1. Organizacja laboratorium mikrobiologicznego

- układ laboratorium

Laboratorium mikrobiologiczne powinno być podzielone na ciąg pomieszczeń
odpowiadających kolejnym etapom pracy mikrobiologicznej:
♥ pomieszczenie przeznaczone do odbioru, przechowywania i przygotowania

próbek do analizy

♥ pożywkarnia, gdzie sporządza się pożywki mikrobiologiczne, powinna

mieścić się w pobliżu sterylizatorni czystej

♥ sterylizatornia czysta, gdzie wyjaławia się pożywki oraz sprzęt

laboratoryjny

♥ pokój aparaturowy, zawierający aparaturę kontrolno-pomiarową i większy,

powszechnie wykorzystywany sprzęt

♥ pomieszczenie służące do wykonywania analiz
♥ sterylizatornia brudna, gdzie unieszkodliwia się materiał biologiczny
♥ zmywalnia, gdzie odbywa się mycie i dezynfekcja zużytego szkła i

drobnego sprzętu, powinna być zlokalizowana w pobliżu zarówno
sterylizatorni brudnej, jak i czystej

♥ pomieszczenie magazynowe na szkło
♥ pomieszczenie magazynowe na odczynniki
♥ pomieszczenie przeznaczone do prowadzenia dokumentacji i prac

administracyjnych

- wyposażenie

Typowe wyposażenie laboratorium mikrobiologicznego:
♥ niezbędny drobny sprzęt laboratoryjny (np. statywy na probówki, pipety,

wanienki do barwienia preparatów, pęsety)

♥ wyposażenie podstawowe (np. termostaty, chłodziarki, wstrząsarki,

sterylizatory, autoklawy)

♥ wyposażenie pomiarowe (np. termometry, wagi, konduktometry, sprzęt do

pomiaru objętości)

♥ sprzęt specjalistyczny (zależne od specyfiki laboratorium, np.

mikromanipulatory, chromatografy, liofilizatory)

- aparatura

Podstawowa aparatura:
♥ autoklawy - sterylizacja pożywek i sprzętu laboratoryjnego nasyconą parą

wodną, powyżej 100°C

♥ pasteryzatory - wyjaławianie w bieżącej parze wodnej pożywek, których

skład pozwala na zastosowanie temperatur tylko poniżej100°C

♥ zestawy do filtracji membranowej - wyjaławianie pożywek, gdy niektóre

ich składniki ulegają zniszczeniu w wysokiej temperaturze, oraz do
określenia liczby drobnoustrojów metodą filtracyjną

♥ suszarki - wyjaławianie szkła, naczyń, suszenia substancji, temperatura w

przedziale 150°C-180°C

♥ termostaty (cieplarki, inkubatory) - hodowla drobnoustrojów w

kontrolowanej temperaturze

♥ boksy laminarne (komory laminarne) - bezpyłowe środowisko pracy

wyposażone w laminarny przepływ powietrza

♥ wstrząsarki - hodowla wgłębna drobnoustrojów w warunkach

zwiększonego natlenienia

♥ wirówki laboratoryjne
♥ anaerostaty - hodowla w warunkach beztlenowych

2. Pożywki hodowlane

- wymagania stawianie pożywkom

♥ powinny zawierać łatwo dostępne źródło węgla i energii, źródło azotu oraz

substancje mineralne i pierwiastki śladowe

♥ odpowiednia wartość pH
♥ izotoniczność
♥ klarowność umożliwiająca makroskopową obserwację wzrostu

- kryteria podziału

Ze względu na konsystencję:
♥ płynne - do namnażania, uzyskiwania dużej ilości biomasy
♥ półpłynne (0,1-0,7% agaru) - do badania zdolności ruchowych, do hodowli

w warunkach obniżonej zawartości tlenu

♥ stałe (1,5-2,0% agaru) - do namnażania drobnoustrojów, liczenia,

izolowania czystych kultur, różnicowania, przechowywania

Ze względu na zawartość składników spożywczych:
♥ minimalne - zawierające składniki pokarmowe niezbędne dla podtrzymania

badanej funkcji drobnoustroju

♥ pełne - zapewniające dobry wzrost drobnoustroju
♥ wzbogacone - przeznaczone dla drobnoustrojów o specjalnych

wymaganiach, zawierające poza podstawowymi składnikami odżywczymi
również wzbogacające (np. krew, żółtko jaj, mleko)

powered by KarolS

1

Ze względu na skład chemiczny:
♥ chemicznie określone - zawierające składniki o znanej strukturze

chemicznej i stopniu czystości

♥ o częściowo znanym składzie - zawierające składniki naturalne
♥ chemicznie niekompletne - przygotowane całkowicie ze składników

naturalnych (bulion, brzeczka słodowa)

Ze względu na sposób użycia:
♥ transportowe - uniemożliwiające namnażanie się, ze zapewniające

przeżycie mikroorganizmów w okresie od pobrania próby do momentu
obróbki laboratoryjnej

♥ do przechowywania - do długoterminowego zabezpieczenia żywotności

drobnoustrojów

♥ namnażające - do otrzymania dużej biomasy drobnoustrojów
♥ selektywnie namnażające - wspomagają namnażanie się określonych

mikroorganizmów, zawierające jednocześnie składniki hamujące wzrost
innych

♥ selektywnie izolacyjne - zawierające oprócz składników odżywczych także

składniki wybiórcze, pozwalające na wyodrębnienie danej grupy
drobnoustrojów, jednocześnie hamujące wzrost innych

♥ różnicujące - pozwalające na sprawdzenie jednej lub wielu cech

fizjologicznych lub biochemicznych w celu identyfikacji drobnoustrojów

♥ identyfikacyjne

- do wykazania specyficznych właściwości

mikroorganizmów

- przygotowanie

Pożywki mikrobiologiczne mogą być nabywane w postaci gotowej lub w
postaci odwodnionej. Można je także wykonywać w laboratorium, poprzez
odważenie poszczególnych składników pożywki, rozpuszczenie ich w wodzie,
skorygowanie pH, zakorkowanie oraz wyjałowienie.

- wyjaławianie

♥ sterylizacja - niszczenie form wegetatywnych i przetrwalników, zakres

temperatur 117-127°C, czas sterylizacji 20-30min

♥ pasteryzacja - wyjaławianie pożywek, której składniki ulegają rozkładowi

w temperaturze powyżej 100°C, niszczenie tylko form wegetatywnych,
stosowane temperatury poniżej 100°C, czas nawet do godziny

♥ tyndalizacja - trzykrotna pasteryzacja pożywki, w odstępach 24

godzinnych, kiedy to pożywka pozostawiana jest w temperaturze
pokojowej w celu wykiełkowania przetrwalników

♥ filtracja - wyjaławianie pożywek, których składniki ulegają zmianom

fizycznym lub chemicznym w wysokiej temperaturze

3. Bakterie

- morfologia

Kształt komórek podlega zmianom pod wpływem wieku hodowli i warunków
środowiska.
Kształty komórek bakterii:
♥ kulisty



ziarniaki (coccus)
o forma pojedyncza - micrococcus
o dwoinki - diplococcus (komórki dzielą się w jednej płaszczyźnie i

po podziale dwie komórki zostają połączone)

o paciorkowce - streptococcus (komórki dzielą się w jednej

płaszczyźnie i po podziale komórki pozostają połączone w formie
łańcuszka)

o czworniaki - tetracoccus (komórki dzielą się w dwóch

płaszczyznach prostopadłych do siebie

o pakietowce - sarcina (dzielą się w trzech płaszczyznach, regularnie

w czasie)

o gronkowce - staphylococcus (dzielą się w dwóch lub trzech

płaszczyznach, nieregularnie w czasie)

♥ cylindryczny - proste lub lekko wygięte, występują w formach mono, diplo

i strepto


pałeczki - Bacterium (nie tworzą przetrwalników)



laseczki - Bacillus (tworzą przetrwalniki)



maczugowce - Corynebacterium



wrzecionowce - Fusobacterium



prątki - Mycobacterium

♥ spiralny - występują w formach mono



przecinkowce - Vibrio



śrubowce - Spirillum



krętki - Spirochaeta

♥ postacie bakterii śluzowych
♥ promieniowce - wykazują podobieństwo do grzybów wytwarzając

pseudogrzybnię, ale budowa i skład ściany komórkowej wskazują na
podobieństwo do bakterii G (+)

powered by KarolS

2

- ruch

Najczęściej zdolność ruchu wykazują bakterie o kształcie cylindrycznym i
spiralnym. Bakterie kuliste są z reguły nieruchliwe.
Najbardziej ruchliwe są komórki w hodowlach młodych. Z wiekiem
możliwości ruchowe mogą się pogarszać, a nawet zupełnie zaniknąć. Zdarza
się także, że u niektórych bakterii ruchliwe są zarówno formy wegetatywne,
jak i przetrwalnikowe.
Zdolność do poruszania się wiąże się najczęściej z obecnością rzęsek.
Umożliwiają one zmianę położenia komórki ze względu na bodźce - zarówno
korzystne, jak i niekorzystne. Taki ruch wywołany bodźcem nazywa się taksją.
Rzęski mogą wyrastać na jednym, obu biegunach komórki, bocznie lub na
całej jej powierzchni, co dzieli urzęsienia na:
♥ monotrychalne - monopolarne o jednej rzęsce
♥ lofotrychalne - monopolarne o pęczku rzęsek
♥ amfitrychalne - bipolarne o pęczku rzęsek
♥ perytrychalne - umiejscowione wzdłuż komórki lub na całej powierzchni

- przetrwalnikowanie

Zdolność tworzenia przetrwalników (endospor) wykazują głównie bakterie
cylindryczne G(+), podczas gdy G(-) nie posiadają tej umiejętności.
Przetrwalnikowanie (sporulacja) zapoczątkowywana jest brakiem
odpowiednich substratów w środowisku, niekorzystnymi właściwościami
środowiska lub starzeniem się komórki.
Spory w komórce mogą być ułożone terminalnie lub subterminalnie, natomiast
sama komórka może zachować pierwotną wielkość i kształt lub może się
rozdąć w miejscu występowania przetrwalnika.
Powstanie przetrwalnika poprzedza proces replikacji DNA, synteza związków
swoistych dla endospor oraz nabieranie swoistej odporności na czynniki
zewnętrzne (temperaturę, wysychanie, promienie UV).
Bakterie wytwarzają zazwyczaj z reguły jeden przetrwalnik powstający
wewnątrz komórki wegetatywnej.
W sprzyjających warunkach następuje kiełkowanie przetrwalnika, obejmujące
aktywację, zapoczątkowanie kiełkowania i rozrost komórki.
U niektórych bakterii występują inne formy przetrwalnikowania, taki jak cysty
(powstające z całej komórki wegetatywnej w chwili wyczerpania się
składników odżywczych, bardziej niż endospory wrażliwe na czynniki
temperaturowe), egzospory (powstające w wyniku pączkowania komórek

wegetatywnych, o własnościach bliskich endosporom), mikrocysty (postać
spoczynkowa bakterii śluzowych) i mikrospory.

- diagnostyczne barwienie metodą Grama

Bakterie gramdodatnie i gramujemne wykazują różnicę zarówno w składzie
chemicznym, jak i budowie przestrzennej ściany komórkowej, a co za tym
idzie różnice w odporności oraz treści wewnątrzkomórkowej.
W metodzie barwienia Grama utrwalone komórki wybarwia się barwnikami
zasadowymi, a następnie traktuje płynem Lugola, w wyniku czego w komórce
powstaje kompleks barwnika z jodem. Zastosowanie kąpieli różnicującej
powoduje u jednej grupy bakterii odbarwienie komórek (bakterie
gramujemne), u drugiej natomiast zatrzymanie w komórkach utworzonego
kompleksu barwników (bakterie gramdodatnie). Następnie odbarwione
komórki dobarwia się barwnikiem kontrastowym w celu ich uwidocznienia.
Bakterie gramujemne barwią się na różowo, a gramdodatnie na fioletowo.

- metody hodowli

Metody hodowli bakterii:
♥ płynna
♥ na skosie
♥ płytkowa



powierzchniowa - posiew następuje na powierzchni pożywki



wgłębna - metoda zalewowa

♥ w wysokim słupie pożywki - pożywka stała w którą wszczepia się igłą

drobnoustroje, z czasem słup pożywki jest rozrywany na skutek
wydzielania gazów

♥ w pożywce z korkiem beztlenowym - stosowanie korka z waty nasączanego

płynem absorbującym i uszczelnienie naczynia korkiem lub parafiną

♥ w anaerostacie - hodowla w próżni lub atmosferze gazu obojętnego
♥ w pożywkach z dodatkiem tkanki roślinnej i zwierzęcej - tkanka roślinna lub

zwierzęca w pożywce płynnej ma za zadanie adsorpcję tlenu ze środowiska

♥ symbiotyczna (metoda Fortnera) - na dwie oddzielone od siebie części

pożywki na płytce Petriego posiewa się dwa szczepy drobnoustrojów -
tlenowy i beztlenowe, następnie płytki uszczelnia się, w pierwszej
kolejności wyrasta tlenowiec, który wykorzystując cały tlen stwarza
atmosferę beztlenową, dobrą dla rozwoju beztlenowca

Metody stosowane do hodowli bezwzględnych beztlenowców:
♥ fizyczne



usunięcie tlenu poprzez wygotowanie płynnej pożywki, szybkie
schłodzenie i zalanie warstwą jałowego oleju parafinowego

powered by KarolS

3



płytkowa wgłębna



w anaerostacie



w pożywce płynnej zawierającej tkankę roślinną lub zwierzęcą



w wysokim słupie pożywki stałej



w komorze do przeszczepień i hodowli w warunkach beztlenowych

♥ chemiczne



dodanie do pożywki substancji redukujących, które wiążą tlen



w pożywce z korkiem beztlenowym



katalityczne wiązanie wodoru z tlenem w anaerostacie

♥ biologiczne



metoda Fortnera

4. Drożdże

- klasyfikacja

♥ Ascomycota - wytwarzają askospory (zarodniki wewnątrz worka),

wegetatywnie rozmnażają się przez pączkowanie wieloboczne

♥ Basidiomycota - wytwarzają basidiospory (egzospory), wegetatywnie

rozmnażają się przez pączkowanie biegunowe, formują dwujądrową
grzybnię, podzieloną septami

♥ anamorficzne - niezdolne do rozmnażania generatywnego

- morfologia

Budowa komórki zależy od rodzaju, wieku i warunków hodowli.
Kształty komórek drożdży:
♥ kulisty
♥ elipsoidalny
♥ cytrynkowaty
♥ butelkowaty
♥ cylindryczny
♥ nitkowaty
Drożdże mogą tworzyć pseudogrzybnię (pseudomycelium), stworzoną z
komórek, które nie rozdzieliły się po pączkowaniu i tworzą nitkowate
struktury, które mogą się rozdzielać, lub grzybnię właściwą (mycelium),
rosnącą wierzchołkowo, gdzie wewnątrz komórek tworzone są przegrody
(septy).

- rozmnażanie

Drożdże rozmnażają się wegetatywnie, przez podział lub łącząc te dwa
procesy.
W procesie pączkowania, na powierzchni komórki tworzy się pączek, który po
osiągnięciu odpowiednich rozmiarów może się od niej oderwać, co pozostawia
ślady na obu komórkach w postaci blizn. Pączki mogą się tworzyć
jednobiegunowo, dwubiegunowo lub wielobiegunowo (na całej powierzchni
komórki).
Przy rozmnażaniu przez podział komórka rozrasta się na długość, gdy po
osiągnięciu odpowiedniego rozmiaru tworzy się w jej środku przegroda i
następuje oddzielenie się dwóch komórek.
U drożdży występuje także rozmnażania płciowe (generatywne) oparte na
istnieniu różnych typów koniugacyjnych. Połączenie dwóch komórek daje
wówczas diploidalną zygotę, która następnie może się rozmnażać przez
pączkowanie lub rozszczepianie, ale może także przechodzić sporogenezę (w
wyniku której powstają haploidalne spory, które po wykiełkowaniu zdolne są
do rozmnażania wegetatywnego lub koniugowania).

- zarodnikowanie

Diploidalne zygoty przechodzą proces sporulacji, który polega na
mejotycznym podziale jądra i utworzeniu haploidalnych spor. U Ascomycota
komórka zawierająca spory przekształca się w worek, które mogą zawierać od
jednej do czterech spor (przy prawidłowym przebiegu procesu), zdarza się
jednak, że spor jest więcej.
Spory mogą przybierać różne wielkości i kształty (kuliste, elipsoidalne,
nerkowate, itd.). Są stosunkowo odporne na działanie niekorzystnych
warunków środowiska, jak wzrost kwasowości, czy podwyższona temperatura.
Spory mogą kiełkować, przekształcając się w komórki wegetatywne.

5. Grzyby strzępkowe

- klasyfikacja

♥ Zygomycota - grzybnia wielojądrowa, niepodzielona przegrodami

poprzecznymi, w rozmnażaniu bezpłciowym biorą udział spory
wytworzone w sporangiach, rozmnażanie płciowe odbywa się przez
zygospory

♥ Ascomycota - septowane strzępki z przegrodami poprzecznymi o

centrycznie rozmieszczonych otworach, w rozmnażaniu płciowym tworzą
się worki z haploidalnymi zarodnikami

♥ Basidiomycota - podstawczaki

powered by KarolS

4

♥ anamorficzne - niezdolne do rozmnażania płciowego

- morfologia

Plecha grzybów strzępkowych utworzona jest z rozgałęzionych strzępek
tworzących grzybnię (mycelium). Strzępki mogą być podzielone
poprzecznymi przegrodami (septami) na jednojądrowe, dwujądrowe lub
wielojądrowe komórki, lub mogą być niepodzielone i stanowić wielojądrowe
komórki (komórczaki).
Kiełkowanie i kierunek rozwoju strzępki warunkowane są czynnikami
środowiskowymi, takimi jak światło, wilgotność i dotyk.
Spory są formą spoczynkową grzybów strzępkowych, które jednocześnie służą
do reprodukcji. Spory charakteryzują się spowolnioną przemianą
metaboliczną, mogą być ruchliwe i wykazują zdolność przetrwania w
niekorzystnych warunkach środowiska. Do kiełkowania potrzebują wody.
Formy spor:
♥ powstałe w wegetatywnej grzybni



chlamydospory - fragmenty strzępek grzybni dodatkowo obłonione



artrospory - tworzone z końcowych fragmentów strzępek



blastospory - tworzone w wyniku pączkowania strzępki konidionośnej

♥ konidialne (konidia) - tworzone przez anamorfy
♥ askospory (zarodniki) - tworzone w workach (asci) teleomorfów
♥ zygospory - komórki tworzone u Zygomycetes rozmnażających się

płciowo

♥ sporangiospory - umieszczone w zarodni (sporangium) u Zygomycetes w

bezpłciowym rozmnażaniu

- rozmnażanie

U grzybów strzępkowych występuje rozmnażanie bezpłciowe (anamorficzne) i
płciowe (teleomorficzne).
W rozmnażaniu anamorficznym bierze udział jeden organizm haploidalny, gdy
grzybnia, po osiągnięciu dojrzałości fizjologicznej, tworzy specyficzne
struktury służące przetrwaniu i rozprzestrzenianiu.
W rozmnażaniu teleomorficznym uczestniczą komórki płciowe (gamety)
jednoimienne lub różnoimienne, tworzące się w haploidalnych elementach
płciowych (gametangiach). U grzybów, które nie wytwarzają organów
płciowych proces ten może zachodzić pomiędzy wegetatywnymi komórkami o
zróżnicowanej plechowości.

6. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na wzrost drobnoustrojów:
temperatura, pH, aktywność wody w środowisku

Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników środowiska
warunkujących procesy życiowe drobnoustrojów. Wpływa na szybkość
wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórek, wymagania
pokarmowe.
Funkcje życiowe drobnoustrojów mogą przebiegać w zakresie -23-113°C, ale
żaden gatunek nie funkcjonuje w całym tym zakresie.
Dla każdego drobnoustroju można wyznaczyć trzy kardynalne temperatury
rozwoju:
♥ minimalna - poniżej której następuje krzepnięcie membrany

cytoplazmatycznej oraz spowolnienie procesów transportowych,
prowadzące do zahamowania wzrostu

♥ optymalna - przy której występuje maksymalna szybkość większości

reakcji enzymatycznych

♥ maksymalna - przy której następuje denaturacja białek i uszkodzenie błony

cytoplazmatycznej

Temperatury minimalna i maksymalna wyznaczają granicę, poza którą wzrost
komórek jest niemożliwy.
Temperatura optymalna zazwyczaj jest bliższa temperaturze maksymalnej.

powered by KarolS

5

Podział drobnoustrojów w oparciu o kardynalne temperatury rozwoju:

drobnoustroje

zakres temperatur [°C]

minimalna

optymalna

maksymalna

psychrofile

-23-0

~15

≤20

mezofile

10-25

20-37

35-50

termofile

25-45

45-46

60-90

pH to obok temperatury jeden z najważniejszych czynników wpływających na
wzrost drobnoustrojów.
Podział drobnoustrojów w oparciu o preferowane pH środowiska:
♥ acidofile - pH 2,0-5,0 - bakterie mlekowe, octowe, siarkowe, drożdże,

pleśnie (które są w stanie rozwijać się w pH 2,0-9,0)

♥ neutrofile - rosnące najlepiej w pH bliskim obojętnego (6,5-7,5) -

większość drobnoustrojów

♥ alkalofile - pH 8,0-11,0 - bakterie nitryfikujące (Nitrosomonas,

Nitrobacter), oraz bakterie Vibrio cholerae, Sterptococcus pneumoniae,
Enterococcus faecalis, Bacillus, Azotobacter

Wartość aktywności wody w środowisku a

w

określa stosunek ciśnienia par

danego roztworu do ciśnienia par czystej wody:

2

1

2

0

N

N

N

p

p

a

w

+

=

=

, gdzie p - ciśnienie par roztworu, p

0

- ciśnienie par czystej

wody, N

1

- liczba moli substancji rozpuszczonej, N

2

- liczba moli wody

Czysta chemicznie woda ma a

w

=1.

Aktywność wody przy której szybkość wzrostu jest największa określa się
optymalną, natomiast tą, poniżej której wzrost jest zahamowany - minimalną.
Dla większości drobnoustrojów a

w min

=0,95.

♥ bakterie a

w opt

=0,99-0,96

♥ bakterie gnilne i chorobotwórcze a

w opt

=0,995-0,99

♥ bakterie halofilne a

w min

=0,75

♥ drożdże a

w min

=0,88 (0,91-0,60)

♥ drożdże osmofilne (Saccharomyces rouxii, bayanus) a

w min

=0,60

♥ pleśnie a

w min

=0,80 (0,91-0,60)

♥ pleśnie kserofilne (Xeromyces bisporus) a

w min

=0,60

♥ pleśnie osmofilne (Aspergillus glaucus) 80% sacharozy
Drobnoustroje zdolne do wzrostu przy niskiej wilgotności zalicza się do
kserofilnych, wykazujące natomiast wzrost w środowiskach o dużych
stężeniach cukrów do osmofilnych.

powered by KarolS

6