.4.1. heksozylotransferazy
EC 2.4.2. pentozylotransferazy
EC 2.4.99 transportujące inne glikozylowe grupy

EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupy
EC 2.6. transportujące grupy z azotem

EC 2.6.1. Transaminazy

aminotransferazy

EC 2.6.2. Oksymotransferazy
EC 2.6.99. transportujące inne grupy z azotem

EC 2.7. transportujące grupy zawierające fosfor

EC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem

kinazy

EC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem

kinazy

EC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupą z azotem jako akceptorem

kinazy

EC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupą fosforową jako akceptorem

kinazy

EC 2.7.6. Difosfotransferazy

difosfokinazy

EC 2.7.7. Nukleotydilotransferazy
EC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowych
EC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów

dikinazy

EC 2.8. transportujące grupy zawierające siarkę

EC 2.8.1. Siarkotransferazy
EC 2.8.2. Siarczanotransferazy
EC 2.8.3. CoA-transferazy
EC 2.8.4. transportujące grupy tioalkylowe

EC 2.8. transportujące grupy zawierające selen

Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju

wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ hydrolizowanego
wiązania.

EC 3.Hydrolazy

EC 3.1. działające na wiązanie estrowe

EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych

esterazy, lipazy i laktonazy

EC 3.1.2. Hydrolazy tioestrów
EC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych

fosfatazy i nukleotydazy

EC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych

fosfolipazy i fosfodiesterazy

EC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowych
EC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowego
EC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych

difosfatazy

EC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowych
EC 3.1.11.

3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy

EC 3.2. Glikozylazy

58

EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujące O- i S-glikozyle
EC 3.2.2. hydrolizujące związki N-glikozylowe

EC 3.3. działające na wiązanie eterowe

EC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianowe
EC 3.3.2. Hydrolazy eterowe

EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe

hydrolazy peptydowe

EC 3.4.11. Aminopeptydazy
EC 3.4.13. Dipeptydazy
EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy
EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy
EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typu
EC 3.4.17 Metalokarboksypeptydazy
EC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typu
EC 3.4.19 Omega peptydazy
EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe
EC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinowe
EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe
EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy
EC 3.4.25. Endopeptydazy treoninowe
EC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania

EC 3.5. działające na wiązanie C

N, inne niż peptydowe

EC 3.5.1. w linearnych amidach

m.in. amidazy i deacylazy

EC 3.5.2. w cyklicznych amidach
EC 3.5.3. w linearnych amidynach
EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach

EC 3.6. działające na bezwodniki kwasowe

EC 3.6.1. w związkach zawierających fosforanowe bezwodniki

m.in. difosfatazy

EC 3.6.2. w związkach zawierających sulfonowe bezwodniki
EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe
EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem

EC 3.7. działające na wiązanie C

C

EC 3.7.1. w ketonowych substancjach

EC 3.8. działające na halogenkowe wiązania

EC 3.8.1. w związkach C

halogen

EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotowe
EC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotowe
EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforowe
EC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkowe
EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe

Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie

ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ rozrywanego wiązania.

EC 4. Liazy

EC 4.1. Liazy węgiel-węgiel

EC 4.1.1. karboksy-liazy

dekarboksylazy

EC 4.1.2. aldehydo-liazy
EC 4.1.3. liazy ketokwasów
EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy

EC 4.2. Liazy węgiel-tlen

EC 4.2.1. hydro-liazy

dehydratazy

EC 4.2.2. działające na polisacharydy
EC 4.2.3. działające na fosforany

syntazy

EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy

EC 4.3. Liazy węgiel-azot

EC 4.3.1. amoniako-liazy
EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp.
EC 4.3.3. amino-liazy
EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy

EC 4.4. Liazy węgiel-siarka
EC 4.5. Liazy węgiel-halogen
EC 4.6. Liazy fosfor-tlen

Izomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej

reakcji. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają
izomeryzacji.

EC 5. Izomerazy

59

EC 5.1. Racemazy i epimerazy

EC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne
EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne
EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne
EC 5.1.99. działające na inne związki

EC 5.2. cic-trans izomerazy
EC 5.3. wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozy
EC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe

tautomerazy

EC 5.3.3. przenoszące wiązania C=C

Δ-izomerazy

EC 5.3.4. przenoszące wiązania S

S

EC 5.3.99. inne wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.4.wewnątrzcząsteczkowe transferazy

mutazy

EC 5.4.1. transportujące grupy acylowe
EC 5.4.2. fosfotransferazy

fosfomutazy

EC 5.4.3. transportujące grupy aminowe
EC 5.4.99. transportujące inne grupy

EC 5.5. wewnątrzcząsteczkowe liazy
EC 5.99. inne izomerazy

Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest

tworzone. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania
powstają w wyniku syntezy.

EC 6. Ligazy

EC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen

EC 6.1.1. ligazy tworzące aminoacylo-tRNA i spokrewnione związki

EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka

EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol

syntetazy acylo-CoA

EC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak

syntetazy amidowe

EC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas

syntetazy peptydowe

EC 6.3.3. cyklo-ligazy
EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azot
EC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem

EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel
EC 6.5. tworzące wiązanie fosforowoestrowe
EC 6.6. tworzące wiązanie azot-metal

chelatazy

Izoenzymy

Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie

działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich
odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, K

M

i odczyn immunologiczny.

Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem.
Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina się o jego odmianach i podaje odpowiednie
odnośniki literaturowe.

2.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów

Zaletą enzymów są łagodne pod względem temperatury, pH i ciśnienia warunki działania, co

obniża koszt procesów, w których uczestniczą oraz pozwala na zachowanie w otrzymanych
produktach cennych, a nieodpornych na drastyczne warunki obróbki, składników. Ponadto przebieg
procesów katalizowanych przez enzymy można łatwo regulować, zmieniając stężenie enzymu bądź
temperaturę lub pH środowiska reakcyjnego.

Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą:

pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów,
aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania
enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa
była już wcześniej. Optymalne pH

60

0

20

40

60

80

100

0

2

4

6

8

10

12

pH

A

kt

yw

no

ść

w

zg

lę

dn

a

[%

]

pepsyna

metaloproteinaza
B.subtilis

subtilizyna

pH środowiska. Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH

środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym
rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny, metaloproteinazy z
Bacillus subtilis oraz subtilizyny.

Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz

Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w

środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), metaloproteinaza w obojętnym (optymalne pH 7,3), a
subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów
hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem
bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy
niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym.
Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego
działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej –COO

-

), która

występuje w przewadze w środowisku alkalicznym.

Należy ponadto zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od

6 do 11, to pozostałe dwie proteinazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego
zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych
enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu na który działają,
choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH
wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5).

Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samą reakcję enzymatyczną, z

drugiej jednak przyspiesza denaturację enzymu,
co wiąże się z jego inaktywacją. Na poniższym
rysunku przedstawiono wpływ temperatury na
aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej
granicznej wielkości (w tym przypadku
temperatury

60

C),

szybkość

reakcji

katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie
jak to się dzieje przy wszystkich reakcjach
chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada
do wartości zerowych. Większość enzymów
drobnoustrojowych najefektywniej działa w
granicach 60

C. Enzymy roślinne i zwierzęce z

reguły już powyżej 40-50

C ulegają denaturacji. Znane są enzymy z bakterii termofilnych,

wykazujące optimum działania nawet w temperaturach sięgających 90

C.

Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura

bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie
oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość
wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w subtilizyny stabilność subtilizyny warunkach
rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem.

0

20

40

60

80

100

-20

0

20

40

60

80

Temperatura [

o

C]

A

kt

yw

no

ść

w

zg

lę

dn

a

[%

]

Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny

61

0

20

40

60

80

100

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

pH

A

kt

yw

no

ść

w

zg

lę

dn

a

[%

]

w buforze

Z dodatkiem
1% CaCl

2

Preinkubacja:
45

C, 60min

Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania,
jakkolwiek nie jest to regułą. Na rysunku 3 przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny. Jej
optymalne pH (porównaj rys.1) przekracza 10, jednakże obszar stabilności tego enzymu w warunkach
przykładowej reakcji (1% kazeiny, 45 C, 60 min.) zawarty jest w zakresie 6.5-9.5, a w pH zbliżonym
do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.

Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1% CaCl

2

Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury

reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy
termostabilne otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na rys.4 pokazano wpływ
temperatury na zachowanie się subtilizyny podczas przykładowego procesu hydrolizy kazeiny (1%
roztwór substratu w buforze o pH 9).

Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl

2

Należy wyraźnie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania

rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizyko-
chemicznych, w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach reakcji
prowadzonej w 60 C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70 C
enzym ulega już pełnej inaktywacji. Natomiast w 50

C po 60 minutach straty enzymu są stosunkowo

niewielkie i wynoszą 36%. Oczywiście, ostatecznego wyboru temperatury dokonuje się po
szczegółowej analizie wyników wszystkich badań, uwzględniającej aspekty technologiczne i
ekonomiczne procesu. Przy tego typu analizach przydatne jest wyznaczenie produktywności reakcji
enzymatycznej w kilku wytypowanych temperaturach (rys.5). Wybór optymalnej temperatury
skojarzony jest w tym przypadku z czasem procesu, który może być determinowany innym
czynnikiem (np. kosztem energii).

0

20

40

60

80

100

0

15

30

45

60

75

90

105

120

c z as [minuty ]

A

kt

yw

n

o

ść

w

zg

lę

d

n

a

[%

]

20

C

40

C

60

C

60

C

70

C

Preinkubacja:
w buforze o pH 9

Z dodatkiem
1%CaCl

2

62

Rys. 5 Produktywność subtilizyny w hydrolizie kazeiny

Inhibitory, aktywatory, stabilizatory.
Oprócz wymienionych wyżej czynników inaktywujących działanie enzymów, istnieje grupa

substancji zdolnych do wybiórczego hamowania ich aktywności katalitycznej (są to tzw. inhibitory
specyficzne). W opracowaniu pominięto szczegóły dotyczące tego działu enzymologii. Należy jednak
wiedzieć, że tego typu naturalne inhibitory występują w przyrodzie, co może mieć istotne znaczenie
dla aplikacji enzymów w niektórych przypadkach. Przykładem mogą być specyficzne inhibitory
proteinaz serynowych (w tym subtilizyny) znalezione m.in. w ziemniakach czy soi, które skutecznie
blokują aktywność tej grupy enzymów.

Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu.

Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności
katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami
komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego
szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w
tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również

letalne

.

Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji : - nieodwracalną - odwracalną.

Inhibicję odwracalną można podzielić na:
1) kompetycyjną
2) niekompetycyjną
Inhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały ,

nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w
miejscu aktywnym lub jego pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą
udział reszty Ser i Cys mające , odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH . Przykładem może być
związek diizopropylofluorofosforan (DFP) , składnik gazów bojowych (

soman

) działający na układ

nerwowy, reaguje z resztą Ser w miejscu aktywnym enzymu esterazy acetylocholinowej,
nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych.

Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu danego

enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem aktywnym. Enzym
może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema
jednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie. Przy dużych
stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże
stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką inhibitora o wiązanie się w
miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości V

max

enzymu , ale w obecności

inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wratośc

63

K

m

wzrasta. Przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa.

Enzum ten używa bursztyniany jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian, który
różni się od bursztynianu posiadniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce

aktywne i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia
aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat, enzym może
wiązać albo inhibitor, albo substrat równocześnie. Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można
przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość V

max

. W inhibicji

niekompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość K

m

nie zmienia się . Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepstatyny na enzym reninę .

Na działanie enzymów wpływ mogą wywierać jony obecne w środowisku reakcyjnym. Jony

dwuwartościowych metali, jak magnez, wapń, cynk, mangan lub kobalt w specyficzny sposób
aktywują wielu enzymów (t.zn. zwiększa- ją szybkość reakcji przez nie katalizowanej). Aktywatorami
mogą być też aniony np. amylaza ślinowa jest aktywowana jonami Cl . Jony metali mogą wykazywać
również wpływ stabilizujący na enzym (tzn. podwyższać jego stabilność wobec niekorzystnego
wpływu m.in. pH i temperatury). Przy- kładem może być wpływ jonów Ca na subtilizynę. Na rys. 3 i
4 pokazano, że jony te podwyższają termostabilność subtilizyny (z 50 do 60 C) i jej trwałość w
alkalicznym środowisku (z pH 9.5 do 10.5). Natomiast jony wielu metali ciężkich (np. Hg, Cu, Pb) są

64

silnymi inhibitorami enzymów (tzn. inaktywują one enzym, tym samym hamując reakcję
przebiegającą przy jego udziale). Jest to inhibicja niespecyficzna, której podlegają wszystkie znane
enzymy. Istnieje ponadto wiele innych substancji mających zdolność niespecyficznej inaktywacji
enzymów (związanej ze zniszczeniem naturalnej struktury białka). Do nich zalicza się mocznik,
aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor).

Koncentracja wody.
W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Należy

bowiem pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją
przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi
może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza prze- mian, w których
woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Wykazano, że stężenie
wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje
hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w
środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla
pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję
enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym
rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie dwufazowym (z rozpuszczalnikiem
apolarnym nasyconym wodą), korzystnie z immobilizowaną formą enzymu itp. Obecnie jest to jeden z
najbardziej preferowanych kierunków badawczych, m.in. z uwagi na potencjalnie możliwe do
uzyskania efekty (również o charakterze aplikacyjnym w wielu procesach przemysłowych).

Charakterystyka biokatalizatorów przemysłowych
Termin "biokatalizatory przemysłowe" (używany obecnie w bardzo szerokim znaczeniu) oznacza

katalizatory otrzymywane w skali przemysłowej na drodze biologicznej. Pod tym pojęciem rozumie
się zarówno enzymy: natywne, spreparowane rozmaitymi technikami (np. ich immobilizowane
formy), ich mikstury, rozmaite proszki zawierające ich dodatek, jak i komórki: całe lub ich fragmenty,
żywe i martwe.

Enzymy wyodrębniane są z tkanek zwierzęcych lub roślinnych oraz wytwarzane przez

drobnoustroje. Te pochodzące z dwóch pierwszych wymienionych źródeł występują na rynku
stosunkowo w małych ilościach i są względnie drogie. Niektóre z nich: renina, pepsyna, trypsyna,
papaina i bromelaina są ekstrahowane ze spożywczych surowców.

Tabela 1 Enzymy produkowane przez mikrobiologiczną fermentację (adaptowane z Trampera, 1994).

Enzym

Substrat

Mikroorganizm



-amylaza

Skrobia

Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus licheniformis



-amylaza

Skrobia

Bacillus polymyxa

Amyloglukozydaza
(glukoamylaza)

Dekstryny

Aspergillus niger
Rhizopus niveus

Celulazy

Celuloza

Phanerochaete chrysosporium
Trichoderma reesei

Izomeraza glukozowa

Glukoza

Actinoplanes missouriensis
Streptomyces murinus
Streptomyces olivochromogenus

Oksydaza glukozowa

Glukoza

Aspergillus niger



-glukozydaza

Maltoza

Aspergillus niger
Bacillus amyloliquefaciens
Saccharomyces cerevisiae

65

Lipazy

Lipidy

Aspergillus niger
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Rhizopus arrhizus

Pektynoesteraza

Pektyna

Aspergillus niger
Aspergillus oryzae

Proteinaza alkaliczna
(serynowa)

Białka

Aspergillus oryzae
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis

Proteinaza kwaśna
(pepsyno-podobna)

Białka

Aspergillus oryzae
Aspergillus saitoi

Proteinaza kwaśna (renino-
podobna)

białka

Endothia parasitica
Mucor michei
Mucor pusillus

Proteinaza obojętna białka

Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis

Pullulanaza

Amylopektyna

Aerobacter aerogenes
Bacillus cereus var.mycoides

W wyniku rozwoju biotechnologii, mikroorganizmy stanowią podstawowe źródło enzymów.

Zastosowanie mutacji i specjalnych technik selekcji drobnoustrojów pozwoliło osiągnąć wysoki
poziom produkowanych przez nie enzymów, w niektórych przypadkach sięgający 10% wszystkich
wytwarzanych białek . Ponadto użycie dużych fermentorów (do 300 m ) sprawia, że obecnie w
krótkim czasie i przy niskich kosztach produkuje się na skalę przemysłową olbrzymie ilości
rozmaitych enzymów (tabela 1).

Niezależnie od źródła pochodzenia enzymy mogą katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie

muszą posiadać identycznej budowy chemicznej, a tym samym mogą znacznie różnić się optymalnymi
warunkami działania. I tak na przykład α -amylaza katalizuje hydrolizę wiązań ŕ-1,4- między
cząsteczkami D-glukozy w polisacharydach, takich jak amyloza. α-amylaza trzustkowa posiada
optymalne pH około 7 i optymalną temperaturę 37 C, podczas gdy enzym ten wyodrębniony z
Aspergillus oryzae - optymalne pH 4,7 i optymalną temperaturę działania 50 C, a z Bacillus subtilis
odpowiednio pH 6,5 i 75 C. W zasadzie te dwa parametry (pH i temperatura) decydują o możliwości
zastosowania enzymów w procesach produkcji środków spożywczych przebiegających w różnych
warunkach (np. w różnych gałęziach przemysłu spożywczego). Fakt ten tłumaczy występowanie na
rynku rozmaitych preparatów homologicznych enzymów. Należy jednak mieć na uwadze, że tylko
część drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie bioproduktów (w tym enzymów) traktowana jest jako
nieszkodliwa dla stosowania w środkach spożywczych (tabela 2).

W ogólnym zarysie proces produkcji enzymów drobnoustrojowych polega na hodowli

wyselekcjonowanych kultur mikroorganizmów na specjalnie opracowanych dla każdej z nich
pożywkach, z zachowaniem specyficznych warunków fizycznych środowiska hodowlanego, a w
następnym etapie wyodrębnieniu wytworzonego enzymu. Jeśli enzym jest nagromadzany
pozakomórkowo, to można go wyodrębnić z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub
filtracji. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym proce- durom wydzielania i
oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie działają ujemnie na własności
katalityczne enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi
konieczność poddawania ich skomplikowanym i drogim procesom oczyszcza- nia. W dużej mierze
przeznaczenie enzymu decyduje o stopniu czystości jego handlowych preparatów. Ogólnie biorąc,
preparaty enzymów wykorzystywane dla celów analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością
(niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym). Również enzymy stosowane w farmacji
posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego nie
wymagają już tak wysokiego stopnia czystości. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet
wyjaławiane. Coraz częściej dla konkretnego procesu wytwarza się specjalnie przeznaczony preparat
enzymu, dobierając jego aktywność tak, aby dodana ilość wynosiła 0.05-0.5 % na kg substratu.

66

Tabela 1 Mikroorganizmy używane dla produkcji enzymów (adaptowane z Gacesa i Hubble, 1987).
Grupa A

Mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności (nie wymagające
testowania)

 Bacillus subtilis (włączając szczepy znane jako mesentericus, natto i

amyloliquefaciens),

 Aspergillus niger (włączając awamori, foetidus, phoenicis, saitoi i usamii),

 Asp. oryzae (włączając sojae i effesus)

 Mucor javanicus

 Rhizopus arrhizus, oligosporus, oryzae

 Saccharomyces cerevisiae

 Kluyveromyces fragilis, lactis

 Leuconostoc oenos

Grupa B

Mikroorganizmy uważane za nieszkodliwe w żywności (enzymy wytwarzane
przez nie, testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności)

 Bacillus stearothermophilus, licheniformis, coagulans, megaterium, circulans,

 Klebsiella aerogenes

Grupa C

Mikroorganizmy nie włączone do grup A i B (ewentualne stosowanie enzymów
produkowanych przez nie w produkcji żywności, wymaga specjalistycznych
testów)

 Mucor miehei, pusillus

 Endothia parasitica

 Actinoplanes missouriensis

 Streptomyces albus, olivaceus

 Bacillus cereus

 Trichoderma reesei (T. viride)

 Penicillium dimorphosporum, simplicissium, funiculosum

Zwykle handlowe preparaty zawierają od 2 do 10% suchej masy czystego enzymu. Reszta to

zanieczyszczenia pochodzące z podłoża hodowlanego (np. inne białka wytworzone przez rosnącą
kulturę, niektóre z nich będące również enzymami) oraz celowo dodane stabilizatory, wypełniacze itp.
Z aplikacyjnego punktu widzenia istotna jest zwłaszcza wiedza na temat enzymów stanowiących
zanieczyszczenie handlowych preparatów. Niektóre z nich mogą bowiem katalizować niekorzystne,
uboczne reakcje chemiczne. Niekiedy jednak gotowe preparaty celowo są mieszaniną kilku enzymów
(np. preparaty typu "Protogal" przeznaczone dla detergentów, a otrzymywane w oparciu o technologię
opracowaną w Instytucie Biochemii Technicznej PŁ zawierają w swoim składzie proteinazę, ŕ-
amylazę i lipazę- wszystkie trzy przydatne w środkach piorących).

Przeznaczenie preparatu enzymatycznego określa jego postać końcową. Mogą być one

otrzymywane w postaci ciekłego koncentratu lub ciała stałe- go, o różnym stopniu oczyszczenia,
ewentualnie z dodatkiem stabilizatorów. Preparaty enzymatyczne w stanie stałym charakteryzują się
znacznie wyższą stabilnością od preparatów ciekłych. Te drugie podatne są na działanie
drobnoustrojów, a ponadto w środowisku wodnym enzym ulega łat- wiej denaturacji i dodatkowo
narażony jest na działanie enzymów proteolitycznych, których obecność w gotowych preparatach
(choćby w nieznacznych ilościach) jest dość powszechna. Preparaty stałe enzymu nie powinny być
pyliste (z uwagi na możliwość wywołania reakcji alergicznych u pracowników), stąd najczęściej
wytwarzane są w postaci granulowanej.

Zasadniczym przełomem w biotechnologii było zastosowanie enzymów immobilizowanych. W

uogólnieniu, immobilizacją enzymu można nazwać za- biegi umożliwiające wielokrotne jego użycie.
Jeden ze sposobów immobilizacji polega na unieruchomieniu enzymu na nośniku. Takie formy
enzymów w wielu przypadkach wykazują wyższą stabilność od natywnych enzymów, zarówno w

67

trakcie przechowywania jak i w warunkach samej reakcji bio- chemicznej. Jednakże największa
korzyść związana jest z możliwością ich wielokrotnego stosowania, w tym w procesach o charakterze
ciągłym (np. w reaktorze o działaniu ciągłym z immobilizowaną izomerazą glukozową produkuje się
wysoko fruktozowy syrop). Metody stosowane w immobilizacji enzymów mogą być również
wykorzystane w unieruchamianiu komórek zarówno martwych jak i żyjących. Unieruchomione
biokatalizatory (enzymy i komórki) są szczególnie obiecujące w zastosowaniu do procesów
przetwórstwa żywności. Chemiczne katalizatory nie mogą konkurować z enzymami, chociażby ze
względu na przepisy sanitarne obowiązujące w produkcji żywności. Najnowszym kierunkiem badań w
tym zakresie jest ko-immobilizacja enzymów, czyli jednoczesne unieruchomienie na wspólnym
nośniku dwu lub więcej enzymów przeznaczonych do katalizowania pojedynczego procesu.

Cena preparatów enzymatycznych jest bardzo zróżnicowana (od 3 $/kg w przypadku preparatu

glukoamylazy przeznaczonego do scukrzania dekstryn, aż do 1 miliona $/kg w przypadku czynnika
VIII enzymów trombolitycznych stosowanych w medycynie). Zależy ona od wiele czynników, w tym
tak oczywistych jak koszty produkcji (a głównie stopień oczyszczenia enzymu), ale także w dużej
mierze zależy od rynkowego zbytu, konkurencyjności i skuteczności działania (ich produktywności w
aplikacyjnych warunkach). Ogólnie biorąc, najdroższe są enzymy przeznaczone dla analityki, a naj-
tańsze stosowane masowo w różnych gałęziach przemysłu (tabela 3). Przyjmuje się ponadto, że koszt
aplikacyjny enzymów przemysłowych powinien stanowić 2-4 % kosztów całego procesu, co w pewien
sposób determinuje ich cenę.

Tabela 2 Wielkość produkcji enzymów i ich cena (adaptowane z Trampera, 1994)

Typ aplikacji

Wielkość produkcji (tony)

Cena ($/kg)

Analityka

10

-3

- 1

10

6

– 10

9

Farmacja

1 – 10

2

10

2

– 10

5

Specjalna

1 – 10

2

10

2

– 10

5

Przemysł masowy

10

2

– 10

4

3 – 50

Potencjał aplikacyjny enzymów tkwi w specyficzności i ich katalitycznej wydajności, przy czym

działają one w umiarkowanych warunkach pH, temperatury i ciśnienia zapewniając wysoką
wydajność nawet w skomplikowanych reakcjach lub ich ciągach. Jednakże z aplikacyjnego punktu
widzenia dla każdego konkretnego procesu i enzymu w nim biorącego udział konieczna jest
skojarzona optymalizacja temperatury, pH środowiska reakcyjnego, stężenia reagentów oraz innych
parametrów technologicznych. Niepowodzenia napotykane niekiedy w stosowaniu enzymów w
krajowych technologiach, o których się nieraz słyszy, wynikać mogą z niepełnej wiedzy o
właściwościach samych enzymów, ich preparatów lub procesach, w których biorą udział.

68

ROZDZIAŁ 3. BIOCHEMIA GENÓW

RNA

Nukleotyd

DNA

Nukleozyd

H

3

PO

4

H

3

PO

4

ryboza

deoksyryboza

zasady purynowe

i pirymidynowe

C

O

C

C

C

OH

H

OH

H

HOH

2

C

H

H

OH

3'

4'

5'

2'

1'

C

O

C

C

C

OH

H

H

OH

H

HOH

2

C

H

H

3'

4'

5'

2'

1'

D-ryboza

D-deoksyryboza

N

N

pirymidyna

N

N

N

N

1

1

2

2

3

3

4

4

5

6

7
8

9

H

5

6

puryna

N

N

NH

2

O

H

cytozyna

N

N

O

OH

N

N

O

OH

CH

3

H

H

uracyl

tymina

N

N

N

N

NH

2

H

N

N

N

N

OH

H

2

N

H

adenina

guanina

69

Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym

również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na
osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu
procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki
surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum
różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla
technologii.

70

71

PISMIENNICTWO
Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986
Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987.
Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990.
Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991
Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie

PZWL, W-wa 1994

Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J.,

Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45

Galas E.: Wiadomości chemiczne (1984), 11, 11-30
Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24

72

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)

i jego fosforan (NADP)

P

P

+

N

CONH

2

HO

OH

CH

2

O

O

O

OH

OH

OH

2

C

(

P

)

N

N

N

N

NH

2

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

N

N

N

NH

H

3

C

H

3

C

CH

2

O

O

CHOH
CHOH
CHOH
CH

2

O

P

adenozyna

P

C

Enzym-NH

CH

2

CH

2

CH

2

CH

2

CH

CH

2

S

CH

2

S

O

liponian

ubichinon (Q)

O

O

H

3

C

H

3

C

CH

3

)

(

n H

N

CH

2

CH

3

CH

HC

CH

N

CH

3

CH
CH

2

N

CH

2

CH

2

HOOC

H

3

C

Fe

+3

CH

3

HOOC CH

2

CH

2

HC

CH

N

hemina (porfiryna)

O

OH

OH

N

N

N

N

NH

2

CH

2

S

CH

2

CH

3

CH

2

CHNH

2

COOH

+

adenozynometionina

N

N

N

N

OH

H

2

N

CH

2

C

NH

NH

O

CH

COOH

CH

2

CH

2

COOH

H

H

kwas tetrawodorofoliowy (H

4

folian)

N

N

H

3

C

NH

2

CH

2

N

S

CH

2

CH

3

CH

2

O

P

P

+

difosfotiamina (DPT)

N

H

3

C

CH

2

OH

HO

C

O

H

pirydoksal

HN

NH

O

S

C
O

NH-Enzym

biotyna

adenozyno-5`-fosforan

koenzym A (CoA-SH)

P

P

O CH

2

C

CH

3

CH

3

CH
OH

C

O

NH CH

2

CH

2

SH

Dodatek

S

Lip

<

S