Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Do przeprowadzenia reakcja PCR potrzeba:

1. Jednoniciowej matrycy DNA.

2. Pary starterów (sekwencji oligonukleotydów komplementarnych do końców
zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA).

3. Trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP).

4. Enzymu polimerazy DNA.

Każdy cykl reakcji składa się z trzech etapów:

1.

Termiczna denaturacja

powielanego DNA (temp. 94 - 95°C) w obecności

nadmiaru każdego z dwóch starterów i czterech dNTP.

2.

Hybrydyzacja starterów

do sekwencji komplementarnej z matrycą w

temperaturze 40 - 60°C przez 20 do 40 sekund.

3.

Wydłużanie startera

od końca 3'-OH przez sukcesywne dosyntetyzowanie

dNTP w temperaturze 72°C. Proces ten jest katalizowany przez polimerazę DNA.

PCR – podsumowanie

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Powtarzanie cykli amplifikacji prowadzi do wzrostu ilości

odpowiednich fragmentów DNA w postępie wykładniczym,
2

n

gdzie n oznacza liczbę cykli

Po 30 - 40 cyklach uzyskuje się powielenie fragmentu DNA
kilka milionów razy - produkty jednego cyklu amplifikacji
służą jako matryce dla następnego.

Główny produkt tej eksponencjalnej reakcji to segment
dwuniciowego DNA , którego końce określone są prze końce
5' primera i których długość określona jest przez odległość
pomiędzy primerami.

PCR – podsumowanie

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Na efektywność reakcji PCR w istotny sposób
wpływają różne czynniki fizyczne i chemiczne.

Czynnikami takimi są:

1. Typ termocyklera.
2. Temperatura i czas poszczególnych etapów,
ilość cykli.
3. Stężenie polimerazy DNA, jakość enzymu i

buforu reakcyjnego.

4. Stężenie dNTP.
5. Primery.

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Temperatura i czas poszczególnych etapów

Denaturacja – typowe warunki dla niemal każdej reakcji z
polimerazą Taq to 95°C 20 - 30 sekund, lub 97°C - 15 sekund.

Wyższa temperatura może być stosowana w przypadku matrycy

bogatej w pary G+C.

Niekompletna denaturacja może obniżyć wydajność reakcji – za mało
matrycy w kolejnych cyklach.

Za długa denaturacja może doprowadzić do niepotrzebnego

zmniejszenia aktywności enzymu.

Czas aktywności polimerazy Taq: >2 godz. przy 92,5°C, 40 minut

przy 95°C i 5 minut dla temperatury 97,5°C.

Denaturacja nie powinna być ostatnim etapem kończącym proces
amplifikacji PCR.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Temperatura i czas poszczególnych etapów

Hybrydyzacja (ang. annealing)– przyłączenie startera, najbardziej istotny czynnik w optymalizacji

reakcji.

Na ten etap ma wpływ a) temperatura, b) stężenie matrycy i startera oraz c) czas.
Po denaturacji mieszaninę reakcyjną schładza się do około 50 – 65°C w której startery mogą łatwo i

dokładnie hybrydyzować z matrycą. Czas hybrydyzacji – 20 – 40 sekund.

Jeżeli temperatura hybrydyzacji jest za wysoka – przyłączenie starterów jest nie możliwe.

Przy za niskiej temperaturze może zachodzić niespecyficzne przyłączenie starterów do wielu miejsc

na matrycy – w efekcie duża ilość nie specyficznych produktów o nie znanej sekwencji.

Temperaturę hybrydyzacji należy ustalać oddzielnie dla każdego startera, można to już przewidzieć na

etapie projektowania. Ważnym parametrem do określenia jest temperatura topnienia Tm (malting

temperature) zaprojektowanej struktury.

Jeśli temperatura topnienia będzie wyższa niż temperatura hybrydyzacji to z reakcji nic nie będzie.

Nie dojdzie do hybrydyzacji a to jest warunek rozpoczęcia reakcji przez polimerazę.

Jeśli Tm jest niższa niż temperatura hybrydyzacji nic nie powinno zakłócić reakcji. Wybiera się

najwyższą możliwą temperaturę hybrydyzacji, znacząco wpływa to na specyficzność reakcji.

Na temperaturę hybrydyzacji wpływa budowa primera, a dokładnie procentowa zawartość par G+C
w stosunku do par AT oraz jego długość.

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Temperatura i czas poszczególnych etapów

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Elongacja -kiedy startery połączą się specyficznie z matrycą do

pracy przystępuje polimeraza.

Standardowo dla polimerazy Taq reakcję polimeryzacji
przeprowadza się przy 72°C przez 20 sekund - dla fragmentów
krótszych niż 500 pz i 40 sekund - dla fragmentów o długości
do 1,2 kpz.

W przypadku innych polimeraz należy się kierować
wskazaniami producenta odnośnie temperatury i czasu
elongacji

Zakończenie amplifikacji – 4 °C

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Temperatura i czas poszczególnych etapów

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Ilość cykli:

●

Zależy od początkowego stężenia matrycy DNA.

●

Nie powinna przekraczać 40 (optymalna od 25 do 35).

●

Zwiększając liczbę cykli wzrost niespecyficznych produktów.

●

Zbyt mała liczba cykli mała wydajność powstającego produktu.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Stężenie polimerazy DNA

Optymalna ilość enzymu wynosi 0,5 - 2,5 jednostki (U) w próbce na
50 μl na około 40 cykli.

●

Zwiększenie stężenia enzymu - niespecyficzne produkty

●

Zmniejszenie stężenia enzymu - zbyt małe ilości produktu.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Skład buforu reakcyjnego

Stężenie jonów Mg

2+

●

Optymalne stężenie około l,5 mM, (0,5 – 5 mM)

●

Jony Mg

2+

wpływają na aktywność enzymu, zwiększają Tm ds DNA,

tworzą rozpuszczalne kompleksy z dNTP oraz z powstającymi z nich w

trakcie polimeryzacji pirofosforanem oraz EDTA

●

Zbyt wysokie stężenie Mg

2+

niespecyficzne produkty

●

Zbyt niskie stężenie Mg

2+

- słabszy sygnał amplifikacji.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Stężenie dNTP

Optymalne stężenie dNTP długość reakcji PCR zależy od:

●

Długości amplifikowanego produktu,

●

Stężenia MgCl

2

●

Stężenia primera

Końcowe stężenie każdego nukleotydu w roztworze wynosi około 200 μM
ale zależy od rodzaju polimerazy i prowadzonej reakcji.

Nierówne ilości czterech dNTP redukują wydajność amplifikacji.

Nukleotydy (i pirofosforan) redukują pulę wolnych jonów Mg

2+

(wpływając na aktywność polimerazy i hybrydyzację starterów).

Niskie stężenie dNTP minimalizuje błędne ich wstawianie w nowo

syntetyzowanej nici.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Optymalizacja warunków reakcji PCR

Startery

●

Długość typowych starterów powinna wynosić 18 do 28 nukleotydów,

zawierających 50 - 60 % par G-C.

●

Końcowe optymalne stężenie starterów wynosi 0,1 do 0,5 μM wyższe

stężenie może prowadzić do akumulacji niespecyficznych produktów i
zwiększa prawdopodobieństwo generowania dimerów starterów.

●

3' końce starterów powinny być niekomplementarne w stosunku do siebie

(niebezpieczeństwo tworzenia dimerów).

●

Nie powinny zawierać sekwencji palindromicznych.

●

Nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych.

●

Należy unikać w sekwencjach starterów nierównej dystrybucji rejonów

bogatych w G/C lub A/T.

●

Ważne jest, aby Tm obydwu starterów były do siebie zbliżone, najlepiej

takie same.

●

Tm nie powinna być niższa niż 50°C.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Projektowanie starterów

Temperatura stapiania starterów

●

Najprostszy wzór na obliczanie temperatury stapiania (stosowany

najczęściej):

T

m

= 2°(A + T) + 4°(G +C)

Jest prawdziwy dla oligonukleotydów o długości 14-20 pz. Dla dłuższych

starterów wprowadza się korekcję temperatury obniżając ją o 5-10°C

●

Obliczenia oparte o stężenie soli, zawartość par G-C i długość startera:

L – długość startera
[SALT]- zawartość soli w buforze reakcyjnym:

Projektowanie starterów

Temperatura stapiania starterów

Projektowanie starterów

Temperatura stapiania starterów

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

●

Obliczenia oparte o oddziaływania między nukleotydami w najbliższym

sąsiedztwie:

Wartości entalpii

ΔH

o

e

=-5kcal/mol

Wartości energii swobodnej

ΔG

o

e

=-1kcal/mol, ΔG

o

i

=+2,2kcal/mol

Projektowanie starterów

Długość starterów

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

W standardowym PCR stosuje się startery o długości 18-24 pz.
Minimalna długość (18pz) wynika z wielkości genomu i
prawdopodobieństwa spotkania w sekwencji 2 identycznych
fragmentów (specyficzność oddziaływania starter-matryca).

Z każdym kolejnym nukleotydem starter staje się 4 x bardziej
specyficzny.

Im dłuższy starter tym mniejsza wydajność reakcji amplifikacji, bo
trudniej podczas stapiania utworzyć prawidłowy dupleks z nicią
matrycowego DNA.

Najdłuższe startery mają 28-35 pz. Są stosowane w specyficznych
sytuacjach np: 1) amplifikacja blisko spokrewnionych izoform
białek; 2) amplifikacja fragmentów niekodującego DNA

Projektowanie starterów

Końce 5' i 3'

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Koniec 5' nie wymaga szczególnej uwagi, bo od niego nie zależy w
tak dużym stopniu specyficzność PCR. Przyłączać można do niego
dodatkowe nukleotydy nieparujące z matrycą np. miejsca
restrykcyjne.

Bardzo ważny dla specyficzności reakcji jest koniec 3', bo od tej
strony przyłącza się polimeraza, która zaczyna działać wtedy, kiedy
utworzy się para nukleotydów na tym końcu.

Większa zawartość par G-C w ostatnich 5 nukleotydach 3'-końca
wzmacnia siłę specyficznego wiązania startera do matrycy ale
powinno się unikać stosowania więcej niż 3 par G-C w tym
ostatnim odcinku aby nie zaszło przypadkowe parowanie
nukleotydów co obniża specyficzność reakcji.

Projektowanie starterów

Końce 5' i 3'

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Koniec 5' nie wymaga szczególnej uwagi, bo od niego nie zależy w
tak dużym stopniu specyficzność PCR. Przyłączać można do niego
dodatkowe nukleotydy nieparujące z matrycą np. miejsca
restrykcyjne.

Bardzo ważny dla specyficzności reakcji jest koniec 3', bo od tej
strony przyłącza się polimeraza, która zaczyna działać wtedy, kiedy
utworzy się para nukleotydów na tym końcu.

Większa zawartość par G-C w ostatnich 5 nukleotydach 3'-końca
wzmacnia siłę specyficznego wiązania startera do matrycy ale
powinno się unikać stosowania więcej niż 3 par G-C w tym
ostatnim odcinku aby nie zaszło przypadkowe parowanie
nukleotydów co obniża specyficzność reakcji.

Projektowanie starterów

Zawartość par G-C i ich położenie

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Par G-C powinno być w granicach 40-60% bo to daje optymalne
warunki (głównie temperaturowe) dla parowania startera z matrycą.

Należy unikać występowania więcej niż 3 par G-C obok siebie
szczególnie na 3'-końcu.

Starter powinien być bardziej „lepki” (więcej par G-C) w środku i
na 5'-końcu niż na końcu 3'.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Projektowanie starterów

Struktury drugorzędowe

Struktury drugorzędowe starterów pojawiają się w wyniku
oddziaływań wewnątrz, bądź międzycząsteczkowych.

Powodują:
1) zmniejszenie ilości produktu PCR aż do jego
całkowitego braku;
2) hamują stapianie się starterów z matrycą;
3) w dużym stopniu zmniejszają zdolność starterów do
reakcji

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Projektowanie starterów

Struktury drugorzędowe

Self Dimer: tworzy się przez międzycząsteczkowe oddziaływanie
z drugim, takim samym starterem. Kiedy startery tworzą dimery
szybciej niż hybrydyzują z matrycą to spada wydajność PCR.
Wartości ΔG akceptowalne dla tego typu dimeryzacji: 1) dla 3'-
końca ΔG -5 kcal/mol; 2) dla środka startera ΔG -6 kcal/mol.

Przykłady

Starter ma T

m =

50°C, więc 3’ GC

homologia (ΔG=-3.1 kcal/mol) może

być problemem; jeżeli T

m

byłaby

wyższa (np. 60°C), wtedy starter

byłby dobry.

ΔG=-9.3 kcal/mol. Bardzo zły!!!

ΔG=-1.6 kcal/mol. Dobry!!

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Projektowanie starterów

Struktury drugorzędowe

Cross

Dimer:

tworzy

się

przez

międzycząsteczkowe

oddziaływanie z drugim, innym starterem kiedy występują między

nimi homologiczne fragmenty. Wartości ΔG akceptowalne dla
tego typu dimeryzacji: 1) dla 3'-końca ΔG -5 kcal/mol; 2) dla
środka startera ΔG -6 kcal/mol.

Przykłady

ΔG=-5 kcal/mol, dobry ale nie

najlepszy.

ΔG=-5 kcal/mol, dobry ale nie

najlepszy.

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Projektowanie starterów

Struktury drugorzędowe

Spinki (Hairpins): Tworzą się przez oddziaływania
wewnątrzcząsteczkowe w jednym starterze. Powinno się ich
unikać!!! Ale jeżeli już są to wartości ΔG akceptowalne dla tego
typu struktur: 1) dla 3'-końca ΔG -2 kcal/mol; 2) dla środka
startera ΔG -3 kcal/mol. Nie powinno być więcej niż 3 pz

wewnątrz startera, które mogą tworzyć dupleksy.

Przykłady:

ΔG=-1,36 kcal/mol, dobry ale nie

najlepszy.

ΔG=-3,72 kcal/mol,

Zły!!!

Projektowanie starterów

Powtórzenia par zasad

Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej

Dinukleotydy: powtarzające się kolejno pary takich samych
nukleotydów (np. ATATATAT) mogą powodować nieprawidłowe
parowanie. Maksymalna, dopuszczalna ilość powtórzeń dinukleotydów
w starterze to 4.

Mononukleotydy: powtarzające się kolejno takie same nukleotydy (np.
GGGGG) mogą powodować nieprawidłowe parowanie. Maksymalna,
dopuszczalna ilość powtórzeń tej samej zasady w starterze to 4.