Laboratorium mikrobiologiczne
Cel ćwiczenia
• Zapoznanie się z regulaminem ćwiczeń
• Poznanie podstawowego szkła i sprzętu
mikrobiologicznego i sposobów sterylizacji
• Zapoznanie się rodzajami i sposobem
przygotowywania podłoży mikrobiologicznych oraz
metodami hodowli mikroorganizmów
• Mikroskopy stosowane w badaniach
mikrobiologicznych
Podstawowe szkło
• Probówki bakteriologiczne (probówki Falcone)
• Płytki (szalki) Petriego
• Kolby Roux (inne butelki)
• Kolby Erlenmayera
Sprzęt do szczepienia
• Igła bakteriologiczna
• Eza bakteriologiczna
• Głaszczka Drygalskiego
• Palnik
Sprzęt do hodowli
• Termostat
• Wytrząsarka
Sprzęt do sterylizacji
• Suszarka do sterylizacji szkła
• Autoklaw do sterylizacji podłoży
Metody sterylizacji
• Fizyczne
• Chemiczne
Metody fizyczne
• Wysoka temperaturą (sucha – wyżarzanie,
opalanie, gorące powietrze i parą wodną –
dekoktacja, pasteryzacja, tyndalizacja, para wodna
pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizacja)
• Promienie elektromagnetyczne: UV, radiacyjne
(jonizujące)
• Sączenie
Metoda chemiczna
• Sterylizacja gazowa (tlenek etylenu w mieszaninie
CO
2
, beta-propiolakton, ozon i chlor, fluor –woda)
Kontrola sterylizacji
• Sporotesty (sporal A do autoklawów, sporal S do
suszarek np. stericon plus Bioindicator do
autoklawu zawiera przetrwalniki
Geobacillus
stearothermophilus
w fiolce 2 ml). Po
autoklawowaniu ampułki inkubuje się 48 godz. w
temp. 60± 2
o
C. Nie wysterylizowane jako kontrola.
Jeśli kolor pozostanie czerwono-fioletowy to
sterylizacja poprawna.
Dezynfekcja
• Środki chemiczne (kwasy, zasady, środki
utleniające, alkohole, aldehydy, związki fenoli i ich
pochodne, związki powierzchniowo czynne,
jodofory, chloroheksydyna, sole metali ciężkich)
• Kontrola skażenia powierzchni i powietrza
drobnoustrojami
Zastosowanie podłoży mikrobiologicznych
• Izolacja
• Różnicowanie
• Identyfikacja
• Namnażanie
• Określenie właściwości fizjologicznych,
biochemicznych i hodowlanych
Rodzaje podłoży ze względu na zawartość
składników odżywczych
• Minimalne
• Pełne
• Wzbogacone
Rodzaje podłoży ze względu na skład
chemiczny
• Naturalne
• Półsyntetyczne
• Syntetyczne
Rodzaje podłoży ze względu na konsystencję
• Stałe (zaw. 1,5-2,0% agaru)
• Półpłynne (0,1-0,7 agaru)
• Płynne
• Agar - uniwersalny środek zestalający pożywki
mikrobiologiczne (z morskich krasnorostów
Selidum amansi
)
• Żelatyna (produkt hydrolizy kolagenu)
Rodzaje podłoży ze względu na przeznaczenie
i zastosowanie
• Namnażające
• Wybiórcze
• Namnażająco-wybiórcze
• Izolacyjne
• Różnicujące (identyfikacyjne, diagnostyczne)
• Podłoża „transportowe”
Metody hodowli
•Ze względu na rodzaj podłoża:
- hodowle płynne
- hodowle na podłożu stałym
Hodowle płynne
• W probówkach
• W kolbach
• W butlach
• W fermentorach
Fermentory
Hodowle na podłożach stałych
• Na płytkach Petriego
• Słupkach
• Skosach
• W butlach
Ze względu na czas hodowli oraz dostęp
składników pokarmowych
• Hodowle okresowe (zamknięte) – czynniki
ograniczające to wyczerpanie składników
pokarmowych, nagromadzenie metabolitów i zmiana
równowagi jonowej (głównie pH)
• Hodowle otwarte (ciągłe) – ciągła kontrola zużycie
substancji odżywczych, przyrost liczby i masy
drobnoustrojów oraz stężenie metabolitów
• Hodowle zsynchronizowane – wszystkie osobniki
dzielą się jednocześnie (w tym samym czasie)
Ze względu na stosunek bakterii do tlenu
• Hodowle tlenowców
• Hodowle beztlenowców
Hodowle tlenowców
• Hodowle powierzchniowe
• Hodowle wgłębne (wytrząsarki, fermentory)
Hodowle beztlenowców
• Metody fizyczne (warstwa oleju parafinowego, słój
próżniowy, hodowla w atmosferze gazu obojętnego,
przy użyciu zestawu np. „Gas-Pak”)
• Metody chemiczne (podłoża zawierające
substancje chemiczne absorbujące tlen np.
pirogallol, chlorek miedziowy lub związki chemiczne
obniżające potencjał oksydo-redukcyjny np. kwas
askorbinowy, siarczyn sodowy)
• Metody biologiczne – hodowla na tym samym
podłożu tlenowca i beztlenowca
Mikroskopy do obserwacji mikrobiologicznych
• Świetlny
• Z ciemnym polem widzenia
• Kontrastowo-fazowy
• Ultrafioletowy
• Fluorescencyjny
• Polaryzacyjno-interferencyjny
• Elektronowy transmisyjny
• Skaningowy
Mikroskop świetlny
• Najważniejsze pojęcia dla mikrobiologa to powiększenie
mikroskopu i zdolność rozdzielcza
• Powiększeniem mikroskopu to stosunek obrazu pozornego A
”
,
który widzimy w mikroskopie do wielkości przedmiotu
(iloczyn powiększenia okularu i powiększenia obiektywu)
• Zdolność rozdzielcza (najmniejsza odległość pomiędzy
dwoma punktami, przy której widzimy je w mikroskopie
oddzielnie)
• Olejek immersyjny pozwala zwiększyć zdolność rozdzielczą
mikroskopu do 0,19 mikrometra zwiększając aperturę
liczbową obiektywu (suchy – 0,3 mikrometra, „wodny” – 0,24
mikrometra)
• Zastosowanie odpowiednich filtrów lub światła UV może
zwiększyć zdolność rozdzielczą do 0,17 mikrometra
Mikroskop z ciemny polem widzenia
• Pole widzenia ciemne, a obserwowane obiekty –
jasne (kondensor ciemnego pola)
• Stosowany olejek immersyjny (górna soczewka
kondensora a dolna pow. preparatu)
• Zdolność rozdzielcza podobna jak w mikroskopie
świetlnym
• Obserwacje żywych bakterii
krętki
Mikroskop kontrastowo-fazowy
• Bezbarwne obiekty fazowe (przezroczyste)
przekształcane są w obiekty amplitudowe
powodujące zmiany natężenia światła widoczne dla
oka przy zastosowaniu płytki fazowej
• Umożliwia obserwacje żywych bakterii a w
szczególności ich ruchu (bez wybarwiania)
komórki
drożdży
Mikroskop ultrafioletowy
• Stosowane są lampy rtęciowo-kwarcowe
• Poprzez zastosowanie światła UV ( o krótszej fali)
zwiększona została zdolność rozdzielcza do 0,1
mikrometra
dwie kolonie
Streptomyces sp.
Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)
• Wykorzystywane zjawisko pobudzania świecenia
preparatów oświetlanych promieniami
ultrafioletowymi po wybarwieniu fluorochromami
(barwniki wysyłające światło o długiej fali po
wzbudzeniu promieniami UV) np. erytrozyną,
oranżem akrydynowym, rodaminą
bakterie
z fluoryzującym
na zielono
białkiem
Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny
• Służy do obserwacji przezroczystych i
pochłaniających światło obiektów
• Zastosowany pryzmat, polaryzator i analizator
• Oglądany przedmiot robi wrażenie przestrzennego
Inne mikroskopy
• Mikroskop elektronowy – transmisyjny (wykorzystywane są
trzy elektromagnesy i wiązka elektronów a obraz
przekazywany jest na ekran lub kliszę fotograficzną),
zdolność rozdzielcza 4-10 Å, siatki platynowe zamiast
szkiełka podstawowego, preparaty bardzo cienkie do 0,5
mikrometra, obraz trójwymiarowy
• Mikroskop skaningowy (elektrony przechodzą przez cały
preparat a powstały obraz może być fotografowany lub
obserwowany na monitorze) obraz trójwymiarowy, zdolność
rozdzielcza 0,02 mikrometra, obserwacja bakterii i ich
penetracji w komórkach gospodarza
Obrazy z mikroskopu transmisyjnego
Salmonella sp.
pączkujące drożdże(przekrój)
Obrazy z mikroskopu skaningowego
Enterococcus faecalis
Bacillus anthrax
Typ mikroskopu
Oświetlenie
preparatu
Obraz
Zdolność
rozdzielcza
Powiększenia
świetlny
światło
widzialne
światło widzialne
(okular)
0.2 μm
5–1 500 x
fluorescencyjny
ultrafiolet
światło widzialne
(okular)
0.2 μm
5–1 500 x
elektronowy
transmisyjny
strumień
elektronów
światło widzialne
(ekran fluoresc.)
0.2- 1 nm
1000-500 000
elektronowy
skaningowy
strumień
elektronów
elektroniczny
(monitor)
3-10 nm
100-50 000 x
tunelowy
prąd
elektryczny
elektroniczny
(monitor)
001-0.1 nm
10 000 000 x