1

Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2013

Teoria

I. Podło

ż

a mikrobiologiczne.

Podło

ż

e mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone

ś

rodowisko do hodowli

drobnoustrojów. Zawieraj

ą

w postaci przyswajalnych zwi

ą

zków, pierwiastki uczestnicz

ą

ce w

tworzeniu masy komórkowej. Mikroorganizmy do wzrostu wymagaj

ą

ź

ródła energii i w

ę

gla, siarki,

azotu, tlenu, soli mineralnych i czasem tzw. czynników wzrostowych. Czynniki wzrostowe to

substancje od

ż

ywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i pirymidynowe.

Substancje te wchodz

ą

w skład komórek, ale nie wszystkie organizmy potrafi

ą

je syntetyzowa

ć

.

Organizmy wymagaj

ą

ce do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywaj

ą

si

ę

auksotrofami ( np. auksotrof uracylu), w odró

ż

nieniu do prototrofów, które nie s

ą

uzale

ż

nione od dodatkowych substancji od

ż

ywczych.

Ze wzgl

ę

du na skład, podło

ż

a dzielimy na a) minimalne, b) pełne c) wzbogacone.

Podło

ż

a a) minimalne zawieraj

ą

tylko

ź

ródło energii, w

ę

gla i sole mineralne oraz czasem

pojedyncze czynniki wzrostowe (dla dro

ż

dzy jest to np. podło

ż

e SD, syntetic dextrose) . Odmian

ą

podło

ż

a SD jest tzw. SC, czyli minimalne z dodatkiem mieszaniny aminokwasów, lub bez

okre

ś

lonego czynnika (np. SC-leu, bez leucyny) .

Podło

ż

a b) pełne zawieraj

ą

wszystkie substancje niezb

ę

dne do dobrego wzrostu

drobnoustrojów (

ź

ródło w

ę

gla, azotu, sole mineralne, wiele czynników wzrostowych), (dla dro

ż

d

ż

y

jest to np. podło

ż

e YPD, yeast peptone-dextrose).

Podło

ż

a wzbogacone stosuje si

ę

do hodowli drobnoustrojów słabo rosn

ą

cych in vitro,

wymagaj

ą

cych dodatkowych substancji od

ż

ywczych. Jako czynniki wzbogacaj

ą

ce podło

ż

a stosuje

si

ę

: krew, surowic

ę

, płyny wysi

ę

kowe, wyci

ą

g w

ą

trobowy, mleko,

ż

ółtko jaj, sok z pomidorów.

Przykładowe po

ż

ywki dro

ż

d

ż

owe:

Podło

ż

e minimalne SD:

Zestaw soli mineralnych

6,7 g

Glukoza

20 g

Woda destylowana

1000 ml

Podło

ż

e pełne YPD:

Bacto-Ekstrakt dro

ż

d

ż

owy

10 g

Bacto-Pepton

20 g

Glukoza

20 g

Agar

20 g

Woda destylowana

1000 ml

PYTANIA

1. Jak nazwiemy szczep który ro

ś

nie na podło

ż

u minimalnym

2. Jak nazwiemy szczep który nie potrafi syntetyzowa

ć

leucyny?

3. Czy wyro

ś

nie on na podło

ż

u a) SD b) Sc-leu, c) YPD d) SD+leu

II. Dro

ż

d

ż

e Saccharomyces cerevisiae, genetyczny organizm modelowy

Dro

ż

d

ż

e Saccharomyces cerevisiae s

ą

modelowym organizmem eukariotycznym. Cechuj

ą

si

ę

:

niewielkim genomem (zawieraj

ą

cym około 6 ty

ś

. genów), mał

ą

liczb

ą

chromosomów, oraz krótkim

2

czasem podziału komórkowego (w warunkach optymalnych 90 min). S

ą

mikroorganizmami łatwymi do

hodowli (mo

ż

na je zamra

ż

a

ć

, s

ą

niewielkich rozmiarów itp.) i manipulacji genetycznych. Nie formuj

ą

grzybni, rozmna

ż

aj

ą

si

ę

wegetatywnie przez p

ą

czkowanie. Ogromn

ą

zalet

ą

dro

ż

d

ż

y jest mo

ż

liwo

ść

utrzymywania ich zarówno jako haplo- b

ą

d

ź

diploidów. Haploidy mog

ą

wyst

ę

powa

ć

jako dwa typy

kojarzeniowe: a lub

α

. Ró

ż

ni

ą

si

ę

od siebie genetycznie locus MAT, okre

ś

laj

ą

cym typ kojarzeniowy.

Wyst

ę

puj

ą

dwa allele tego locus: MATa i MAT

α

. Szczep MATa kojarzy si

ę

ze szczepem MAT

α

poprzez

kompleksowy proces cytoplazmatycznej i j

ą

drowej fuzji dzi

ę

ki czemu powstaje komórka 2n (a/

α

).

Pod wzgl

ę

dem zmienno

ś

ci typu kojarzeniowego wyró

ż

nia si

ę

dro

ż

d

ż

e stabilne

(heterotalliczne) i niestabilne (homotalliczne). Jest to uzale

ż

nione od genu HO, który odpowiada za

zmian

ę

typu kojarzeniowego przy ka

ż

dym podziale mejotycznym komórki. Naturalnie wyst

ę

puj

ą

ce

szczepy dro

ż

d

ż

y s

ą

diploidalne i maj

ą

funkcjonalny allel genu HO, powoduj

ą

cy spontaniczn

ą

zmian

ę

typu kojarzeniowego co ka

ż

dy podział mitotyczny. Szczepy laboratoryjne maj

ą

zmutowany/wydeletowany gen ho i dzi

ę

ki temu mog

ą

by

ć

utrzymywane jako szczepy o

niezmiennym typie kojarzeniowym. Komórka o stabilnym typie kojarzeniowym dziel

ą

c si

ę

mitotycznie produkuje komórki potomne o takich samych typie kojarzeniowym. Istnienie stabilnej

fazy haploidalnej jest wyj

ą

tkowo atrakcyjne dla genetyków ze wzgl

ę

du na mo

ż

liwo

ść

izolacji i

identyfikacji szczepów nios

ą

cych recesywne mutacje. Istnienie stabilnego diploida jest równie

ż

bardzo korzystne dla genetyków. Pozwala na okre

ś

lenie recesywno

ś

ci lub dominacji nowej mutacji

lub na przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy nios

ą

ce po jednej mutacji nios

ą

allele

tego samego genu czy s

ą

to mutacje w ró

ż

nych genach). Gdy dro

ż

d

ż

e s

ą

wystawione na stres

np. niekorzystne warunki pokarmowych, komórki diploidalne przechodz

ą

mejoz

ę

produkuj

ą

c

cztery komórki potomne, zwane askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu

kojarzeniowego

α

-Askospory tworz

ą

tetrad

ę

, która jest zawarta w pojedynczej strukturze

3

zwanej ascus (worek). Gdy przywróci si

ę

odpowiednie warunki pokarmowe, ka

ż

da z tych czterech

askospor wykiełkuje i zacznie si

ę

rozmna

ż

a

ć

jako haploid.

R

ys.1.Schemat cyklu

ż

yciowego

Sacharomyces cerevisiae.(za F. Sherman)

PYTANIA

1. Podaj przynajmniej dwa powody dla których dro

ż

d

ż

e s

ą

dobrym organizmem a) do

pracy w laboratorium, b) dla genetyków

2. Jakie typy kojarzeniowe maj

ą

haploidalne askospory pochodz

ą

ce z jednej tetrady?

III.

Nomenklatura genetyczna

Akceptowane nazewnictwo chromosomalnych genów dro

ż

d

ż

y S. cerevisiae przedstawia

tabela 1. stosuj

ą

c ARG2 jako przykład. Nazwy genów, alleli lub loci pisane s

ą

kursyw

ą

.

symbol

definicja

MATa

Typ kojarzeniowy a

MATa

Typ kojarzeniowy alfa

∆

HO

delecja (usuni

ę

cie genu HO) koduj

ą

cego endonukleaz

ę

i

umo

ż

liwiaj

ą

cego zamian

ę

genów

ARG

+

Wszystkie allele typu dzikiego kontroluj

ą

ce syntez

ę

argininy

ARG2

locus lub dominuj

ą

cy allel w szalku syntezy argininy

arg2

locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy haploidalny

arg2/arg2

locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy diploidalny

arg2-

∆

1

specyficzne całkowite lub cz

ęś

ciowe usuni

ę

cie arg2

ARG2 :: LEU2

Wprowadzenie funkcjonalnego genu LEU2 w locus ARG2. Gen ARG2

pozostaje działaj

ą

cy i dominuj

ą

cy

PYTANIA

1. Co według ciebie oznacza zapis genotypu:

BY: Mata; ADE, his, LEU3, lys2

2. Jak zapisałby

ś

genotyp szczepu diploidalnego, prototrofa adeniny a auksotrofa

uracylu?

4

IV. Rekombinacja genetyczna i mapowanie mejotyczne (analiza tetrad)

Skutki rekombinacji genetycznej mo

ż

na zaobserwowa

ć

gdy w

ś

ród genotypów potomstwa znajd

ą

si

ę

genotypy inne ni

ż

rodziców. Prostym przykładem rekombinacji jest krzy

ż

ówka:

F1:

AA BB (czyli AB/AB) x aa bb (ab/ab)

Gamety1:

AB

ab

Zygota

AaBb

Gamety 2: typ rodzicielski:

rekombinanty:

ab

Ab

AB

aB

Pełna niezale

ż

no

ść

dwóch loci jest zapewniona, gdy umieszczone s

ą

one na osobnych

chromosomach, s

ą

to loci „w pełni nie sprz

ęż

one”. Im dalej od siebie geny le

żą

na chromosomach

tym cz

ęś

ciej zachodzi mi

ę

dzy nimi rekombinacja.

Jednostk

ą

odległo

ś

ci mapy genetycznej jest centymorgan (cM) liczony wg wzoru poni

ż

ej:

liczba rekombinantów
------------------------------------- x 100 = liczba cM
całkowita liczba potomstwa

1 cM to 1% rekombinacji (rekombinantów w

ś

ród potomstwa)

50 cM oznacza 50% rekombinacji; zachodzi gdy 2 geny le

żą

odpowiednio daleko na jednym

chromosomie lub na dwóch chromosomach.

Mapowanie oparte o analiz

ę

produktów mejozy jest tradycyjn

ą

metod

ą

genetyki klasycznej

okre

ś

lenia kolejno

ś

ci i odległo

ś

ci genów. Dro

ż

d

ż

e szczególnie dobrze nadaj

ą

si

ę

do zastosowania

tej metody poniewa

ż

cztery haploidalne spory w ascus/worku s

ą

produktami jednego wydarzenie

mejotycznego. Genetyczna analiza takich tetrad pozwala na ustalanie wzajemnego poło

ż

enia

genów obecnych w stanie heterozygotycznym diploidzie. Mo

ż

liwe jest równie

ż

mapowanie

poło

ż

enia genu w stosunku do jego centromeru. W tym przypadku nale

ż

y u

ż

y

ć

krzy

ż

ówki

organizmów zawieraj

ą

cych gen sprz

ęż

ony z centromerem oraz drugi le

żą

cy w znanej odległo

ś

ci od

niego.

Izolacja czterech spor z ascus jest jednym z trudniejszych technik genetyki dro

ż

d

ż

y, wymagaj

ą

cych

pracy na mikromanipulatorze i du

ż

ej praktyki. Analiza tetrad jest rutynowo wykonywana w

wi

ę

kszo

ś

ci laboratoriów pracuj

ą

cych z dro

ż

d

ż

ami. Obecnie stosuje si

ę

te technik

ę

nie do

mapowania genetycznego, lecz raczej do okre

ś

lania tempa mutacji odpowiadaj

ą

cych za zmiany w

pojedynczym locus, do „tworzenia” nowych szczepów i do badania interakcji genów.

Dla szczepu hybrydowego (AB x ab) który jest heterozygotyczny pod wzgl

ę

dem markerów istniej

ą

3 typy tetrad: PD (rodziców/parental ditype), NPD (bez rodziców/ nonparental ditype) i T (typ_tetra)

5

jak pokazano na rysunku poni

ż

ej. Na podstawie wzajemnego stosunku ilo

ś

ciowego tych tetrad

mo

ż

na wnioskowa

ć

o sprz

ęż

eniach genowych i centromerowych

:

•

Je

ś

li dwa geny s

ą

sprz

ęż

one to istnieje nadmiar tetrad typu PD w stosunku do NPD.

•

Je

ś

li dwa geny znajduj

ą

si

ę

na ró

ż

nych chromosomach, i s

ą

sprz

ęż

one ze swoimi centromerami

wyst

ę

puje mniejsza proporcja tetrad typu T.

•

Je

ś

li oba geny le

żą

na ró

ż

nych chromosomach, ale przynajmniej jeden z nich nie jest sprz

ęż

ony

ze swoim centromerem, lub geny le

żą

na jednym chromosomie ale sa daleko od siebie (odległo

ść

wi

ę

ksza ni

ż

50cM) to wyst

ę

puj

ą

losowe proporcje rodzajów tetrad tj. PD: NPD: T wynosi 1: 1: 4.

Rys.2. Ró

ż

ne rodzaje tetrad pochodz

ą

cych z krzy

ż

owania szczepów AB x ab.

Cz

ę

sto

ść

wyst

ę

powania tetrad typu: PD, NPD, i T mog

ą

by

ć

stosowane do okre

ś

lenia odległo

ś

ci na

mapie w cM (centimorgany) mi

ę

dzy dwoma genami, wyliczanej wg. poni

ż

szego wzoru:

PYTANIA

3. Rozrysuj podane krzy

ż

owanie podstawiaj

ą

c jaki

ś

marker troficzny (np. ade –

mo

ż

liwo

ś

c syntezy adeniny, leu – mo

ż

liwo

ść

syntezy leucyny)

4. Jaki genotyp b

ę

d

ą

miały tetrady ka

ż

dego z wymienionych typów?

Literatura

1. Schlegel Hans G. „Mikrobiologia ogólna”. 1996. Wydawnictwo Naukowe PWN
2. Sherman F. An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae.

1998. Department of Biochemistry and Biophysics. University of Rochester Medical School, Rochester, NY
14642. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/Index.html

3. Sherman F., Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002).

http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/startedyeast.pdf

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Opracowała: dr Dominika Włoch-Salamon

6

Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2012

Ć

wiczenia praktyczne

Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałe

ś

. Jednorazowe

zu

ż

yte materiały wyrzu

ć

, a materiały wielokrotnego u

ż

ytku umyj.

Zadanie nr 1: Oznaczanie genotypu dro

ż

d

ż

y (wegetatywnych haploidów)

na podło

ż

ach selekcyjnych

Podło

ż

a, na których b

ę

d

ą

przeprowadzane testy to podło

ż

a syntetyczne (Sc-), czyli w pełni

zdefiniowane o dokładnie poznanym składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika

wzrostowego, w tym wypadku s

ą

to poszczególne aminokwasy. Na takim podło

ż

u mog

ą

rosn

ąć

tylko te dro

ż

d

ż

e, które maj

ą

sprawny szlak syntezy danego aminokwasu. Gdy szlak ten jest

uszkodzony na jakim

ś

etapie, dro

ż

d

ż

e na takim podło

ż

u nie rosn

ą

i nazywane s

ą

aksotrofami tego

poszczególnego nutrientu, np. szczep nie rosn

ą

cy na podło

ż

u SC-ura to auksotrof uracylu.

Materiały:

- szalki z wyro

ś

ni

ę

tymi koloniami dro

ż

d

ż

y o nieznanym genotypie na podło

ż

u pełnym bulionowym

YPD
- szalki z wykonanymi replikami (odbijaniem) na podło

ż

ach selekcyjnych

Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych okre

ś

l genotypy

poszczególnych szczepów dro

ż

d

ż

y.

Zadanie nr 2: Oznaczanie genotypu askospor na podło

ż

ach selekcyjnych

U

ż

ywaj

ą

c mikromanipulatora mo

ż

na rozdzieli

ć

askospory pochodz

ą

ce z jednej tetrady. Uzyskuje si

ę

w ten sposób haploidy b

ę

d

ą

ce produktem mejozy jednej komórki diploidalnej. Podczas tworzenia

spor wi

ę

kszo

ść

genów segreguje do komórek potomnych wg. praw genetyki mendlowskiej.

Heterozygotyczny marker (np. HIS/his) b

ę

dzie segregował zgodnie z wzorcem 2:2.(dwia szczepy

potomne s

ą

his a dwa HIS). W ten sposób mo

ż

na otrzyma

ć

szczepy o nowej kombinacji cech.

Do

ś

wiadczenie ma na celu okre

ś

lenie genotypów askospor powstałych w wyniku sporulacji

diploidalnego szczepu dro

ż

d

ż

y, hetoryzygotycznego w ka

ż

dym locus markerów troficznych oraz

okre

ś

lenie, czy askospory rzeczywi

ś

cie pochodz

ą

z jednej tetrady.

Materiały:

- szalka z wyro

ś

ni

ę

tymi koloniami powstałymi w wyniku rozło

ż

enia za pomoc

ą

mikromanipulatora

nadtrawionych tetrad na pełnym podło

ż

u YPD

- szalki z wykonanymi replikami na podło

ż

ach SC-lys, SC-ade, YPD+nat

Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych okre

ś

l genotypy

poszczególnych kolonii wyrosłych z pojedynczych askospor i okre

ś

l na tej podstawie czy dana

tetrada jest tetrad

ą

prawdziw

ą

czy fałszyw

ą

.

7

Zadanie nr 3: Mapa genetyczna (analiza sprz

ęż

e

ń

genowych)

Skrzy

ż

owano dwa szczepy:

Nr 1: haploid Y55

MAT a

his4 leu2 lys2

ade1 ura3

nr. 2: haploid Y55

MAT

α

,

HIS4 LEU2 LYS2 ADE1 URA3

Otrzymany szczep diploidalny poddano sporulacji. Tetrady spor rozdzielono za pomoc

ą

mikromanipulatora. Otrzymano 4 kolonie haploidalne o ró

ż

nych genotypach (patrz zadanie 5.)

Celem zadanie jest analiza sprz

ęż

e

ń

2 par genów: leu i his; i ura i lys.

W ka

ż

dym przypadku oce

ń

ile jest okre

ś

lonych typów tetrad (rodzicielski, nie rodzicielskie, typ-tetra)

w twoim zestawie szalek eksperymentalnych.

Po zebraniu danych ze wszystkich zestawów (praca całej grupy) mo

ż

na zastosowa

ć

wzór

(podany we wst

ę

pie) i oszacowa

ć

odległo

ść

mi

ę

dzy genami w cM a tym samym czy geny s

ą

sprz

ęż

one.

8

MIKROBIOLOGIA _2012 SPRAWOZDANIE

Imi

ę

i nazwisko _______________________________________

Data /Numer grupy _______________________________________

Zad.1. Oznaczanie genotypu dro

ż

d

ż

y wegetatywnych na podło

ż

ach selekcyjnych

Nr Zestawu …..

Podaj genotypy

ADE

HIS

LYS

LEU

URA

szczep nr 1:

szczep nr 2:

szczep nr 3:

szczep nr 4:

szczep nr 5:

Zad.5. Oznaczanie genotypu askospor na podło

ż

ach selekcyjnych.

Nr Zestawu …..

Podaj genotypy, napisz czy a) tetrada była prawdziwa czy fałszywa i b) dlaczego?

tetrada nr 1

tetrada nr 2

1.

1.

2.

2.

3.

3.

4.

4.

prawdziwa/fałszywa

prawdziwa/fałszywa

tetrada nr 3

tetrada nr 4

1.

1.

2.

2.

3.

3.

4.

4.

prawdziwa/fałszywa

prawdziwa/fałszywa

tetrada nr 5

tetrada nr 6

1.

1.

2.

2.

3.

3.

4.

4.

prawdziwa/fałszywa

prawdziwa/fałszywa

Tetrada jest „fałszywa” jeśli……………………………………………………………

9

Zad.3. Mapa genetyczna (analiza sprz

ęż

e

ń

genowych) (dla studentów biologii)

Nr Zestawu …..Podaj rodzaj tetrady (PT, NPT, T,) dla wszystkich prawdziwych tetrad w twoim zestawie

pod wzgl

ę

dem 2 par genów: LEU i HIS oraz URA/LYS.

Ilo

ś

ci odpowiednich rodzajów tetrad zostan

ą

wypisane w zbiorczej tabeli (na tablicy)

Oce

ń

odległo

ść

par genów w cM, oce

ń

czy s

ą

sprz

ęż

one (uzasadnij wniosek).

tetrada nr 1

tetrada nr 2

tetrada nr 3 tetrada nr 4

tetrada nr 5

tetrada nr 6

1. leu i his

2. ura i lys.