SKA
AD I WA
AŚCIWOŚCI PA
YNÓW USTROJOWYCH  KREW
Na ćwiczeniach obowiązuje znajomość:
" zasad metod analizy składu (w tym ogólnej zasady metod kolorymetrycznych analizy
chemicznej) i właściwości krwi (zakres wykonywanych ćwiczeń podany jest w części
praktycznej materiałów; z częścią metodyki wykonywania ćwiczeń należy zapoznać się na
podstawie skryptu  rozdział Fizjologia krwi s. 116-130)
" pojęć: elementy morfotyczne krwi, osocze, surowica, hematokryt, MCV, MCH, MCHC,
niedokrwistość i jej rodzaje, rozmaz krwi, grupa krwi, antygen (aglutynogen), przeciwciało
(aglutynina), aglutynacja, czas krwawienia, czas krzepnięcia, spektrofotometr, światło
monochromatyczne, absorbancja, albuminy, globuliny, hemoglobina, denaturacja białka,
mocznik, kreatynina, cholesterol, lipoproteiny i ich frakcje, transferyna
" czynników pokarmowych wpływających na skład i właściwości krwi (stan odżywienia,
spożycie białka, Fe, witamin, wody)
 SKA
AD I WA
AŚCIWOŚCI PA
YNÓW USTROJOWYCH  KREW
Celem ćwiczeń jest poznanie:
1. wybranych metod analizy ilościowej składników chemicznych (nieorganicznych i organicznych)
krwi (Fe, białko ogółem, albuminy, hemoglobina, mocznik, cholesterol)
2. podstawowych właściwości wybranych składników organicznych (białek)
3. metod różnicowania i oznaczania ilościowego elementów upostaciowanych (komórkowych,
morfotycznych) krwi
4. podstawowych parametrów układu krzepnięcia (czas krwawienia, czas krzepnięcia) oraz
właściwości serologicznych (grupa krwi)
a tym samym składu, właściwości i funkcji krwi oraz
5. roli badania morfologicznego i biochemicznego krwi w ocenie stanu zdrowia, w tym stanu
odżywienia organizmu.
CZ
ŚĆ TEORETYCZNA
Krew w ustroju człowiek spełnia wiele istotnych funkcji. Jest łącznikiem pomiędzy wszystkimi
komórkami organizmu, bierze udział w przenoszeniu gazów oddechowych: tlenu z płuc do tkanek oraz
dwutlenku węgla z tkanek do płuc, bierze udział w przenoszeniu substancji odżywczych wchłanianych w
przewodzie pokarmowym, hormonów, enzymów, witamin do tkanek co stanowi podstawę prawidłowego
funkcjonowania poszczególnych tkanek, narządów i całego organizmu. Dzięki właściwości krzepnięcia
krwi po uszkodzeniu tkanek tworzy się skrzep tamujący krwawienie, a mechanizm fibrynolizy zapobiega
zamykaniu światła naczynia i utrzymuje płynność krwi. Ponadto krew stanowi istotne ogniwo układu
odpornościowego człowieka oraz zapewnia stałość środowiska wewnętrznego organizmu czyli tzw.
homeostazę. Ze względu na właściwości krwi i wykonywanie tak wielu złożonych funkcji jakiekolwiek
nieprawidłowości w czynności narządów mają swoje odbicie w składzie krwi, a badanie krwi może być
ważnym elementem procesu diagnostycznego.
Badanie krwi jest jednym z podstawowych i jednym z najprostszych badań, pozwalających wstępnie
określić stan zdrowia badanego. Dostarcza ono informacji o czynności układu krwiotwórczego i procesach
mających miejsce w wielu innych narządów (np. wątroby, nerek, gruczołów dokrewnych). Pomocne jest
w ocenie stosowanej diety i stanu odżywienia organizmu różnymi składnikami pokarmowymi. Przy
podejrzeniu lub rozpoznaniu zmian patologicznych, badanie krwi umożliwia w stosunkowo prosty sposób
dokonanie oceny równowagi metabolicznej wewnątrzustrojowej, rodzaju i zaawansowania chorób
narządowych i układowych, ostrych i przewlekłych zatruć, doboru w terapii farmakologicznej właściwych
dawek leków.
Do badania pobiera się krew z naczyń krwionośnych: żylnych, włośniczek, bądz
tętnic. Oznaczenia
wykonuje się albo we krwi pełnej, w osoczu krwi (krwi pozbawionej elementów morfotycznych), bądz
też
w surowicy krwi (osoczu pozbawionym fibrynogenu).
Badanie krwi obejmuje przede wszystkim ocenę elementów upostaciowanych krwi (krwinek
czerwonych, krwinek białych i płytek) oraz składu chemicznego krwi pełnej (np. stężenie hemoglobiny)
lub osocza.
Rutynowo wykonuje się tzw. morfologię krwi. Jest to najczęściej wykonywany profil badań
laboratoryjnych, w którym ocenia się: liczbę krwinek czerwonych - erytrocytów (ang. red blood cells,
RBC), krwinek białych leukocytów (ang. white blood cells, WBC), hematokryt (stosunek objętości
krwinek do objętości pełnej krwi, Ht) i stężenie hemoglobiny (Hb). Na podstawie uzyskanych wyników
oblicza się nast. wskaz
niki:
" średnią objętość krwinki czerwonej (MCV):
MCV [fl] = Ht [%] x 10 / RBC [x 103 /1�L]
MCV [fl] = Ht [L/L] x 1000 / RBC [x 1012 / 1L]
" średnią zawartość hemoglobiny w krwince (MCH)
MCH = Hgb/RBC (masa hemoglobiny w danej objętości krwi przez liczbę krwinek)
" średnie stężenie hemoglobiny w krwinkach (MCHC)
MCHC [g/dl]= Hb [g/dL] x 100 / Ht [%]
MCHC [nmol/L] = Hb [mmol/L] / Ht [L/L]
Ponadto, wykonuje się rozmaz krwi (leukocytogram) i określa ilości poszczególnych typów krwinek:
białych (granulocytów obojętnochłonnych (neutrofili, neutrocytów) pałeczkowatych i podzielonych,
granulocytów kwasochłonnych (eozynofili, eozynocytów), granulocytów zasadochłonnych (bazofili,
bazocytów), limfocytów i monocytów) oraz oznacza się ilość płytek krwi  trombocytów (PLT).
Wykonanie rozmazu i histogramów i cytogramów przedstawiających graficznie rozkład wielkości,
rodzaju lub kształtu danych elementów morfologicznych pozwala na uzyskanie dodatkowych informacji o
krwinkach, które mają szczególne znaczenie np. w diagnostyce anemii, gdzie dochodzi do zmiany
wielkości i/lub kształtu erytrocytów.
Badanie składu osocza/surowicy obejmuje oznaczenie:
" stężenia elektrolitów (Cl-, Na+, K+, Ca2+, Mg, P, żelaza);
" stężenia białek (proteinogram): stężenie białka ogółem, stężenie albumin i globulin (oraz frakcji
globulin: alfa, beta i gamma); lipidów (lipidogram): stężenie cholesterolu całkowitego i
cholesterolu poszczególnych frakcji lipoproteinowych oraz stężenie triacylogliceroli;
" stężenia glukozy, witamin
" stężenia produktów końcowych przemiany materii zawierających azot: mocznika, kreatyniny,
kwasu moczowego, amoniaku
" stężenia bilirubiny  barwnika żółciowego będącego produktem katabolizmu w wątrobie i śledzionie
hemu i innych hemoprotein
" aktywności enzymów np.: aminotransferazy alaninowej (AlAT), aminotransferazy asparaginianowej
(AspAT), glutamylotransferazy (GGTP);
" parametrów układu krzepnięcia krwi (stężenie i właściwości czynników krzepnięcia krwi np.
fibrynogenu);
" stężenia hormonów (TSH, T3/T4, FSH/LH, estradiolu/progesteronu, testosteronu, insuliny)
" obecności specyficznych przeciwciał - np.: przeciwko antygenom wirusa zapalenia wątroby typu B i
C (przeciwciała anty-HBs, anty-HCV), wirusowi AIDS (przeciwciała anty-HIV),
" stężenia markerów nowotworowych - np.: antygen specyficzny gruczołu krokowego (PSA), antygen
rakowo-płodowy (CEA), białko płodowe alfa (AFP);
" stężenia leków, metali, (np. żelazo, lit, ołów, rtęć, cynk), alkoholi, obecności toksyn
" stężenia związków chemicznych, które gromadzą się we krwi w wyniku wrodzonych zaburzeń
metabolicznych (np. fenyloalaniny w fenyloketonurii, galaktozy w galaktozemii);
W ramach analiz laboratoryjnych krwi może być wykonywane oznaczenie czasu krwawienia i czasu
krzepnięcia oraz grupy krwi (i próba krzyżowa), a także badanie mikrobiologiczne (ustalenie obecności i
rodzaju bakterii, wirusów we krwi). Analiza krwi (tętniczej) może również polegać na ocenie tzw.
równowagi kwasowo-zasadowej krwi (badanie gazometryczne). W ramach tego badania oznacza się m.in.
nast. parametry: pH krwi, prężność tlenu (pO2) i dwutlenku węgla we krwi (pCO2), stężenie jonów
wodorowęglanowych (HCO3-) we krwi.
Każdy składnik oceniany podczas tego badania ma ustalone granice normy (wartości referencyjne) np.
skrót nazwy norma u
składniki krwi norma u kobiet
(ang.) mężczyzn
4,7-6,1 x 109/l
krwinki czerwone (erytrocyty) RBC 4,2-5,4 x 1012/l
średnia objętość
MCV 80-100 fl
krwinki czerwonej
średnia zawartość hemoglobiny
MCH 27-35 pg/krwinka
w krwince
średnie stężenie hemoglobiny
MCHC 33-36,5 g/dl
w krwinkach
krwinki białe (leukocyty)
WBC 4,8-10,8 x 109/l
bazocyty -
BASO 0-0,2 x 109/l
granulocyty zasadochłonne
eozynocyty -
EOS 0-0,45 x 109/l
granulocyty kwasochłonne
monocyty
MONO 0-0,8 x 109/l
neutrocyty -
NEUT 1,8-7,7 x 109/l
granulocyty obojętnochłonne
limfocyty LYMPH 1,0-4,5 x 109/l
płytki krwi (trombocyty)
PLT 140-440 x 109/l
hemoglobina Hb 12-16 g/dl 14-18g/dl
białko osocza ogółem 6-8 g/dl
albuminy osocza 4-5 g/dl
globuliny osocza 1.8-3 g/dl
cholesterol całkowity < 200 mg/dl (< 5.2 mmol/l)
mocznik < 50 mg/dl (< 8.3 mmol/l)
kreatynina 0.7-1.3 mg/dl (62-115 �mol/l)
60-160 �g/dl
40-145 �g/dl
Fe
(10.7-28.6 �mol/l)
(7.2-25.9 �mol/l)
Wyniki badania krwi dają obraz funkcji prawie wszystkich narządów, gruczołów, stanu
nawodnienia, odżywienia, postępu choroby. Stan funkcjonowania określonego narządu pozwala ocenić
tzw. profil podstawowych oznaczeń biochemicznych krwi np. sodu, potasu, mocznika i kreatyniny - profil
nerkowy, transaminaz (alaninowej i asparaginianowej), gamma-glutamylotransferazy (GGT), bilirubiny i
albumin  profil wątrobowy, TSH i wolnej T4 - profil tarczycowy. Podstawowym wskaz
nikiem
gospodarki węglowodanowej organizmu jest poziom glukozy we krwi, a gospodarki lipidowej tzw. profil
lipidowy, obejmujący oznaczenie stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterol HDL i triacylogliceroli.
Nie każdy prawidłowy wynik morfologii/badania biochemicznego krwi świadczy o pełni zdrowia i nie
każde odchylenie od normy jest wyrazem choroby czy zaburzeń w funkcjonowaniu organizmu. Często
wynika to ze zmian fizjologicznych, z błędów w pobraniu krwi do badania, niewłaściwego transportu krwi
itp. Dlatego też zaleca się powtórzenie badania w celu wykluczenia pomyłki i konsultację lekarską.
ERYTROCYTY: Zwiększenie ilości krwinek czerwonych (erytrocytoza, nadkrwistość) jest objawem
rzadko spotykanej choroby hematologicznej czerwienicy wywołanej nowotworowym rozrostem krwinek
czerwonych. Nadkrwistość może być również odpowiedzią organizmu na przewlekłe niedotlenienie
tkanek np. w niektórych wadach sercach, w rozedmie płuc, oraz w przypadku przebywania na znacznych
wysokościach. Do nadkrwistości prowadzi odwodnienie organizmu (wymioty, biegunki, stres, oparzenia),
a także niektóre choroby wątroby i choroby nerek (np. nowotwory) powodujące zwiększenie sekrecji
hormonu erytropoetyny pobudzającego wytwarzanie erytrocytów w szpiku kostnym. Znacznie częstsza
erytropenia (zmniejszenie ilości erytrocytów, niedokrwistość) może być wywołana utratą krwi, bądz

niedoborem witaminy B12 lub kwasu foliowego (tzw. niedokrwistość megaloblastyczna związana z
zaburzeniem procesu erytropoezy). Do niedokrwistości dochodzi też w przypadku występowania
nasilonego rozpadu erytrocytów (niedokrwistość hemolityczna). Przyczyną niedokrwistości jest także
niedobór żelaza niezbędnego do syntezy hemoglobiny lub inne przyczyny wtórne (ciąża, choroby nerek,
nowotwory, choroby przewlekłe).
" średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) - wskaz
nik ten opisuje średnią objętość pojedynczej
krwinki czerwonej. Zwiększenie MCV powyżej 100 fl określane jest jako makrocytoza, a
najczęstszą tego przyczyną jest niedokrwistość związana z niedoborem witaminy B12 i/lub kwasu
foliowego.
Natomiast wartości MCV poniżej 80 fl świadczą najczęściej o niedokrwistości mikrocytowej
(przebiegającej ze zmniejszeniem rozmiaru krwinki czerwonej); jest ona charakterystyczna dla stanu
niedoboru żelaza.
LEUKOCYTY: zmiany ilościowe w obrazie krwinek białych występują w wielu chorobach. Polegają one
na zwiększeniu ilości krwinek białych (leukocytoza dotycząca jednego lub kilku rodzajów krwinek:
granulocytoza, eozynofilia, monocytoza, limfocytoza) lub zmniejszeniu ich liczby (leukopenia:
granulocytopenia, limfopenia), bądz
zmianach morfologicznych i czynnościowych leukocytów. Wzrost
liczby leukocytów może występować w stanach fizjologicznych (np. po spożyciu posiłku, po wysiłku, w
ciąży, pod wpływem stresu) lub być spowodowany przyczynami patologicznymi (ostre zakażenia,
niezakaz
ne stany zapalne narządów, uszkodzenia tkanek, zatrucia, nowotwory). Spadek ich liczby
(granulocytopenia) może nastąpić po uszkodzeniu szpiku kostnego przez środki chemiczne,
promieniowanie, przez choroby takie jak białaczki, czy nacieki nowotworowe, a występuje również w
niedokrwistości megaloblastycznej.
TROMBOCYTY - z nadpłytkowością (trombocytozą) mamy do czynienia w przebiegu chorób
nowotworowych krwi, przewlekłych chorób zapalnych ( np gruz
licy), zawału serca, ponadto po usunięciu
śledziony, w niedokrwistości z niedoboru żelaza, w przypadku stosowania kortykosteroidów. Częściej
jednak spotyka się małopłytkowość (trombocytopenię) spowodowaną np. przyjmowaniem niektórych
leków, niedoborami witaminy B12 lub kwasu foliowego, infekcjami, nowotworami i innymi chorobami.
HEMOGLOBINA - powodem wzrostu stężenia hemoglobiny we krwi są nadkrwistości oraz stan
odwodnienia organizmu. Częściej jednak dochodzi do spadku stężenia hemoglobiny, a najczęściej
powodem tego jest niedokrwistość, w tym z niedoboru żelaza oraz stany przewodnienia organizmu.
BIAA
KA OSOCZA KRWI
Białka występujące w osoczu krwi to mieszanina białek należących do dwóch grup: albumin i globulin,
różniących się zarówno budową, jak i funkcją. Albuminy są produkowane w wątrobie i odpowiedzialne za
utrzymanie stałej objętości krwi, wiązanie i transport hormonów, leków, aminokwasów, bilirubiny,
kwasów tłuszczowych, magnezu i wapnia. Do frakcji globulinowej krwi zalicza się białka biorące udział
w procesie krzepnięcia krwi (protrombinę, fibrynogen), enzymy: lipazy, aminotransferazy, fosfatazy,
proteazy, białka o właściwościach immunologicznych: przeciwciała przeciwko antygenom krwinek
czerwonych i inne immunoglobuliny, dopełniacz oraz białka wiążące metale np. żelazo - transferynę i
miedz
 ceruloplazminę.
Zawartość białka w osoczu wynosi 6-8 g/dl (we krwi pełnej  16-20 g/dl), w tym albumin - 4-5 g/dl, a
globulin  1.8-3% (fibrynogenu  0.2-0.4%). Albuminy stanowią ok. 60% białka całkowitego osocza, ą-
globuliny  12%, �-globuliny  10%, a ł-globuliny  18%.
Zwiększenie stężenia białka całkowitego w osoczu (powyżej 9 g/dl) zdarza się bardzo rzadko;
względne podwyższenie stężenia białka we krwi występuje w niektórych odwodnieniach.
Często przy prawidłowym stężeniu białka ogółem obserwuje się przesunięcia w obrębie
poszczególnych frakcji i zmianę współczynnika albuminowo-globulinowego wynoszącego prawidłowo
ok. 1.5. Przyczyną spadku stężenia albumin mogą być: zaburzenia wchłaniania, niedożywienie,
zmniejszona synteza albumin (choroby wątroby) zwiększona utrata białek z organizmu (białkomocz,
zespół nerczycowy, choroby przewodu pokarmowego, oparzenia, krwawienia, wysięki) zwiększony
katabolizm białka (posocznica, wysoka gorączka, urazy, choroby nowotworowe). Ze względu na znaczny
wpływ albumin na ciśnienie onkotyczne krwi spadek zawartości albumin we krwi może wywoływać
obrzęki tkanek. Zwiększenie zawartości frakcji globulinowej spotyka się najczęściej w stanach zapalnych
(ą-globuliny), przewlekłych chorobach zakaz
nych i schorzeniach wątroby (�- i ł-globuliny).
Zmiany w obrazie białek osocza są składową reakcji organizmu wywołanej przez urazy mechaniczne,
termiczne, zakażenia lub martwicę tkanek i noszą nazwę reakcji ostrej fazy. Ta złożona nieswoista
odpowiedz
powoduje znaczne zwiększenie się stężenia niektórych białek osocza tzw. pozytywnych białek
ostrej fazy (np. fibrynogenu, czynnika VIII krzepnięcia krwi, białka C-reaktywnego CRP, pełniących w
większości funkcję obronną, pobudzających proces fagocytozy, chroniących przed destrukcyjnym
wpływem enzymów osoczowych i komórkowych uwalnianych we krwi lub dostających się do niej z
uszkodzonych tkanek), a zmniejszenie stężenia innych białek tzw. negatywnych białek ostrej fazy (w tym
albumin i transferyny).
CHOLESTEROL
Cholesterol jest składnikiem błon komórkowych, substratem do syntezy hormonów sterydowych i
kwasów żółciowych. Jego nadmiar powoduje odkładanie się złogów cholesterolu w naczyniach, co
usposabia do rozwoju miażdżycy i choroby wieńcowej. Cholesterol występuje we krwi w postaci wolnej i
zestryfikowanej, a transportowany jest przez w postaci lipoprotein w połączeniu z białkami,
triacyloglicerolami i fosfolipidami. Najważniejsze frakcje lipoprotein to chylomikrony  transportujące
tłuszcze i cholesterol wchłonięte w przewodzie pokarmowym, lipoproteiny o dużej gęstości HDL,
odpowiedzialne za transport cholesterolu z tkanek do wątroby i lipoproteiny LDL przenoszące cholesterol
z wątroby do tkanek i narządów obwodowych.
Zaburzenia gospodarki lipidowej oraz transportu składników lipidowych modyfikują ich zawartość
we krwi. Mogą prowadzić do stanów patologicznych zwanych dyslipoproteinemiami
(hiperlipopreteinemiami lub hipolipoproteinemiami). Najczęściej dochodzi do zwiększenia stężenia
cholesterolu ogółem, zwiększenia stężenia cholesterolu LDL, zmniejszenia stężenia cholesterolu frakcji
HDL i/lub zwiększenia stężenia triacylogliceroli we krwi. Zaburzenia te mogą mieć charakter pierwotny
(rodzinna hipercholesterolemia, hipercholesterolemia zależna od diety) lub wtórny (w chorobach wątroby,
nerek, trzustki, w cukrzycy; niedoczynności tarczycy, otyłości, ciąży; przy stosowaniu niektórych leków
np. �-blokerów, diuretyków, doustnych preparatów antykoncepcyjnych, kortykosterydów).
Spadek stężenia cholesterolu wywołują choroby wątroby, takie jak zaawansowana marskość
wątroby, ostra i podostra martwica wątroby, toksyczne uszkodzenie wątroby, infekcje związane z
uszkodzeniem wątroby, a poza tym stan głodzenia, posocznica, nadczynność tarczycy, niedokrwistości.
MOCZNIK I KREATYNINA
Stężenia we krwi: mocznika (końcowego metabolitu grupy aminowej aminokwasów powstającego
w wątrobie) i kreatyniny (produktu nieenzymatycznego rozpadu fosforanu kreatyny w mięśniach) są
głównymi markerami biochemicznymi metabolizmu białek w organizmie. W warunkach prawidłowych
związki te są wydalane z organizmu z moczem. Stężenie mocznika i kreatyniny jest więc markerem
wydolności nerek i sprawności ich funkcji filtracyjnej. Poza czynnością nerek, na ich poziom we krwi
wpływają również inne czynniki np. ilość spożywanego białka, poziom katabolizmu białka (w przypadku
mocznika), masa mięśniowa, wiek (w przypadku kreatyniny).
Wzrost stężenia mocznika we krwi mogą powodować: dieta bogata w białka; nadmierny
katabolizm białek w ustroju, np. gorączka, posocznica; krwawienia do przewodu pokarmowego. Spadek
stężenia występuje w ciężkich schorzeniach wątroby i pod wpływem diety niskobiałkowej, nie ma jednak
znaczenia klinicznego.
Zwiększone stężenie kreatyniny w osoczu krwi powoduje: wysiłek fizyczny; akromegalia. Spadek
stężenia wywołują: głodzenie, stosowanie kortykosterydów.
Do zwiększenia zawartości tych metabolitów we krwi dochodzi głównie w wyniku w upośledzenia
czynności nerek, któremu towarzyszy zmniejszenie wielkości przesączania kłębuszkowego, przy czym
wzrost ich stężenia (zwłaszcza kreatyniny) świadczy o zaawansowanej niewydolności nerek (w przypadku
kreatyniny obserwowany jest dopiero przy zmniejszeniu przesączania kłębuszkowego o ponad 50%).
W miarę progresji choroby nerek stężenie tych substancji we krwi stopniowo zwiększa się.
Przyjmuje się, że stężenie kreatyniny w granicach 2-4 mg/dl (177-350 �mol/l) świadczy o nieznacznym
upośledzeniu czynności nerek, 5-7 mg/dl (440-620 �mol/l) o umiarkowanym upośledzeniu, a stężenie 8-
16 mg/dl (700-1400 �mol/l) wskazuje na znaczną niewydolność związaną z dużym zmniejszeniem
przesączania kłębuszkowego (przy tak znacznym uszkodzeniu nerek stężenie mocznika we krwi może
wzrosnąć do 400 mg/dl (67 mmol/l).
ŻELAZO
Żelazo we krwi występuje głównie w formie hemoglobiny (60-70% całości Fe znajdującego się w
organizmie) i w postaci związanej z białkiem grupy �-globulin - transferynąiem (0.1%) Stężenie żelaza w
surowicy zależy od wchłaniania w przewodzie pokarmowym, magazynowania w jelicie, śledzionie i
szpiku kostnym, syntezy i rozpadu hemoglobiny, a także jego utraty z ustroju. Wartości średnie żelaza są
niższe u kobiet niż u mężczyzn średnio o 10 mikrogramów/dl. U obu płci wraz z wiekiem ulegają
obniżeniu. Stężenie żelaza wykazuje zmienność dobową (różnice do 30% ze szczytem w godzinach
porannych), a u kobiet zmienność w trakcie cyklu miesiączkowego. Stężenie fizjologiczne żelaza w
surowicy wynosi 40-160 �g/dl, a we krwi pełnej  40-50 mg/dl. Wzrost stężenia obserwuje się przy
nadmiernej podaży dożylnych i domięśniowych preparatów żelaza, częstych transfuzji krwi, ostrych
zatruć żelazem, niedokrwistości hemolitycznych, niedokrwistości hipoplastycznych i aplastycznych,
zespołów mielodysplastycznych, ostrych uszkodzeń wątroby (wzrost stężenia żelaza jest proporcjonalny
do stopnia martwicy wątroby) i jej stanu zapalnego; zapalenia nerek; stosowania doustnych środków
antykoncepcyjnych. Spadek stężenia obserwuje się w niedokrwistości z niedoboru żelaza (niedobór Fe
i/lub wit. C w diecie, zaburzeniach wchłaniania, nadmierna utrata Fe z organizmu), niedokrwistości
złośliwej; ostrych i przewlekłych zakażeniach, chorobach nowotworowych, przewlekłej niewydolności
nerek.
CZ
ŚĆ PRAKTYCZNA
" oznaczanie ilościowe elementów morfotycznych krwi
o hematokryt
o liczenie krwinek czerwonych i białych,
" różnicowanie elementów morfotycznych krwi  rozmaz krwi
" oznaczanie stężenia hemoglobiny
" oznaczania podstawowych parametrów układu krzepnięcia (czas krwawienia, czas krzepnięcia)
" oznaczanie właściwości serologicznych krwi (grupa krwi)
�!Z METODYK
TYCH OZNACZEC
NALEŻY ZAPOZNAĆ SI
NA PODSTAWIE SKRYPTU
" oznaczanie parametrów biochemicznych krwi
o stężenie białka ogółem w surowicy krwi
o stężenie albumin i globulin w surowicy krwi
o stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy krwi
o stężenie mocznika w surowicy krwi
o stężenie żelaza w surowicy krwi
W oznaczaniu stężenia parametrów biochemicznych krwi wykorzystane zostaną metody
kolorymetryczne. Metodami kolorymetrycznymi można oznaczać stężenie substancji barwnych, jak też
bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych i/lub enzymatycznych przeprowadza
się w związki zabarwione. Są to więc metody analityczne charakteryzujące się uniwersalnością, a ponadto
dużą dokładnością i wysoką czułością.
Podstawę ilościowego oznaczania stężenia substancji w roztworze metodą kolorymetryczną
stanowi zależność między intensywnością zabarwienia roztworu a stężeniem zawartej w nim substancji
(prawo Lamberta-Beera). Miarą intensywności zabarwienia roztworu jest zdolność pochłaniania
(absorbancja) światła monochromatycznego (jednobarwnego) o ściśle określonej długości fali (długości
fali najsilniej absorbowanej przez badaną substancję). Próbkę analizowanego roztworu w przezroczystej
kuwecie umieszcza się w urządzeniu zwanym spektrofotometrem (rys. 1) na drodze światła między
monochromatorem (z
ródłem światła o określonej długości fali) i detektorem (urządzeniem oznaczającym
natężenia światła. Absorbancję definiuje się jako: A = log (Io/I), gdzie Io to natężenie światła padającego
na ośrodek absorbujący, a I to natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, a jest
ona funkcją liczby cząsteczek absorbujących promieniowanie, znajdujących się na drodze promienia
świetlnego.
Rys. 1. Schemat budowy spektrofotometru
OZNACZANIE ST
ŻENIA BIAA
KA OGÓA
EM (metoda biuretowa)
Zasada metody: tworzenie się związku kompleksowego pomiędzy jonem miedzi II a wiązaniem
peptydowym w białku w środowisku zasadowym. Powstały kompleks przybiera barwę fioletową, a jej
intensywność jest proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych, a tym samym ilości białka w roztworze.
Wykonanie:
o do probówek odpipetować:
Próba badana PB Próba zerowa (kontrolna) PZ
(surowica krwi)
surowica krwi 100 �l
woda destylowana 100 �l
a następnie
odczynnik biuretowy 3 ml 3 ml
o dokładnie wymieszać
o po 15 minutach odczytać absorbancję próby badanej (APB) względem próby zerowej przy długości fali
świetlnej 530 nm.
Obliczenia:
% białka w surowicy = APB x 18.52
OZNACZANIE ST
ŻENIA ALBUMINY
Zasada metody: albumina tworzy z zielenią bromokrezolową w środowisku kwaśnym barwny kompleks,
którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości fali światła 630 nm jest proporcjonalna do
stężenia albumin w badanej próbie
Wykonanie:
o do probówek odpipetować:
Próba zerowa Próba badana PB Próba wzorcowa PW
(kontrolna) PZ (surowica krwi) (roztw. albuminy o znanym stężeniu)
odczynnik 2 ml 2 ml 2 ml
diagnostyczny
A następnie
roztw. wzorcowy - - 10 �l
albuminy
surowica krwi - 10 �l -
woda destylowana 10 �l - -
o dokładnie wymieszać
o po minucie odczytać absorbancję próby wzorcowej (APW) i próby badanej (APB) względem próby
zerowej
Obliczenia:
stężenie albuminy = (APB / APW) x stężenie wzorca
Następnie należy obliczyć zawartość frakcji globulinowej w badanej surowicy krwi (z różnicy międy
zawartością białka ogółem i zawartością albuminy), a następnie obliczyć współczynnik albuminowo-
globulinowy.
BADANIE WA
AŚCIWOŚCI BIAA
EK (koagulacja i denaturacja białka)
Pod wpływem czynników fizycznych (silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie promieniami UV,
rentgenowskimi lub działanie ultradz
więkami) lub chemicznych (działanie kwasów, zasad, detergentów,
roztworów soli ciężkich lub niektórych substancji organicznych takich jak: aceton, benzen, formaldehyd)
dochodzi do denaturacji białka polegającej na zmianach konformacji białka (zniszczeniu. wiązań
wodorowych, wiązań hydrofobowych, a w obecności odczynników redukcyjnych także wiązań
disiarkowych, które stabilizują strukturę przestrzenną cząsteczki białka), przy czym nie następuje
hydrolityczna degradacja łańcucha polipeptydowego (struktura pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona).
Denaturacja prowadzi do zmiany właściwości fizycznych białka (np. stopnia hydratacji białka,
zmniejszenia jego rozpuszczalności, zwiększenia lepkości, agregacji i wytrącanie białka z roztworu), a
także wpływa na aktywność biologiczną (enzymatyczną, antygenową, hormonalną) białka.
W przypadku denaturacji redukcyjnej denaturacja bywa odwracalna i po usunięciu czynnika
denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci.
Wykonanie:
Do
probówki 1 dodać 1 ml 5% roztworu albuminy, 3 ml wody destylowanej i 2 ml 96% etanolu. Następnie
dodać 3 ml wody destylowanej
probówki 2 dodać 3 ml 5% roztworu albuminy, a następnie 3 ml 96% etanolu. Po godzinie dodać 3 ml
wody
probówki 3 dodać 3 ml 5% roztworu albuminy i 2 ml 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego
probówki 4 dodać 3 ml 5% roztworu albuminy, probówkę umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej (naczynku z
gotującą się wodą) i zagotować.
OZNACZANIE ST
ŻENIA CHOLESTEROLU CAA
KOWITEGO
Zasada metody: cholesterol wolny i uwolniony z estrów przez enzym esterazę cholesterolu zostaje
utleniony przez enzym oksydazę cholesterolu, a powstający w tej reakcji nadtlenek wodoru reaguje z
aminoantypiryną i fenolem tworząc czerwono zabarwiony kompleks chinoiminy. Intensywność barwy
tego kompleksu mierzona przy długości fali światła 500 nm jest proporcjonalna do stężenia cholesterolu
całkowitego w próbce.
Wykonanie:
o do probówek odpipetować:
Próba odczynnikowa Próba badana PB Próba wzorcowa PW
PO (surowica krwi) (roztw. cholesterolu o znanym
stężeniu)
odczynnik 1 ml 1 ml 1 ml
diagnostyczny
a następnie
roztw. wzorcowy - - 10 �l
albuminy
surowica krwi - 10 �l -
o dokładnie wymieszać
o po 10 minutach odczytać absorbancję próby wzorcowej (APW) i próby badanej (APB) względem próby
odczynnikowej
Obliczenia:
stężenie cholesterolu = (APB / APW) x stężenie wzorca
mg/dl x 0.0258 = mmol/l
OZNACZANIE ST
ŻENIA MOCZNIKA
Zasada metody: mocznik ulega w obecności ureazy hydrolizie, a uwolniony amoniak reaguje z 2-
oksoglutaranem w obecności m.in. koenzymu NADH. Spadek absorbancji NADH, obserwowany przy
długości fali 340 nm jest proporcjonalny do zawartości mocznika w próbce.
Wykonanie:
o do probówek odpipetować:
 Próba badana PB Próba wzorcowa PW
(surowica krwi) (roztw. mocznika o znanym stężeniu)
odczynnik 1 ml 1 ml
diagnostyczny
a następnie
roztw. wzorcowy - 10 �l
mocznika
surowica krwi 10 �l -
o dokładnie wymieszać
o po minucie odczytać absorbancję A1 próby wzorcowej (APW) i próby badanej (APB) względem wody
destylowanej
o po następnej minucie odczytać absorbancję A2 próby wzorcowej (APW) i próby badanej (APB)
względem wody destylowanej
Obliczenia:
stężenie mocznika [mg/dl] = (A1PB  A2PB) / (A1PW  A2PW) x stężenie wzorca
OZNACZANIE ST
ŻENIA ŻELAZA
Zasada metody: w środowisku kwaśnym żelazo uwalniane jest z transferyny, a następnie redukowane do
jonów Fe2+, które reagują z substancją Ferene S tworząc trwały kompleks barwny. Intensywność barwy
tego kompleksu mierzona przy długości fali światła 593 nm jest proporcjonalna do zawartości żelaza w
próbce.
Wykonanie:
o do probówek odpipetować:
Próba Próba ślepa PŚ Próba badana PB Próba wzorcowa
odczynnikowa (surowica krwi) PW
PO (roztw. mocznika o
znanym stężeniu)
woda destylowana 200 �l 50 �l - -
surowica krwi - 20 �l 20 �l -
roztw. wzorcowy - - - 20 �l
żelaza
odczynnik 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
diagnostyczny 1
odczynnik 50 �l - 50 �l 50 �l
diagnostyczny 2
o ostrożnie wymieszać
o po 5 minutach odczytać absorbancję próby ślepej (APS) wobec wody i absorbancję próby badanej
(APB) i próby wzorcowej (APW) względem próby odczynnikowej.
Obliczenia:
stężenie żelaza [�g/dl] = (APB  APS) / (APW) x 100
[�g/dl] x 0.179 = [�mol/l