1. Organizacja laboratorium mikrobiologicznego

- układ laboratorium

Laboratorium mikrobiologiczne powinno być podzielone na ciąg pomieszczeń odpowiadających kolejnym etapom pracy mikrobiologicznej:

• pomieszczenie przeznaczone do odbioru, przechowywania i przygotowania próbek do analizy

• pożywkarnia, gdzie sporządza się pożywki mikrobiologiczne, powinna mieścić się w pobliżu sterylizatorni czystej

• sterylizatornia czysta, gdzie wyjaławia się pożywki oraz sprzęt laboratoryjny

• pokój aparaturowy, zawierający aparaturę kontrolno-pomiarową i większy, powszechnie wykorzystywany sprzęt

• pomieszczenie służące do wykonywania analiz

• sterylizatornia brudna, gdzie unieszkodliwia się materiał biologiczny

• zmywalnia, gdzie odbywa się mycie i dezynfekcja zużytego szkła i drobnego sprzętu, powinna być zlokalizowana w pobliżu zarówno sterylizatorni brudnej, jak i czystej

• pomieszczenie magazynowe na szkło

• pomieszczenie magazynowe na odczynniki

• pomieszczenie przeznaczone do prowadzenia dokumentacji i prac administracyjnych

- wyposażenie

Typowe wyposażenie laboratorium mikrobiologicznego:

• niezbędny drobny sprzęt laboratoryjny (np. statywy na probówki, pipety, wanienki do barwienia preparatów, pęsety)

• wyposażenie podstawowe (np. termostaty, chłodziarki, wstrząsarki, sterylizatory, autoklawy)

• wyposażenie pomiarowe (np. termometry, wagi, konduktometry, sprzęt do pomiaru objętości)

• sprzęt specjalistyczny (zależne od specyfiki laboratorium, np. mikromanipulatory, chromatografy, liofilizatory)

- aparatura

Podstawowa aparatura:

• autoklawy - sterylizacja pożywek i sprzętu laboratoryjnego nasyconą parą wodną, powyżej

• pasteryzatory - wyjaławianie w bieżącej parze wodnej pożywek, których skład pozwala na zastosowanie temperatur tylko poniżej100°C

• zestawy do filtracji membranowej - wyjaławianie pożywek, gdy niektóre ich składniki ulegają zniszczeniu w wysokiej temperaturze, oraz do określenia liczby drobnoustrojów metodą filtracyjną

• suszarki - wyjaławianie szkła, naczyń, suszenia substancji, temperatura w przedziale 150°C-

• termostaty (cieplarki, inkubatory) - hodowla drobnoustrojów w kontrolowanej temperaturze

• boksy laminarne (komory laminarne) - bezpyłowe środowisko pracy wyposażone w laminarny przepływ powietrza

• wstrząsarki - hodowla wgłębna drobnoustrojów w warunkach zwiększonego natlenienia

• wirówki laboratoryjne

• anaerostaty - hodowla w warunkach beztlenowych

2. Pożywki hodowlane

- wymagania stawianie pożywkom

• powinny zawierać łatwo dostępne źródło węgla i energii, źródło azotu oraz substancje mineralne i pierwiastki śladowe

• odpowiednia wartość pH

• izotoniczność

• klarowność umożliwiająca makroskopową obserwację wzrostu

- kryteria podziału

Ze względu na konsystencję:

• płynne - do namnażania, uzyskiwania dużej ilości biomasy

• półpłynne (0,1-0,7% agaru) - do badania zdolności ruchowych, do hodowli w warunkach obniżonej zawartości tlenu

• stałe (1,5-2,0% agaru) - do namnażania drobnoustrojów, liczenia, izolowania czystych kultur, różnicowania, przechowywania

Ze względu na zawartość składników spożywczych:

• minimalne - zawierające składniki pokarmowe niezbędne dla podtrzymania badanej funkcji drobnoustroju

• pełne - zapewniające dobry wzrost drobnoustroju

• wzbogacone - przeznaczone dla drobnoustrojów o specjalnych wymaganiach, zawierające poza podstawowymi składnikami odżywczymi również wzbogacające (np. krew, żółtko jaj, mleko)

Ze względu na skład chemiczny:

• syntetyczne – dobrane w proporcjach odczynniki chemiczne

• półsyntetyczne – naturalne składniki + dodatek odczynnika chemicznego (bulion + glukoza)

• naturalne - przygotowane całkowicie ze składników naturalnych (bulion)

Ze względu na sposób użycia:

• transportowe - uniemożliwiające namnażanie się, ze zapewniające przeżycie mikroorganizmów w okresie od pobrania próby do momentu obróbki laboratoryjnej

• do przechowywania - do długoterminowego zabezpieczenia żywotności drobnoustrojów

• namnażające - do otrzymania dużej biomasy drobnoustrojów

• selektywnie namnażające - wspomagają namnażanie się określonych mikroorganizmów, zawierające jednocześnie składniki hamujące wzrost innych

• selektywnie izolacyjne - zawierające oprócz składników odżywczych także składniki wybiórcze, pozwalające na wyodrębnienie danej grupy drobnoustrojów, jednocześnie hamujące wzrost innych

• różnicujące - pozwalające na sprawdzenie jednej lub wielu cech fizjologicznych lub biochemicznych w celu identyfikacji drobnoustrojów

• identyfikacyjne - pozwalają na wstępną identyfikację drobnoustrojów, zawiera składnik pozwalający na ustalenie specyficznych właściwości mikroorganizmów (np. wskaźnik pH)

- przygotowanie

Pożywki mikrobiologiczne mogą być nabywane w postaci gotowej lub w postaci odwodnionej. Można je także wykonywać w laboratorium, poprzez odważenie poszczególnych składników pożywki, rozpuszczenie ich w wodzie, skorygowanie pH (NaOH lub HCl) , zakorkowanie oraz wyjałowienie.

- wyjaławianie

• sterylizacja - niszczenie form wegetatywnych i przetrwalników, zakres temperatur 117-121°C + podciśn, czas sterylizacji 15 min, w autoklawach

• pasteryzacja - wyjaławianie pożywek, której składniki ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej , niszczenie tylko form wegetatywnych, stosowane temperatury poniżej , czas nawet do godziny

• tyndalizacja - trzykrotna pasteryzacja pożywki, w odstępach 24 godzinnych, formy przetrwalne przechodzą w w 24h w wegetatywne

• mechaniczne – filtracja membranowa. Pożywka sączona przez filtr

• wyjaławianie powietrza- lampy UV

3. Bakterie

- morfologia

Kształt komórek podlega zmianom pod wpływem wieku hodowli i warunków środowiska.

Kształty komórek bakterii:

• kulisty

  • ziarniaki (coccus)

    • forma pojedyncza - micrococcus

    • dwoinki - diplococcus (komórki dzielą się w jednej płaszczyźnie i po podziale dwie komórki zostają połączone)

    • paciorkowce - streptococcus (komórki dzielą się w jednej płaszczyźnie i po podziale komórki pozostają połączone w formie łańcuszka)

    • czworniaki - tetracoccus (komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach prostopadłych do siebie

    • pakietowce - sarcina (dzielą się w trzech płaszczyznach, regularnie w czasie)

    • gronkowce - staphylococcus (dzielą się w dwóch lub trzech płaszczyznach, nieregularnie w czasie)

• cylindryczny - proste lub lekko wygięte, występują w formach mono, diplo i strepto

  • pałeczki - Bacterium (nie tworzą przetrwalników)

  • laseczki - Bacillus (tworzą przetrwalniki)

  • maczugowce - Corynebacterium

  • wrzecionowce - Fusobacterium

  • prątki - Mycobacterium

• spiralny - występują w formach mono

  • przecinkowce - Vibrio

  • śrubowce - Spirillum

  • krętki - Spirochaeta

• postacie bakterii śluzowych

• promieniowce - wykazują podobieństwo do grzybów wytwarzając pseudogrzybnię, ale budowa i skład ściany komórkowej wskazują na podobieństwo do bakterii G (+)

- ruch

Najczęściej zdolność ruchu wykazują bakterie o kształcie cylindrycznym i spiralnym. Bakterie kuliste są z reguły nieruchliwe.

Najbardziej ruchliwe są komórki w hodowlach młodych. Z wiekiem możliwości ruchowe mogą się pogarszać, a nawet zupełnie zaniknąć. Zdarza się także, że u niektórych bakterii ruchliwe są zarówno formy wegetatywne, jak i przetrwalnikowe. W środowisku wodnym ruch postępowy, w środ. Płynnym lub półpłynnym rotacyjny.

Zdolność do poruszania się wiąże się z obecnością rzęsek. Umożliwiają zmianę położenia komórki ze względu na bodźce - zarówno korzystne, jak i niekorzystne. Taki ruch wywołany bodźcem nazywa się taksją. Rzęska zbudowana z flageliny, kształt lekko skręconej spirali, składa się z ciałka podstawowego, haka, włókna

Rzęski mogą wyrastać na jednym, obu biegunach komórki, bocznie lub na całej jej powierzchni, co dzieli urzęsienia na:

• monotrychalne - monopolarne o jednej rzęsce,

• bipolarne- bipolarne o jednej rzęsce

• lofotrychalne - monopolarne o pęczku rzęsek

• amfitrychalne - bipolarne o pęczku rzęsek

• perytrychalne - umiejscowione wzdłuż komórki lub na całej powierzchni

- taksje: chemotaksje, fototaksje, aerotaksje, termotaksje, magnetotaksje.

- bakterie gram + i – różnice:

• gram +: 40 warstw peptydoglikan (mureina), błona cytoplazmatyczna, cytoplazma

• gram -: zewnętrzna błona, 2-3 warstwy mureiny, błona cytoplazmatyczna, cytoplazma.

- przetrwalnikowanie

Zdolność tworzenia przetrwalników (endospor) wykazują głównie bakterie cylindryczne G(+), podczas gdy G(-) nie posiadają tej umiejętności.

Przetrwalnikowanie (sporulacja) zapoczątkowywana jest brakiem odpowiednich substratów w środowisku, niekorzystnymi właściwościami środowiska lub starzeniem się komórki.

Spory w komórce mogą być ułożone terminalnie lub subterminalnie, natomiast sama komórka może zachować pierwotną wielkość i kształt lub może się rozdąć w miejscu występowania przetrwalnika.

Powstanie przetrwalnika poprzedza proces replikacji DNA, synteza związków swoistych dla endospor oraz nabieranie swoistej odporności na czynniki zewnętrzne (temperaturę, wysychanie, promienie UV).

Bakterie wytwarzają zazwyczaj z reguły jeden przetrwalnik powstający wewnątrz komórki wegetatywnej.

W sprzyjających warunkach następuje kiełkowanie przetrwalnika, obejmujące aktywację, zapoczątkowanie kiełkowania i rozrost komórki.

U niektórych bakterii występują inne formy przetrwalnikowania, taki jak cysty (powstające z całej komórki wegetatywnej w chwili wyczerpania się składników odżywczych, bardziej niż endospory wrażliwe na czynniki temperaturowe), egzospory (powstające w wyniku pączkowania komórek wegetatywnych, o własnościach bliskich endosporom), mikrocysty (postać spoczynkowa bakterii śluzowych) i mikrospory.

- diagnostyczne barwienie metodą Grama

Bakterie gramdodatnie i gramujemne wykazują różnicę zarówno w składzie chemicznym, jak i budowie przestrzennej ściany komórkowej, a co za tym idzie różnice w odporności oraz treści wewnątrzkomórkowej.

W metodzie barwienia Grama utrwalone komórki wybarwia się barwnikami zasadowymi, a następnie traktuje płynem Lugola, w wyniku czego w komórce powstaje kompleks barwnika z jodem. Zastosowanie kąpieli różnicującej powoduje u jednej grupy bakterii odbarwienie komórek (bakterie gramujemne), u drugiej natomiast zatrzymanie w komórkach utworzonego kompleksu barwników (bakterie gramdodatnie). Następnie odbarwione komórki dobarwia się barwnikiem kontrastowym w celu ich uwidocznienia.

Bakterie gramujemne barwią się na różowo, a gramdodatnie na fioletowo.

- metody hodowli

Uzależnione od zapotrzebowania na tlen: tlenowce (bacillus) , względne beztlenowce (e.coli) , bezwzględne beztlenowce (clostridium sp.) , mikroaerofile (obniżona zawartość tlenu, więcej CO₂- lactobacillus)

Metody hodowli bakterii:

• płynna

• na skosie

• płytkowa

• powierzchniowa - posiew następuje na powierzchni pożywki

• wgłębna - metoda zalewowa

• w wysokim słupie pożywki - pożywka stała w którą wszczepia się igłą drobnoustroje, z czasem słup pożywki jest rozrywany na skutek wydzielania gazów

• w pożywce z korkiem beztlenowym - stosowanie korka z waty nasączanego płynem absorbującym i uszczelnienie naczynia korkiem lub parafiną

• w anaerostacie - hodowla w próżni lub atmosferze gazu obojętnego

• w pożywkach z dodatkiem tkanki roślinnej i zwierzęcej - tkanka roślinna lub zwierzęca w pożywce płynnej ma za zadanie adsorpcję tlenu ze środowiska

• symbiotyczna (metoda Fortnera) - na dwie oddzielone od siebie części pożywki na płytce Petriego posiewa się dwa szczepy drobnoustrojów - tlenowy i beztlenowe, następnie płytki uszczelnia się, w pierwszej kolejności wyrasta tlenowiec, który wykorzystując cały tlen stwarza atmosferę beztlenową, dobrą dla rozwoju beztlenowca

Metody stosowane do hodowli bezwzględnych beztlenowców:

• fizyczne

• usunięcie tlenu poprzez wygotowanie płynnej pożywki, szybkie schłodzenie i zalanie warstwą jałowego oleju parafinowego

• płytkowa wgłębna

• w anaerostacie

• w pożywce płynnej zawierającej tkankę roślinną lub zwierzęcą

• w wysokim słupie pożywki stałej

• w komorze do przeszczepień i hodowli w warunkach beztlenowych

• chemiczne

• dodanie do pożywki substancji redukujących, które wiążą tlen

• w pożywce z korkiem beztlenowym

• katalityczne wiązanie wodoru z tlenem w anaerostacie

• biologiczne

• metoda Fortnera- przedzielone pożywki z bakteriami tlenowymi i beztlenowymi

4. Drożdże

Org. Eukariotyczne, mają jedno jądro otoczone błoną komórkową, energię czerpią z związków organicznych

- klasyfikacja

• Ascomycota - wytwarzają askospory (zarodniki wewnątrz worka), wegetatywnie rozmnażają się przez pączkowanie wieloboczne

• Basidiomycota - wytwarzają basidiospory (egzospory), wegetatywnie rozmnażają się przez pączkowanie biegunowe, formują dwujądrową grzybnię, podzieloną septami

• anamorficzne - niezdolne do rozmnażania generatywnego

- morfologia

Budowa komórki zależy od rodzaju, wieku i warunków hodowli.

Kształty komórek drożdży:

• kulisty

• elipsoidalny

• cytrynkowaty

• butelkowaty

• cylindryczny

• nitkowaty

Drożdże mogą tworzyć pseudogrzybnię (pseudomycelium), stworzoną z komórek, które nie rozdzieliły się po pączkowaniu i tworzą nitkowate struktury, które mogą się rozdzielać, lub grzybnię właściwą (mycelium), rosnącą wierzchołkowo, gdzie wewnątrz komórek tworzone są przegrody (septy).

- rozmnażanie

Drożdże rozmnażają się wegetatywnie, przez podział lub łącząc te dwa procesy.

W procesie pączkowania, na powierzchni komórki tworzy się pączek, który po osiągnięciu odpowiednich rozmiarów może się od niej oderwać, co pozostawia ślady na obu komórkach w postaci blizn. Pączki mogą się tworzyć jednobiegunowo, dwubiegunowo lub wielobiegunowo (na całej powierzchni komórki).

Przy rozmnażaniu przez podział komórka rozrasta się na długość, gdy po osiągnięciu odpowiedniego rozmiaru tworzy się w jej środku przegroda i następuje oddzielenie się dwóch komórek.

U drożdży występuje także rozmnażania płciowe (generatywne) oparte na istnieniu różnych typów koniugacyjnych. Połączenie dwóch komórek daje wówczas diploidalną zygotę, która następnie może się rozmnażać przez pączkowanie lub rozszczepianie, ale może także przechodzić sporogenezę (w wyniku której powstają haploidalne spory, które po wykiełkowaniu zdolne są do rozmnażania wegetatywnego lub koniugowania).

- zarodnikowanie

Diploidalne zygoty przechodzą proces sporulacji, który polega na mejotycznym podziale jądra i utworzeniu haploidalnych spor. U Ascomycota komórka zawierająca spory przekształca się w worek, które mogą zawierać od jednej do czterech spor (przy prawidłowym przebiegu procesu), zdarza się jednak, że spor jest więcej.

Spory mogą przybierać różne wielkości i kształty (kuliste, elipsoidalne, nerkowate, itd.). Są stosunkowo odporne na działanie niekorzystnych warunków środowiska, jak wzrost kwasowości, czy podwyższona temperatura.

Spory mogą kiełkować, przekształcając się w komórki wegetatywne.

5. Grzyby strzępkowe

- klasyfikacja

• Zygomycota – (sprzężniaki) grzybnia wielojądrowa, niepodzielona przegrodami poprzecznymi, w rozmnażaniu bezpłciowym biorą udział spory wytworzone w sporangiach, rozmnażanie płciowe odbywa się przez zygospory

• Ascomycota – (workowce) septowane strzępki z przegrodami poprzecznymi o centrycznie rozmieszczonych otworach, w rozmnażaniu płciowym tworzą się worki z haploidalnymi zarodnikami

• Basidiomycota - podstawczaki

• anamorficzne – (anamorfy) niezdolne do rozmnażania płciowego

- morfologia

Plecha grzybów strzępkowych utworzona jest z rozgałęzionych strzępek tworzących grzybnię (mycelium). Strzępki mogą być podzielone poprzecznymi przegrodami (septami) na jednojądrowe, dwujądrowe lub wielojądrowe komórki, lub mogą być niepodzielone i stanowić wielojądrowe komórki (komórczaki).

Kiełkowanie i kierunek rozwoju strzępki warunkowane są czynnikami środowiskowymi, takimi jak światło, wilgotność i dotyk.

Spory są formą spoczynkową grzybów strzępkowych, które jednocześnie służą do reprodukcji. Spory charakteryzują się spowolnioną przemianą metaboliczną, mogą być ruchliwe i wykazują zdolność przetrwania w niekorzystnych warunkach środowiska. Do kiełkowania potrzebują wody.

Formy spor:

• powstałe w wegetatywnej grzybni

• chlamydospory - fragmenty strzępek grzybni dodatkowo obłonione

• artrospory - tworzone z końcowych fragmentów strzępek

• blastospory - tworzone w wyniku pączkowania strzępki konidionośnej

• konidialne (konidia) - tworzone przez anamorfy

• askospory (zarodniki) - tworzone w workach (asci) teleomorfów

• zygospory - komórki tworzone u Zygomycetes rozmnażających się płciowo

• sporangiospory - umieszczone w zarodni (sporangium) u Zygomycetes w bezpłciowym rozmnażaniu

- rozmnażanie

U grzybów strzępkowych występuje rozmnażanie bezpłciowe (anamorficzne) i płciowe (teleomorficzne).

W rozmnażaniu bezpłciowym:

zarodniki tworzone na grzybni powietrznej- konidioforach, np. aspergillus,

zarodniki tworzone w zarodniach na grzybniach powietrznych sporangioforach, np. mucor,

konidia tworzone na szczycie strzępki- artrospor, np. geotrichum

W rozmnażaniu płaciowym:

U zygomycota i ascomycota z gamet jedno lub różnoimiennych powstaje zygota.

6. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na wzrost drobnoustrojów: temperatura, pH, aktywność wody w środowisku

Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników środowiska warunkujących procesy życiowe drobnoustrojów. Wpływa na szybkość wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórek, wymagania pokarmowe.

Funkcje życiowe drobnoustrojów mogą przebiegać w zakresie -23-121°C, ale żaden gatunek nie funkcjonuje w całym tym zakresie.

Dla każdego drobnoustroju można wyznaczyć trzy kardynalne temperatury rozwoju:

• minimalna - poniżej której następuje krzepnięcie membrany cytoplazmatycznej oraz spowolnienie procesów transportowych, prowadzące do zahamowania wzrostu

• optymalna - przy której występuje maksymalna szybkość większości reakcji enzymatycznych

• maksymalna - przy której następuje denaturacja białek i uszkodzenie błony cytoplazmatycznej

Temperatury minimalna i maksymalna wyznaczają granicę, poza którą wzrost komórek jest niemożliwy.

• Psychrofile- temp min 0◦C, niektóre -23, pot <15, max 20, oceany, szczyty górskie, bacillus, clostridium

• Psychrotrofy- Min 0, optym >20, max ok 35, woda morska, gleba, żywność, pseudomonas, geotrichum

• Mezofile- optym 25- 40, dużo patogennych dla człowieka, wiele gat grzybów

• Termofile- optym>60 (bakterie), min >20, bacillus, clostridium, niektóre grzyby strzępkowe, drożdże

• hipertermofile

Podział drobnoustrojów w oparciu o kardynalne temperatury rozwoju:

drobnoustroje	zakres temperatur [°C]
	minimalna
psychrofile	-23-0
mezofile	10-25
termofile	25-45

pH to obok temperatury jeden z najważniejszych czynników wpływających na wzrost drobnoustrojów.

Podział drobnoustrojów w oparciu o preferowane pH środowiska:

• acidofile - pH <4- bakterie mlekowe, siarkowe, drożdże, pleśnie (które są w stanie rozwijać się w pH 2,0-9,0)

• neutrofile - rosnące najlepiej w pH bliskim obojętnego (6,5-7,5) - większość drobnoustrojów

• alkalofile - pH >9 - bakterie nitryfikujące (Nitrosomonas, Nitrobacter), oraz bakterie Vibrio cholerae, Sterptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Bacillus, Azotobacter

Wartość aktywności wody w środowisku a_w określa stosunek ciśnienia par danego roztworu do ciśnienia par czystej wody:

, gdzie p - ciśnienie par roztworu, p₀ - ciśnienie par czystej wody, N₁ - liczba moli substancji rozpuszczonej, N₂ - liczba moli wody

Czysta chemicznie woda ma a_w=1.

Aktywność wody przy której szybkość wzrostu jest największa określa się optymalną, natomiast tą, poniżej której wzrost jest zahamowany - minimalną.

Dla większości drobnoustrojów a_{w min}=0,95.

• bakterie a_{w opt}=0,99-0,96

• bakterie gnilne i chorobotwórcze a_{w opt}=0,995-0,99

• bakterie halofilne a_{w min}=0,75

• drożdże a_{w min}=0,88 (0,91-0,60)

• drożdże osmofilne (Saccharomyces rouxii, bayanus) a_{w min}=0,60

• pleśnie a_{w min}=0,80 (0,91-0,60)

• pleśnie kserofilne (Xeromyces bisporus) a_{w min}=0,60

• pleśnie osmofilne (Aspergillus glaucus) 80% sacharozy

Drobnoustroje zdolne do wzrostu przy niskiej wilgotności zalicza się do kserofilnych, wykazujące natomiast wzrost w środowiskach o dużych stężeniach cukrów do osmofilnych.