ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
ANALIZA DNA
W ŻELACH AGAROZOWYCH
W ŻELACH AGAROZOWYCH
W ŻELACH AGAROZOWYCH
W ŻELACH AGAROZOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
I POLIAKRYLAMIDOWYCH
Katedra Genetyki Molekularnej
Elektroforeza kwasów
nukleinowych
Metoda rozdzielania molekuł w polu elektrycznym na podstawie ich wielkości,
kształtu i ładunku.
jedna z głównych metod identyfikacji,
rozdzielania i oczyszczania kwasów
nukleinowych
stosowana zarówno w celach
analitycznych, jak i preparatywnych
Elektroforeza analityczna
Zastosowanie:
a) Ustalenie wielkości fragmentu DNA lub RNA na podstawie porównania tempa
migracji badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych
b) Ustalenie ilości preparatu na podstawie porównania intensywności
fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego
fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego
c) Identyfikację ewentualnej degradacji preparatu. Degradacja widoczna jest na
żelu w postaci smugi, która jest wynikiem rozpadu DNA lub RNA na mniejsze
fragmenty
d) Identyfikację zanieczyszczeń obecnych w preparacie.
Elektroforeza preparatywna
Umożliwia izolację z żelu tej części
preparatu, którą zamierzamy użyć
do dalszych etapów badań 
do dalszych etapów badań 
stosujemy wówczas elucję z żelu.
Migracja w żelach
elektroforetycznych
W polu elektrycznym przy lekko
zasadowym pH ujemnie naładowane
cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku
cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku
elektrody (+) anody i przeciskając się przez
pory żelu rozdzielają się pod względem
wielkości.
duże cząsteczki wędrują wolniej niż małe
Rodzaje żeli
elektroforetycznych
żele poliakrylamidowe  stosuje się do rozdziałów mniejszych fragmentów
DNA (5-2000 pz).
Elektroforeza przeprowadzona we własciwych warunkach umożliwia
rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego
rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego
nukleotydu
żele agarozowe  można w nich rozdzielać znacznie większe cząsteczki
kwasów nukleinowych (50  30000 pz)
Nie umożliwiają uzyskania tak wysokiej rozdzielczości jak żele
poliakrylamidowe
Elektroforeza w żelach
poliakrylamidowych
śel poliakrylamidowy powstaje w wyniku
polimeryzacji N,N metylenobisakrylamidu z
monomerami akrylamidu w obecności wolnych
rodników dostarczanych przez nadsiarczan
amonu (APS) i stabilizowanych przez TEMED
(N, N, N , N - tetrametylenodiamina).
Rozdzielczość żeli zależy od
stężenia poliakrylamidu
Stę\
enie poliakrylamidu [%] Zakres długości rozdzielanego
liniowego DNA (kpz)
3,5 1000-2000
5,5 80-500
8,0 60-400
12,0 40-200
15,0 25-150
20,0 6-100
Elektroforeza w żelach
poliakrylamidowych
Elektroforeza w żelach
agarozowych
Agaroza  frakcja agaru oczyszczona z
krasnorostów, polisacharyd zbudowany z
około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy
Wielość porów żelu agarozowego zależy od
stężenia agarozy i określa zakres wielkości
stężenia agarozy i określa zakres wielkości
rozdzielanego DNA lub RNA
Wadą elektroforezy agarozowej jest słaba
rozdzielczość frakcji DNA różniącego się
poniżej 5% wielkości.
Stężenie agarozy i zakres
rozdzielanych fragmentów DNA
Stę\
enie agarozy [%] Zakres długości rozdzielanego
liniowego DNA (kpz)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Elektroforeza w żelach
agarozowych
Bufory elektroforetyczne
Bufory elektroforetyczne
Lp. Nazwa buforu Stężenie robocze Stężenie roztworu wyjściowego (składniki na 1
litr)
1 Tris - octan (TAE) 1x: 0.04M Tris - octan, 50x: 242g Tris base,
0.001M EDTA 57.1 ml lodowatego kwasu octowego,
100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
2 Tris - fosforan (TPE) 1x: 0.09M Tris - fosforan, 10x: 108g Tris - base,
0.002M EDTA 15.5 ml 85% kwasu fosforowego
3 Tris - boran (TBE) 0.5x: 0.045M Tris - boran, 5x: 54gTris - base,
0.001M EDTA 27.5g kwasu bornego,
20 ml 0.5M EDTA pH 8.0
4 Alkaliczny 1x: 50mM NaOH, 10x: 5ml 10N NaOH,
1mM EDTA 2ml 0.5M EDTA pH 8.0
Markery wielkości
Wzorce o znanej wielkości mas
cząsteczkowych słu\
ące do określenia
wielkości analizowanych fragmentów DNA
bądz
RNA
odpowiednio przygotowane fragmenty DNA
odpowiednio przygotowane fragmenty DNA
powstające w wyniku hydrolizy DNA faga
lambda lub plazmidów enzymami
restrykcyjnymi EcoRI i HindIII
syntetyczne DNA o określonych wielkościach
fragmentów
Barwienie żeli
Metody wizualizacji kwasów
nukleinowych:
barwienie bromkiem etydyny
barwienie srebrem
SYBR Green
radioaktywnymi izotopami (siarki lub
fosforu)
Bromek etydyny
Bromek etydyny interkaluje pomiędzy
sąsiednie pary zasad dwuniciowego DNA.
Stwierdzono także większe powinowactwo
bromku do dwuniciowego DNA (dsDNA)
niż do jednoniciowego (ssDNA), przez co
barwienie struktur jednoniciowych w
barwienie struktur jednoniciowych w
niektórych sytuacjach może okazać się
niewystarczające.
Kompleks bromek etydyny /DNA może być
łatwo uwidoczniony fluorescencyjnie w
świetle UV.
Bromek etydyny jest silnym
Stężenie bromku etydyny 5�g/ml
mutagenem!
Wykonanie ćwiczeń
Elektroforeza w \
elu agarozowym
1) Przygotować 2% \
el agarozowy w buforze TAE . Nawa\
kę agarozy rozpuścić w TAEx1, podgrzać
do temperatury 100�C, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów. Ostudzić
przygotowany roztwór.
2) Wlać roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z
umocowanym grzebieniem formującym studzienki do nanoszenia próbek.
3) Po zastygnięciu agarozy zalać \
el buforem elektroforetycznym TAEx1, powierzchnia buforu
powinna znajdować się około 1 cm ponad górną powierzchnią \
elu. Powoli wyjąć grzebień, tak
aby nie uszkodzić studzienek \
elu.
4) Wymieszać w probówce eppendorfa 10 �l wcześniej przygotowanego roztworu DNA i 2�l buforu
obcią\
ającego, dokładnie wymieszać, całość nanieść na \
el.
5) Podłączyć elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
6) Elektroforezę prowadzić przez 1 godz. przy napięciu 80 V.
7) Po zakończeniu elektroforezy \
el wybarwić w bromku etydyny (5�g/ml) około 5 min
8) śel obejrzeć w świetle UV = 320 nm.
Elektroforeza w \
elu poliakrylamidowym
1) Przygotować 8% roztwór akrylamidu (stę\
enie wyjściowe 30%) w buforze TBEx1
2) Umyte i odtłuszczone płyty szklane zło\
yć (wkładając pomiędzy nie uszczelkę), całość
przymocować klipsami do podstawki do wylewania \
elu.
3) Wlać roztwór akrylamidu do momentu wypełnienia całej powierzchni pomiędzy płytami.
4) Wło\
yć grzebień. Polimeryzacja \
elu trwa 30 min, po spolimeryzowaniu wyjąć uszczelkę, umieścić
płyty w aparacie do elektroforezy.
5) Napełnić aparat buforem TBEx1. Wyjąć grzebień, przepłukać studzienki buforem
elektroforetycznym.
6) Przygotowane wcześniej próbki DNA zmieszać z buforem obcią\
ającym (15 �l DNA + 3 �l buforu
obcią\
ającego) i nanieść do studzienek.
7) Do jednej studzienki nanieść 3 �l markera (100 bp).
8) Podłączyć elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
9) Elektroforezę prowadzić przez 1,5 godz. przy napięciu 80 V/120 mA
10) Po zakończeniu elektroforezy \
el wybarwić w bromku etydyny (5�g/ml) przez około 5 min
11) śel obejrzeć w świetle UV = 320 nm.