1
ZAKŁAD BIOCHEMII
UMCS
BIOCHEMIA II
I rok II stopnia
Biochemia
ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO GLUTATIONU
Wstęp
Oznaczanie składu aminokwasowego białek i peptydów obejmuje dwa etapy:
1) hydrolizę (uzyskanie wolnych aminokwasów) i 2) rozdział tych aminokwasów metodami
chromatograficznymi.
Hydroliza próbki musi być całkowita, tzn. dać w wyniku wyłącznie wolne aminokwasy i nie powinna
powodować zmian w ich cząsteczkach. Istnieją dwie metody hydrolizy - chemiczna i enzymatyczna.
1.
Hydroliza chemiczna (alkaliczna lub kwaśna) polega na działaniu wysokich temperatur (ok. 100°C) w
środowisku o skrajnych wartościach pH. Powoduje ona uwolnienie wszystkich aminokwasów, ale też częściowe
zniszczenie niektórych z nich (hydroliza kwaśna – cystyny i metioniny, hydroliza alkaliczna - tryptofanu).
2.
Hydroliza enzymatyczna polega na trawieniu białka za pomocą enzymów proteolitycznych. Ich działanie
nie uszkadza poszczególnych aminokwasów, lecz nie prowadzi również do całkowitej hydrolizy łańcucha
polipeptydowego. W wyniku działania enzymów proteolitycznych powstaje mieszanina wolnych aminokwasów
i oligopeptydów, którą trudno rozdzielić metodami chromatograficznymi na poszczególne składniki.
Z obu metod hydrolizy wybiera się wiec tę, która dogodniejsza jest w danych warunkach
doświadczalnych. Do celów rutynowej analizy najwygodniej jest stosować hydrolizę kwaśna, przy pomocy 6N
HCl w temp. wrzącej łaźni wodnej. Czas trwania procedury zależy od rodzaju hydrolizowanej próbki i wynosi:
30-60 min. dla oligopeptydów, 12-24 godz. dla białek (polipeptydów).
Do rozdzielania mieszaniny aminokwasów uzyskanych w wyniku hydrolizy peptydów stosuje się
zwykle jedną z trzech metod chromatograficznych: chromatografię bibułową, cienkowarstwową lub
jonowymienną.
Chromatografia bibułowa pozwala na rozdział mieszaniny kilku aminokwasów w bardzo prosty i
ekonomiczny sposób. Dla mieszaniny kilkunastu aminokwasów (powstałe w wyniku hydrolizy polipeptydu)
należy stosować chromatografię dwukierunkową, co proces rozdziału komplikuje i wydłuża w czasie.
Chromatografia cienkowarstwowa pozwala na rozdział małych ilości aminokwasów, rzędu
mikromoli. Rozdział przeprowadzany jest dwukierunkowo, na płytkach pokrytych sproszkowaną celulozą
(nośnikiem analogicznym do stosowanego w chromatografii bibułowej) lub sproszkowanym tworzywem
sztucznym - poliamidem. Użycie do rozdziału chemicznych pochodnych aminokwasów, np. dansylo-
aminokwasów, zwiększa czułość metody i pozwala na rozdział nanomoli aminokwasów w postaci ich
pochodnych.
Obie metody - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa pozwalają na analizę jakościową
mieszaniny aminokwasów w hydrolizacie.
Chromatografia jonowymienna pozwala na ilościową analizę - określenie stężeń aminokwasów w
2
hydrolizacie peptydów i w związku z tym stosowana jest do badań rutynowych w specjalnie wyposażonych
laboratoriach. Z reguły do analizy służy automatyczny zestaw - analizator aminokwasów, który umożliwia
rozdział dużych ilości hydrolizatu na kolumnach wypełnionych syntetycznymi żywicami jonowymiennymi.
Uzyskane wyniki pozwalają na dokładne obliczenie procentowej zawartości aminokwasów w badanej próbie, z
uwzględnieniem poprawek dotyczących aminokwasów ulegających przekształceniom w wyniku hydrolizy.
Glutation jest trójpeptydem, który do całkowitej hydrolizy wymaga 30 min., przy zastosowaniu
stężonych kwasów i temp. 100°C. Aminokwasy wchodzące w skład glutationu nie ulegają przy tym
uszkodzeniom i można je rozdzielić po hydrolizie stosując jednokierunkową chromatografię bibułową.
Wykonanie ćwiczenia:
Hydroliza glutationu
Do 2 probówek odważyć po 5 mg glutationu: do jednej - 5 mg preparatu otrzymanego na
wcześniejszych ćwiczeniach, a do drugiej - 5 mg wzorcowego preparatu glutationu.
Do obu probówek dodać po l ml mieszaniny HCl i HCOOH (w stos. 1:1). Zatkane korkami probówki wstawić
do wrzącej łaźni wodnej na 30 min.
Po tym czasie hydrolizaty przenieść do odpowiednich parowniczek, odparować je do sucha na wrzącej
łaźni wodnej, a uzyskane osady rozpuścić w 0,5 ml 0,01N roztworu HCl. Uzyskane w ten sposób roztwory
nanosić na bibułę chromatograficzną.
Rozdział chromatograficzny
Na arkuszu bibuły Whatman nr 1, o wymiarach 12 cm x 20 cm, zaznaczyć ołówkiem w odległości 2 cm
od krótszego boku linią startu. Na niej zaznaczyć punkty naniesienia dla: hydrolizatu uzyskanego wcześniej
preparatu, hydrolizatu wzorcowego preparatu glutationu, roztworów wzorcowych aminokwasów.
Na zaznaczone punkty nanosić kroplami odpowiednie roztwory, za każdym razem susząc bibułę
strumieniem gorącego powietrza.
Bibułę z naniesionymi próbkami umieścić w komorze chromatograficznej zawierającej 200 ml
rozwijającego układu rozpuszczalników: butanol - kwas octowy - woda (w stos. 3:1:1). Zamknąć szczelnie
komorę i rozwijać chromatogram 2,5 godz.
Po tym czasie, chromatogram wyjąć z komory, wysuszyć strumieniem gorącego powietrza i wywołać
zwilżając bibułę 0,1% roztworem ninhydryny w acetonie, a następnie susząc ponownie w celu uwidocznienia
barwnych plam aminokwasów.
3
Zaliczenie ćwiczenia:
Przerysować do zeszytu rozwinięty chromatogram. Wyznaczyć wartości R
f
dla próby badanej i prób
kontrolnych oraz przedstawić opis ćwiczenia w zeszycie.
4
Odczynniki i sprzęt:
glutation (wzorcowy)
10mg
mieszanina HCl : HCOOH w stos. 1:1
10ml
0,01N HCl
10ml
wzorcowy r-r kwasu glutaminowego
10ml
wzorcowy r-r cysteiny
10ml
wzorcowy r-r glicyny
10ml
0,1% r-r ninhydryny w acetonie
200ml
rozwijacz (butanol: kwas octowy: woda) w stos. 3:1:1
200ml
parowniczki
2 szt
bibuła Whatman nr 1 o wymiarach 12x20cm
1 szt.
komora chromatograficzna
1 szt.
suszarka
1 szt.
Piśmiennictwo:
1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa.
2. Berg J.M., Stryer L., Tymoczko J.L., 2009, Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
3. Jakubke, H-D., Jeschkeit, H., 1989, Aminokwasy, peptydy, białka. PWN, Warszawa.