Medycyna Wet. 2006, 62 (7)

804

Praca oryginalna

Original paper

W Polsce nie podejmowano dotychczas badañ mo-

nitoringowych nad statusem epidemiologicznym chla-

mydofilozy (dotychczas zwanej chlamydioz¹) byd³a.

Dane odnoœnie do uaktualnionej taksonomii drobno-

ustrojów z rodziny Chlamydiaceae, podobnie jak in-

formacje o ich patogennoœci dla ludzi i zwierz¹t, by³y

w ostatnim czasie przedmiotem licznych publikacji (7,

9, 15, 19, 21) w tym tak¿e w jêzyku polskim (5, 12,

14, 18).

Bior¹c pod uwagê fakt du¿ej migracji zwierz¹t,

szczególnie zwi¹zanej z ich importem oraz brak opra-

cowañ dotycz¹cych byd³a rodzimego, przeprowadze-

nie serologicznych badañ monitoringowych, obrazu-

j¹cych obecnoœæ przeciwcia³ anty-Chlamydophila psit-

taci i Chlamydophila abortus (Cp. psittaci, Cp. abor-

tus) w populacji byd³a w Polsce wydaje siê w pe³ni

zasadne. Warto podkreœliæ, ¿e zgodnie z danymi piœ-

miennictwa, sta³e ogniska tej zoonozy u byd³a oraz

u owiec i kóz wystêpuj¹ u naszych s¹siadów, np. Niem-

cy, czeskie Morawy (21). Potwierdzaj¹ to równie¿ ba-

dania, wykonywane w krajowym laboratorium refe-

rencyjnym w zakresie chlamydiozy w Pu³awach, z któ-

rych wynika, ¿e u tryków i owiec eksportowanych

z Polski stwierdzano przeciwcia³a anty-Cp. abortus

w wysokim mianie (1/256 czy 1/516), a u byd³a prze-

ciwcia³a anty-Cp. psittaci i Cp. abortus.

Warto równie¿ przypomnieæ, ¿e chlamydofiloza jako

zoonoza stwarza du¿e niebezpieczeñstwo dla ludzi.

Potencja³ zoonotyczny drobnoustrojów z rodziny Chla-

mydiaceae ilustruje ryc. 1.

Celem podjêtych badañ by³a ocena wystêpowania

przeciwcia³ anty-Cp. psittaci i Cp. abortus w dostêp-

nej populacji byd³a w Polsce, a tak¿e dokonanie po-

równawczej analizy serologicznych metod jakoœcio-

wych (odczyn wi¹zania dope³niacza – OWD) i iloœcio-

wych (test ELISA) stosowanych w diagnostyce chla-

mydofilozy prze¿uwaczy.

Wystêpowanie przeciwcia³ anty-Chlamydophila spp.

w wybranej populacji byd³a w Polsce

KRZYSZTOF NIEMCZUK

Laboratorium Diagnostyki Serologicznej/Zak³ad Chorób Byd³a i Owiec

Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego – Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy

Niemczuk K.

Occurrence of anti-Chlamydophila sp. antibodies in selected cattle populations in Poland

Summary

Bovine chlamydophilosis monitoring programs have not been run in Poland during the last decade, there-

fore the epidemiological status of the disease remains unrecognised. Recently observed animal movements,

including international trade and import of livestock into Polish territory, support the necessity of serological

surveillance of chlamydophilosis in representative subsets of the Polish bovine population. The aim of the

study was the evaluation of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus seroprevalence in a subset of

the bovine population and the comparative evaluation of serological techniques used in chlamydophilosis

diagnostics (CFT, ELISA).

Keywords: cattle, Chlamydophila sp.

Cp.

psittaci

Cp. abortus

Cp.

psit

taci/

abort

us

Cp.

pneumoniae

Cp. pecorum

Cp. psittaci/abortus

C. suis

Cp.

felis

Cp.

psit

taci/

abort

us

Cp.

pecorum

Cp.

pneumoniae

Ryc. 1. Potencja³ zoonotyczny drobnoustrojów z rodziny Chla-

mydiaceae

Objaœnienia: Cp. – drobnoustroje z rodzaju Chlamydophila, C. –

drobnoustroje z rodzaju Chlamydia, ® – Ÿród³a zaka¿enia cz³o-

wieka znane dotychczas, Þ inne, potwierdzone po reklasyfikacji

drobnoustrojów z rodziny Chlamydiaceae Ÿród³a zaka¿enia cz³o-

wieka nowymi gatunkami tych bakterii

Medycyna Wet. 2006, 62 (7)

805

Materia³ i metody

Badania serologiczne wykonano z wykorzystaniem mikrome-

tody odczynu wi¹zania dope³niacza, techniki diagnostycznej za-

lecanej w tego typu badaniach przez Miêdzynarodowe Biuro ds.

Epizootii O.I.E., a ponadto zwalidowanej w warunkach laborato-

rium oraz akredytowanej przez Polskie Centrum Akredytacji

(PCA, nr akredytacji AB 544) zgodnie z norm¹ PN-EN ISO/IEC

17025:2001/Ap1:2003. W odczynie tym u¿yto reagentów ze

szwajcarskiej firmy Virion oraz z Wytwórni Surowic i Szczepio-

nek Biomed – Kraków. Przed ka¿dym badaniem przeprowadzo-

no wewn¹trzlaboratoryjn¹ kontrolê, tj. mianowanie antygenu

wobec surowicy kontrolnej pozytywnej oraz sprawdzenie aktyw-

noœci pozosta³ych reagentów u¿ytych w odczynie, celem stwier-

dzenia ich faktycznego miana/aktywnoœci w odniesieniu do

deklarowanego przez producentów. Odczyn w³aœciwy OWD, jak

i poszczególne jego etapy oraz interpretacjê wyników wykonano

zgodnie z zaleceniami zawartymi w Manual of standards for diag-

nostic tests and vaccines (1) oraz w Instrukcji G³ównego Lekarza

Weterynarii (13). Dodatkowo ka¿da próbka badana by³a dwoma

testami ELISA, jednym wykrywaj¹cym gatunkowo swoiste prze-

ciwcia³a anty-Cp. psittaci (test A, producent Dr Bommeli), dru-

gim przeciwcia³a wobec immunogennego bia³ka, o masie cz¹-

steczkowej 80-90 kDa, swoistego dla drobnoustroju Cp. abortus

(test B, producent Instytut Pourqieur). £¹cznie przebadano 1333

surowice, pochodz¹ce od wysoko cielnych krów zarówno z ho-

dowli rodzimej, jak i importowanych do Polski. Badania wyko-

nano na terenie 57 powiatów.

Do wykonania preparatów odciskowych, barwionych zgodnie

z metod¹ Stampa przy u¿yciu 10% fuksyny karbolowej, wyko-

rzystano 40 ³o¿ysk pochodz¹cych od krów, które w badaniach

serologicznych zdiagnozowano jako seropozytywne i które tak¿e

poroni³y.

W analizie statystycznej testem c

2

(chi-kwadrat) okreœlono

zgodnoœæ wyników uzyskiwanych dwoma porównywanymi me-

todami, tj. wyniki uzyskane testami ELISA odnoszono do wyni-

ków stwierdzonych w metodzie OWD. Ponadto wyliczono istot-

n¹ (p = 0,00) wartoœæ wspó³czynnika korelacji Pearsona oraz

wspó³czynnika Cramera.

Wyniki i omówienie

Pomimo rosn¹cego w ostatnich latach zainteresowania

infekcjami wywo³anymi przez drobnoustroje z rodzaju

Chlamydophila u zwierz¹t i ich potencja³em zoonotycznym,

w dostêpnym piœmiennictwie generalnie stwierdza siê brak

danych dotycz¹cych statystycznych ocen porównawczych

metod serologicznych, stosowanych w ich diagnostyce –

szczególnie odnosz¹cych siê do badañ urzêdowych, tj. do

technik laboratoryjnych zalecanych przez Miêdzynarodo-

wy Urz¹d ds. Epizootii OIE. W zwi¹zku z tym nale¿y zwró-

ciæ uwagê na fakt, ¿e zaprezentowane badania w³asne s¹

w znacznym zakresie pionierskie i dlatego te¿ trudno jest

znaleŸæ odniesienie w dostêpnym piœmiennictwie facho-

wym do stwierdzonych w nich zale¿noœci. Wiêkszoœæ au-

torów (2, 3, 6, 10, 20), podejmuj¹c próby porównywania

wyników uzyskiwanych metodami serologicznymi, ogra-

nicza siê bowiem jedynie do obliczenia procentowych za-

le¿noœci stwierdzonych pomiêdzy nimi.

W badaniach w³asnych, wykonanych metod¹ OWD, jak

i testami ELISA, 1333 surowic wyniki pozytywne stwier-

dzono u 257 zwierz¹t, co stanowi³o 19,3%. Do analizy sta-

tystycznej wybrano losowo surowice pochodz¹ce od 93

zwierz¹t, zdiagnozowanych jako pozytywnie oraz negatyw-

Tab. 1. Powtarzalnoœæ wyników stwierdzona w zastosowanych

testach (n-93)

w

ó

t

s

e

t

h

c

y

n

a

w

o

s

o

t

s

a

z

e

i

n

a

n

w

ó

r

o

P

³

a

iz

d

u

y

w

o

t

n

e

c

o

r

p

i

a

b

z

c

i

L

o

m

a

s

k

a

t

h

c

y

c

¹

j

u

g

a

e

r

t

¹

z

r

e

i

w

z

h

c

a

t

s

e

t

h

c

y

n

a

w

y

n

w

ó

r

o

p

w

D

W

O

A

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

6

7

%

2

7

,

1

8

D

W

O

B

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

0

6

%

2

5

,

4

6

A

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

B

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

1

5

%

4

8

,

4

5

B

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

,

A

t

s

e

t

–

A

S

I

L

E

,

D

W

O

7

4

%

4

5

,

0

5

Objaœnienia: neg – negatywny, poz – pozytywny, Ks – kontrola surowicy, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 – kolejne rozcieñczenia badanych

surowic

Tab. 2. Przyk³adowy rozk³ad mian przeciwcia³ anty-Chlamydophila spp. stwierdzony w metodzie OWD i wartoœci gêstoœci

optycznej (OD) uzyskane w testach ELISA badanych surowic

D

W

O

)

A

(

A

S

I

L

E

t

s

e

T

)

B

(

A

S

I

L

E

t

s

e

T

i

g

a

w

U

s

K

4

/

1

8

/

1

6

1

/

1

2

3

/

1

4

6

/

1

k

i

n

y

W

æ

œ

o

tr

a

W

D

O

k

i

n

y

W

æ

œ

o

tr

a

W

D

O

k

i

n

y

W

–

*

æ

œ

o

n

l

a

z

r

a

t

w

o

p

w

ó

k

i

n

y

w

A

t

s

e

t

–

D

W

O

–

*

*

æ

œ

o

n

l

a

z

r

a

t

w

o

p

w

ó

k

i

n

y

w

B

t

s

e

t

–

D

W

O

–

*

*

*

æ

œ

o

n

l

a

z

r

a

t

w

o

p

w

ó

k

i

n

y

w

B

t

s

e

t

–

A

t

s

e

t

–

*

*

*

*

e

i

k

t

s

y

z

s

w

i

k

i

n

y

w

e

w

o

k

a

n

d

e

j

–

–

–

–

–

–

g

e

n

8

,

9

2

g

e

n

3

,

5

1

–

g

e

n

*

*

*

*

–

+

+

+

+

+

g

e

n

2

,

2

1

g

e

n

5

,

4

1

–

g

e

n

*

*

*

*

–

–

–

+

+

+

g

e

n

1

,

9

2

g

e

n

2

1

g

e

n

*

*

*

*

–

+

3

+

3

+

2

+

2

+

s

o

p

7

,

7

7

s

o

p

3

,

3

1

g

e

n

*

–

+

2

+

2

+

2

+

2

+

s

o

p

6

,

0

6

s

o

p

9

,

4

2

g

e

n

*

–

–

–

+

+

+

g

e

n

0

,

1

1

g

e

n

5

4

g

e

n

*

*

*

*

–

–

+

+

+

+

g

e

n

8

9

,

7

g

e

n

4

,

5

g

e

n

*

*

*

*

–

+

4

+

4

+

3

+

3

+

2

s

o

p

5

8

1

s

o

p

9

,

8

3

g

e

n

*

–

–

–

+

+

+

g

e

n

7

,

8

5

s

o

p

4

0

3

s

o

p

*

*

*

–

–

–

+

+

+

g

e

n

2

,

7

8

s

o

p

9

,

3

8

s

o

p

*

*

*

–

+

3

+

–

–

–

g

e

n

1

,

7

4

s

o

p

9

,

1

g

e

n

*

*

–

+

3

+

2

–

–

–

g

e

n

9

,

6

8

s

o

p

0

1

1

–

g

e

n

*

*

–

+

4

+

3

+

2

+

2

–

s

o

p

5

,

8

4

s

o

p

4

,

9

9

s

o

p

*

*

*

*

Medycyna Wet. 2006, 62 (7)

806

nie reaguj¹ce. Analizê wyników uzyskanych poszczegól-

nymi testami przedstawiono w tab. 1, a ich przyk³adowe

zestawienie w tab. 2.

Analizuj¹c uzyskane wartoœci nale¿y podkreœliæ, ¿e naj-

wiêksz¹ powtarzalnoœæ wyników (81,72%) wykazano

w przypadku zastosowania metody OWD i ELISA – test A,

wykrywaj¹cego przeciwcia³a specyficzne tylko dla Cp. psit-

taci. W metodzie OWD wykorzystano antygen grupowo

swoisty, wykrywaj¹cy swoiste przeciwcia³a zarówno wo-

bec Cp. psittaci, jak i Cp. abortus. Mo¿na domniemaæ, ¿e

w takich przypadkach mamy do czynienia z nosicielstwem

b¹dŸ z infekcj¹ uogólnion¹. U krów tych nie odnotowano

bowiem ronieñ, a w badaniu bakterioskopowym pochodz¹-

cych od nich ³o¿ysk nie stwierdzono cia³ek elementarnych

(EB) chlamydofil. W odniesieniu do testu ELISA z anty-

genem Cp. psittaci podobne zale¿noœci wykazane zosta³y

przez Hoelzla i wsp. oraz Stepaneka i wsp. (8, 21). Celem

wyeliminowania wyników fa³szywie ujemnych, odnosz¹-

cych siê do postaci rozrodczej chlamydofilozy byd³a, w ba-

daniach serologicznych autorzy ci sugeruj¹ koniecznoœæ

zastosowania zestawów zawieraj¹cych antygen biwalent-

ny, tj. taki, który ma zdolnoœæ wykrywania przeciwcia³ swo-

istych dla Cp. psittaci, jak i Cp. abortus.

W przeprowadzonej analizie statystycznej, test c

2

(na

poziomie istotnoœci p = 0,00) wykaza³ du¿¹ zgodnoœæ wy-

ników porównywanych testów. Jego wartoœæ wynios³a

37,31 i da³a podstawy do wysuniêcia twierdzenia, ¿e po-

równywane metody s¹ zale¿ne i daj¹ istotnie zgodne wy-

niki. Ponadto okreœlono wspó³czynnik korelacji liniowej

Pearsona. Jego wartoœæ wynios³a 0,6572. Dla tablicy 2 × 2,

zawiera siê ona w przedziale pomiêdzy 0 a 0,707 i okreœla

stopieñ zale¿noœci porównywanych metod. Im bli¿ej zera

znajduje siê jego wartoœæ, tym zale¿noœæ jest s³absza, nato-

miast im bli¿ej 0,707, tym zale¿noœæ jest silniejsza. Podob-

n¹ sytuacjê stwierdzono w przypadku wspó³czynnika Cra-

mera, którego wartoœæ, w przedziale od 0 do 1, wynios³a

równie¿ 0,6572.

Nastêpnie zbadano zale¿noœæ pomiêdzy metod¹ OWD

i ELISA – test B, za pomoc¹ którego wykrywa siê swoiste

przeciwcia³a dla immunogennego bia³ka, wystêpuj¹cego

tylko u Cp. abortus. Zosta³a ona okreœlona powtarzal-

noœci¹ wyników wobec 60 surowic, co stanowi³o 64,52%.

Zastosowanie testu ELISA, zdolnego wykrywaæ swoiste

przeciwcia³a wobec Cp. abortus, zalecaj¹ tak¿e inni auto-

rzy (2, 6, 16), sugeruj¹c jednoczeœnie, ¿e mo¿e on stano-

wiæ cenne uzupe³nienie OWD. Zgodnie z danymi piœmien-

nictwa (9, 16, 20), ta postaæ chlamydofilozy objawiaj¹ca

siê zapaleniem dróg rodnych, powoduje znaczne straty eko-

nomiczne i stanowi powa¿ne zagro¿enie dla ludzi (ronie-

nia). W wykonanej analizie statystycznej stwierdzono ni¿-

sz¹ ni¿ poprzednio wartoœæ testu c

2

. W porównaniu tym

wynios³a ona 10,08 przy wspó³czynniku Cramera i Pearso-

na równym 0,540. Wymienione wartoœci funkcji statystycz-

nych daj¹ podstawy do stwierdzenia, ¿e porównywane

metody s¹ zale¿ne i daj¹ istotnie zgodne wyniki. Porówna-

nie dwóch testów ELISA, tj. testu A i B, wyra¿aj¹ce siê

powtarzalnoœci¹ wyników wobec 51 zbadanych surowic,

nie znalaz³o potwierdzenia w analizie statystycznej. War-

toϾ testu c

2

wynosi³a bowiem zaledwie 0,08, przy war-

toœci wspó³czynnika Cramera: 0,0541 i ujemnej wartoœci

wspó³czynnika Pearsona 0,0541. W przypadku tych testów

analiza statystyczna wykaza³a nieistotn¹ zgodnoœæ porów-

nywanych wyników.

Spoœród poddanych szczegó³owej analizie 93 zwierz¹t,

47 reagowa³o pozytywnie, we wszystkich zastosowanych

testach, a 40 z nich, tj. 43,01% poroni³o. W ³o¿yskach po-

chodz¹cych od krów, które poroni³y, stwierdzono cia³ka ele-

mentarne chlamydofil.

Ustalenie zale¿noœci statystycznej pomiêdzy serologicz-

nymi metodami jakoœciowymi a iloœciowymi wymaga nie-

w¹tpliwie dalszych rozszerzonych badañ. Dlatego te¿

stwierdzone w zaprezentowanych badaniach zale¿noœci

nale¿y traktowaæ jako wstêpne. W ramach projektu badaw-

czego „Doskonalenie metod diagnozowania oraz ocena

sytuacji epidemiologicznej chlamydofilozy byd³a w Pol-

sce” – nr 2 PO6K 040 27 dalsze badania z tego zakresu

bêd¹ kontynuowane. Ponadto bêd¹ one uzupe³nione o me-

tody potwierdzaj¹ce – polimerazow¹ reakcjê ³añcuchow¹

i metody hodowlane.

Piœmiennictwo

1.Aitken J. D., Longbottom D.: Enzootic abortion of ewes (owine chlamydiosis),

[w:] Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. Off. Internat. Epizoot.

Paris 2004, 635-641.

2.Borel N., Doherr M. G., Vretou E., Psarrou R., Thoma R., Pospischil A.: Sero-

prevalences for ovine enzootic abortion in Switzerland. Prev. Vet. Med. 2004, 65,

205-216.

3.Buendia A. J., Cuello F., Del Rio L., Caro M., Salinas J.: Field evaluation of a new

commercially available ELISA based on a recombinant antigen for diagnosing

Chlamydophila abortus. Vet. Microbiol. 2001, 78, 229-239.

4.Daniel R. G., Holliman A., Davig G. P., Kirby F. D., Simpson V. R., Cranwell M. P.,

Dawson M., Griffitsh P. C., Bevan B. J.: Bovine chlamydiosis in the United King-

dom. Vet. Rec. 1993, 133, 351-352.

5.Deptu³a W., Pawlikowska M., Travnicek M.: Chlamydofilozy u zwierz¹t i ludzi.

Medycyna Wet. 2002, 58, 337-340.

6.Entrican G., Buxton D., Longbottom D.: Chlamydial infection in sheep: immune

control versus fetal pathology. J. R. Soc. Med. 2001, 94, 273-277.

7.Everett K. D. E., Bush R. M., Andersen A. A.: Emended description of the order

Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam.

nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chla-

mydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the

identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999, 49, 415-440.

8.Hoelzle L., Hoelzle K., Wittenbrink M.: Recombinant major outer membrane pro-

tein (MOMP) of Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, and Chlamy-

dia suis as antigens to distinguish chlamydial species-specific antibodies in ani-

mal sera.Vet. Microbiol. 2004, 103, 85-90.

9.Jee J., Degraves F., Kim T., Kaltenboeck B.: Hight prevalence of natural Chlamy-

dophila species infection in calves. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 5664-5672.

10.Johnson F. W. A., Clarkson M. J., Spencer W. N.: Direct isolation of the agent of

enzootic abortion of ewes (Chlamydia psittaci) in cell cultures. Vet. Rec. 1988,

113, 413-414.

11.Jones G. E., Low J. C., Machell J., Armstrong K.: Comparison of five tests for the

detection of antibodies against chlamydial (enzootic) abortion of ewes. Vet. Rec.

1997, 141, 164-168.

12.Niemczuk K.: Chlamydiozy/chlamydofilozy jako zoonozy – diagnostyka laborato-

ryjna. Monografia PIWet-PIB, Pulawy 2004, 1-82.

13.Niemczuk K.: Instrukcja nr 42/2003 G³ównego Lekarza Weterynarii, z dnia

25 czerwca 2003 r., dotycz¹ca przeprowadzania serologicznej diagnostyki chla-

mydiozy byd³a z wykorzystaniem mikrometody odczynu wi¹zania dope³niacza

(OWD). Nr GIWzVII.420/lab – 19/2003.

14.Niemczuk K., Truszczyñski M.: Klasyfikacja bakterii ze szczególnym uwzglêdnie-

niem reklasyfikacji rodziny Chlamydiaceae. Medycyna Wet. 2003, 59, 27-30.

15.Niemczuk K., Truszczyñski M.: Pathogenicity of the microorganisms of the family

Chlamydiaceae respecting the changes in their classification. P. J. Vet. Sci. 2002,

5, 99-102.

16.Pospischil A., Thoma R., Hilbe M., Grest P.: Abortion in humans by Chlamydo-

phila abortus. Schweiz Arch. Tierheilkd. 2002, 144, 463-466.

17.Rodolakis A.: Chlamydiosis in ruminants and the possibbility of human contami-

nation. Rev. Int. Trach. Pathol. Ocul. Trop. Subtrop. Sante. Publique. 1982, 2,

31-41.

18.Rzedzicki J., Tokarzewski S.: Ptaki jako potencjalne Ÿród³o zaka¿enia ludzi chla-

mydiami. Medycyna Wet. 2001, 57, 459-463.

19.Sachse K., Gallien P.: Molekularbiologische Nachweis-Methoden ausgewählter

Zoonoseerreger. Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und

Veterinärmedizin – BGVV Hefte, 2000, 2, 29-41.

20.Salti-Montesanto V., Tsoli E., Papavassiliou P., Psarrou E., Markey B. K.,

Jones G. E., Vretou E.: Diagnosis of ovine enzootic abortion, using a competitive

ELISA based on monoclonal antibodies against variable segments 1 and 2 of the

major outer membrane protein of Chlamydia psittaci serotype 1. A. J. Vet. Res.

1997, 58, 228-235.

21.Stepanek O., Jindrichova J., Horacek J., Krpata V.: Chlamydiosis in cattle and in

man: an epidemiologic and serologic study. J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immu-

nol. 2003, 27, 445-459.

Adres autora: dr Krzysztof Niemczuk, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu-

³awy; e-mail: [e-mail]