ćwiczenie 5

ODZYSKIWANIE FRAGMENTÓW DNA Z ŻELI ELEKTROFORETYCZNYCH

W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji

DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:

1. DNA uzyskany w wyniku klonowania zazwyczaj poddawany jest subklonowaniu, tzn. insert lub jego fragment zostaje

przeniesiony z jednego wektora do innego. Przeniesienie insertu do nowego wektora jest konieczne, gdyż wektory stosowane do
klonowania DNA nie dają takich możliwości badawczych, jakie można uzyskać z wykorzystaniem innych wektorów, np.
wektorów ekspresyjnych lub wektorów do transformacji organizmów eukariotycznych.

2. Subklonowanie konieczne jest również wówczas, gdy w wyniku klonowania uzyskano duży fragment DNA, np. klon

genomowy obejmujący kilka genów, a celem pracy jest sklonowanie pojedynczego genu lub jego fragmentu.

3. Elucja z żelu elektroforetycznego wykonywana jest również wtedy, gdy sklonowany fragment DNA, chcemy oddzielić od

wektora a aby poddać go reakcji znakowania, np. radioaktywnym izotopem. W niektórych przypadkach DNA po znakowaniu,
ponownie poddawany jest elektroforezie, tym razem w celu oddzielenia wyznakowanej cząsteczki od radioaktywnych
nukleotydów, które nie zostały do niej wbudowane.

Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli

agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy
niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29

o

C i

depolimeryzują w temp. +65

o

C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną

frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia
DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w –80

o

C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje

odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości,
umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej
agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach.

Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą

należałoby zastosować, czyli ponad +60

o

C, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy

wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu
często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki
z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego
osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką
wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.

Elucja wykonana przy zastosowaniu DEAE-celulozy (dietyloaminoetyl) nie

wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie
rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy
umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości
jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy
stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy,
obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE
celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu.

DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na

filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem.

W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się

stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych. W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do
woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA
migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z
woreczka do nowej probówki.

Oprócz przedstawionych technik spotkać można wiele innych sposobów odzyskiwania DNA z żeli agarozowych.

DNA z żeli poliakryloamidowych często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do

elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje
wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1%
SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z
rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony
DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.

Sprzęt i odczynniki

–

agaroza niskotopliwa

–

trawiony DNA

–

aparaty elektroforetyczne

–

obciążacz LB

–

skalpel pęseta

–

DEAE celuloza (Schleicher & Schuell

NA-45

®

)

–

buf. NTE "low"

–

buf. NTE "high"

–

fenol

–

chloroform

–

bufor TE 10/1

–

octan amonu 10M

–

etanol 96%

–

etanol 75%

Postępowanie

I. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem ekstrakcji fenolowej

1. Przygotować 1% żel z agarozy niskotopliwej,

zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5

μg/ml.

2. Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z

barwnikiem elektroforetycznym.

3. Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do

depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
niskim napięciu prądu (<100V).

4. W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający

prążek DNA i przenieść go do probówki eppendorfa.
Należy skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w
świetle UV oraz odciąć większość agarozy, która nie
zawiera DNA.

5. Stopić wycięty fragment żelu w temp. +65

o

C.

6. Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE

i wymieszać. Jeżeli w próbie widoczne są fragmenty
nierozpuszczonego żelu, kontynuować topnienie.

7. Po rozpuszczeniu agarozy preparat ekstrahować 1 objętością

fenolu, przez ok. 2 min., a następnie próbę zwirować w
mikrowirówce przez 5 min.

8. Fazę wodną, zawierającą DNA, przenieść do nowej

probówki eppendorfa uważając, aby nie pobrać interfazy
występującej pomiędzy fazą wodną i fenolową, gdyż
zawiera ona agarozę.

9. Fazę wodną ekstrahować 1 objętością mieszaniny

chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) przez 2 min. i
wirować w mikrowirówce przez 5 min.

10. Z zebranej fazy wodnej wytrącić DNA dodając 0,2 objętości

10 M octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95%
etanolu. Próbę trzymać 10 min w -20

o

C.

11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić

elektroforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.

II. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem zamrażania.

1. Przygotować 1% żel z niskotopliwej agarozy

zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5

μg/ml.

2. Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z

barwnikiem elektroforetycznym.

3. Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do

depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
niskim napięciu prądu (<100V).

4. W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający prążek

DNA i przenieść go do probówki Eppendorfa. Należy
skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w świetle UV
oraz odciąć większość agarozy, która nie zawiera DNA.

5. Fragment żelu zawierający DNA stopić w temp. +65

o

C.

6. Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE i

wymieszać całość. Jeżeli w próbie widoczne są
fragmenty nierozpuszczonego żelu, kontynuować
topnienie.

7. Po stopieniu agarozy próbę zamrozić w -80

o

C.

8. Po rozmrożeniu preparat wirować przez 5 min. przy 12

tyś. RPM.

9. Ostrożnie oddzielić supernatant, zawierający DNA, od

osadu zawierającego agarozę.

10. DNA z supernatantu wytrącić dodając 0,2 objętości 10M

octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95% etanolu.
Próbę inkubować przez 10 min w temp. -20

o

C.

11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić

elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.

III. Odzyskiwanie DNA z wykorzystaniem DEAE-celulozy.

Bufor NTE "low"

Bufor NTE "high”

Przygotowanie DEAE celulozy do pracy

150 mM NaCl

1,0 M NaCl

0,1 mM EDTA

0,1 mM EDTA

20 mM Tris-HCl pH 8,0 20 mM Tris-HCl pH 8,0

Przycięte skrawki DEAE-celulozy płukać w następujących warunkach:
1. 5 min w 10mM EDTA
2. 5 min w 0,5N M NaOH
3. 6 razy w sterylnej wodzie

4.

bibułki przechowywać w wodzie w +4

o

C.

1. Przygotować 1% żel agarozowy zawierający bromek

etydyny o stęż. 2,5

μg/ml.

2. Na żel nałożyć DNA plazmidowy, po reakcji

restrykcyjnej.

3. Prowadzić elektroforezę.
4. Wykonać skalpelem nacięcie tuż pod prążkiem DNA

przeznaczonym do elucji.

5. W uzyskanej szczelinie umieścić odpowiednio

przycięty fragment bibułki DEAE-celulozy.

6. Żel ponownie umieścić w aparacie

elektroforetycznym i kontynuować rozdział do czasu,
aż prążek zostanie całkowicie zaadsorbowany przez
bibułkę (ok. 5-10 min).

7. Bibułki wyjąć z żelu i sprawdzić w świetle UV czy

cały DNA został na nie przeniesiony.

8. Bibułkę pociąć sterylnymi nożyczkami, umieścić w

probówce eppendorfa i zalać 500

μl medium NTE

"low", po czym wytrząsać ok. 30 sek. w celu usunięcia
resztek agarozy.

9. Po usunięciu buf. „low” zalać bibułkę 100

μl buforu

NTE "high". Próbę inkubować przez 15 min. w temp.
+65

o

C. W roztworze o wysokiej sile jonowej następuje

uwolnienie DNA z DEAE celulozy.

10. Roztwór znad bibułki przenieść do nowej probówki

eppendorfa i wytrącić DNA 2,5 objętościami
schłodzonego, 98% etanolu. Próbę trzymać 10 min w
temp. -20

o

C.

11. Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić

elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.