Ćwiczenie
T: Wykrywanie i oznaczanie liczby bakterii z grupy coli

1. Wykrywanie i oznaczanie liczby bakterii z grupy coli

a) Najbardziej prawdopodobna liczba bakterii z grupy coli w 1 ml
b) Metoda filtrów membranowych. Wskaźnik bakterii z grupy coli.

Bakterie z grupy coli występują w jelicie człowieka oraz wielu gatunków zwierząt. Obecność
i stopień zanieczyszczenia fekalnego jest ważnym wskaźnikiem w ocenie jakości wody.
Ponieważ zdolność niektórych bakterii z grupy coli do przeżycia w wodzie jest ograniczona
ich obecność i liczba może służyć do oceny świeżego zanieczyszczenia kałowego wody.

Bakterie grupy coli:



G(-)



Oksydazoujemne



Tlenowe i względnie beztlenowe



Zdolność do wzrostu w obecności soli żółci



Zdolność do rozkładu i fermentacji laktozy



Zdolność do rozkładu mannitolu do aldehydu i gazu w czasie 48h inkubacji w temp

37°C

Bakterie grupy coli termotolerancyjne to bakterie z grupy coli wykazujące właściwości
biochemiczne jw. ale podczas inkubacji w 44°C.

Domniemane Escherichia coli to bakterie grupy coli termotolerancyjne, wytwarzające indol z
tryptofanu.

Domniemane E.coli uznaje się za E. coli gdy:



mają zdolność do redukcji czerwieni metylowej i



dekarboksylacji kw. L – glutaminowego



brak zdolności do wytwarzania acetylometylo karbinolu



brak zdolności do wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla



brak wzrostu w obecności cyjanku potasu

Bakterie z grupy coli:

a) E. coli
b) Citrobacter sp.
c) Enterobacter sp.
d) Klebsiella sp.

I.

NPL bakterii z grupy coli w 1 ml próby

Do badania używamy pożywki z siarczanem laurylowym, laktozą i rurką Durhama
Siarczan laurylowy – hamuje rozwój G(+)

1. Wykonujemy rozcieńczenia badanej próby w postępie dziesiętnym

2. Na podłoże posiewamy próbę wody w systemie trójkowym tzn.



posiewa się po 10 ml wyjściowej próby wody do 3 kolbek (w każdej 10

ml podwójnie stężonego podłoża)



posiewa się po 1 ml wyjściowej próby do 3 probówek (w każdej 10 ml

standardowego podłoża)



posiewa się po 1 ml rozcieńczenia 10

-1

do 3 probówek (w każdej 10 ml

standardowego podłoża)



posiewa się po 1 ml rozcieńczenia 10

-2

do 3 probówek (w każdej 10 ml

standardowego podłoża)



posiewa się po 1 ml rozcieńczenia 10

-3

do 3 probówek (w każdej 10

ml standardowego podłoża)

3. Inkubacja prób w 37 °C przez 24-48h.

Jako próbę dodatnią uznaje się probówkę z widocznym zmętnieniem oraz
gazem w rurce Durhama.

4. Próby „+” posiewa się na odpowiednio przyporządkowane podłoża

potwierdzające (na 1 probówkę z próbą „+” przypada jedno podłoże
potwierdzające).

Podłoże potwierdzające:
Laktoza, rurka Durhama
Żółć – czynnik wybiórczy
Zieleń brylantowa – hamuje rozwój G(+)

5. Każdemu rozcieńczeniu przyporządkowujemy liczbę prób dodatnich z

podłoży potwierdzających. Wyznaczamy liczbę składającą się z 3 cyfr
według następujących zasad:

1) Pierwsza cyfra odpowiada największemu rozcieńczeniu dającemu wyniki dodatnie w 3

probówkach oraz dwa kolejne większe rozcieńczenia (czyli próbki o mniejszej
koncentracji)

Przykład 1

2) Jeżeli wykonano niewystarczającą liczbę rozcieńczeń ponad największe rozcieńczenie

dające wynik „+” w 3 probówkach, należy wybrać 3 największe rozcieńczenia serii (tj.
takie, które zawierają najniższą koncentrację próbki).

Przykład 2

3) Jeżeli nie ma rozcieńczenia z maksymalną liczbą prób dodatnich pod uwagę bierzemy

3 największe rozcieńczenia z wyjątkiem sytuacji opisanych poniżej w pkt. 4.

Przykład 3

4) W przypadku, gdzie 2 z 3 rozcieńczeń wybranych na podstawie pkt 1), 2) i 3) nie daje

wyników dodatnich należy wybrać najniższe rozcieńczenie (największe stężenie) nie
dające wyniku „+” (czyli 0) i dwa poprzednie rozcieńczenia (czyli próbki o wyższej
koncentracji).

Przykład 4
Przykład 5
Dopuszczalna jest sytuacja w przykładzie 6, gdzie jedyna próba dodatnia znajduje się na 1
pozycji.

10 ml

1 ml

10

-1

ml

10

-2

ml

10

-3

ml

Przykład 1

3

3

2

1

0

Przykład 2

3

3

3

0

Przykład 3

2

2

1

1

0

Przykład 4

3

3

0

0

0

Przykład 5

2

2

0

1

0

Przykład 6

1

0

0

0

0

6. Porównujemy naszą liczbę z tablicami i odczytujemy wynik.

7. Wynik odczytany z tablic mnożymy przez odwrotność rozcieńczenia

odpowiadającego pierwszej z cyfr wyznaczonej liczby oprócz sytuacji,
gdzie 1 cyfra odpowiada posiewowi 10 ml próby na 10 ml podwójnie
stężonego podłoża. Wówczas odczytany z tablic wynik najpierw dzielimy
przez 10.

Końcowy wynik to NPL bakterii z grupy coli w 1 ml.

II.

Metoda filtrów membranowych dla bakterii z grupy coli

Wykonuje się identycznie jak w przypadku metody filtrów membranowych dla ogólnej liczby
bakterii ale nie stosujemy szeregu optymalnego (tzn. bierzemy pod uwagę nawet 1 bakterię i
powyżej 96).
Drugą różnicą jest typ stosowanego podłoża. W tym wypadku stosujemy podłoże o
następującym składzie:
Laktoza
Błękit bromotymolowy – wskaźnik
Tergitol – zahamowanie wzrostu G(+)
TTC (chlorek trifenylo tetrazolu) – zahamowanie wzrostu G(+)

1. Określoną objętość wody sączymy przez filtr, który umieszcza się na powierzchni

podłoża opisanego wyżej. [0,1 ml; 1 ml; 10 ml]

2. Inkubacja 24 h w temp 37°C
3. Liczymy kolonie. Pod uwagę bierzemy kolonie o barwie żółtej lub czerwonej lub

pomarańczowej, które tworzą żółtą strefę (żółte halo) na podłożu pod filtrem.

Bakterie z grupy coli termotolerancyjne to kolonie o barwie j.w, które obserwujemy po
inkubacji w temp. 44°C.

4. Aby potwierdzić wynik badań posiewa się próby dodatnie na wodę peptonową z

laktozą i rurką Durhama. Inkubacja 48 godzin w temp 37°C. Pojawienie się gazu
potwierdza obecność bakterii z grupy coli.

Aby potwierdzić obecność bakterii z grupy coli termotolerancyjnych i domniemanych E. coli
kolonie o cechach j.w przesiewa się na wodę peptonową z laktozą, tryptofanem i rurką
Durhama. Inkubuje się 24 h w temp 44 °C i dodaje do próby odczynnik Kovacsa. Obecność
gazu w rurce potwierdza występowanie bakterii grupy coli termotolerancyjnych.

Pojawienie się czerwonego pierścienia w próbie potwierdza obecność domniemanych E. coli.

Obliczamy wskaźnik grupy coli

WSKAŹNIK = liczba kolonii (dodatnich, potwierdzonych) x 100

objętość przefiltrowanej wody

Wskaźnik = liczba bakterii grupy coli w 100 ml próby