2011-03-24

1

Praktyczna Nauka Zawodu

Biochemia

Metody

Kinetyczne

2010/2011

Rok III semestr letni

Mgr Sylwia Płaczkowska, Mgr Izabela Kokot

ZPNZA AM Wrocław

Rodzaj metody pomiarowej

•

Sygnał uzyskany w reakcji pomiarowej może być mierzony
dwoma sposobami:

•

- w metodach punktu końcowego tzw.: end-point mierzony
jest poziom sygnału pomiarowego wytwarzanego przez
produkt reakcji wskaźnikowej, który jest proporcjonalna do
ilości badanego związku.

•

- w metodach typu „test spektrofotometryczny, kinetyczny”
mierzona jest zmiana sygnału pomiarowego w czasie, a
różnica poziomu sygnału pomiędzy punktami pomiarowymi
jest proporcjonalna do stężenia lub aktywności badanego
związku.

Źródło: Podstawy diagnostyki laboratoryjnej. Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich

Wrocław 2010r.

Rodzaj metody pomiarowej

Rodzaj metody pomiarowej

Zasada metod kinetycznych

•

W metodach kinetycznych śledzimy zmianę
absorbancji w czasie pomiaru, która
odzwierciedla ubytek lub przyrost substratu lub
produktu w czasie przebiegu reakcji.

•

Z różnicy absorbancji na początku i końcu reakcji

wyznaczamy stężenie badanego związku,

•

Na podstawie zmiany absorbancji na minutę
pomiaru wyznaczamy szybkość reakcji i pośrednio
aktywność oznaczanych enzymów.

Zasada metod kinetycznych

ODCZYNNIK

SUROWICA

WIELOKROTNY POMIAR

SYGNŁU

O

Ś

CZASU

INKUBACJA

FAZA

WST

Ę

PNA

FAZA ODCZYTU SYGNAŁU

2011-03-24

2

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0

20

40

60

80

100

120

czas pomiaru

a

b

s

o

rb

a

n

c

ja

Przebieg testu kinetycznego

Zasada metod kinetycznych

Przy maksymalnym wysyceniu enzymu
substratem w określonej jednostce czasu
przybywa tyle samo produktu. W efekcie daje
to przyrost absorbancji o stałą wartość w
określonej jednostce czasu.

Rodzaj krzywej kalibracyjnej

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0

10

20

30

40

50

60

70

Test kinetyczny/fix-time

Δ

A

(

a

b

so

rb

a

n

cj

i)

/m

in

.

Aktywność/Stężenie

Obliczanie faktora

- na podstawie krzywej wzorcowej,

która dla metod kinetycznych jest zależnością
szybkości reakcji (ΔA/min.) od aktywności
badanego enzymu.

W metodach rutynowych oznaczania aktywności
enzymów jest ona praktycznie nie stosowana ze
względu na nietrwałość i wysoki koszt wzorców.

Obliczanie faktora

- na podstawie molowego współczynnika absorpcji

dla produktu lub substratu reakcji wskaźnikowej

MOLOWY WSPÓŁCZYNNIK ABSORPCJI ε

to absorbancja roztworu zawierającego 1
mol/l barwnego związku zmierzona w
kuwecie o grubości 1 cm.

Molowy współczynnik absorbcji

W praktyce molowy współczynnik absorpcji
wyznacza się dla roztworów rozcieńczonych o
stężeniu rzędu mili- lub mikromoli na litr,

ponieważ pomiar absorbancji dla roztworu o
stężeniu rzędu moli na litr jest technicznie
niemożliwy.

2011-03-24

3

Obliczanie faktora

F =

Gdzie:

F - faktor

V

K

- objętość końcowa w ml

V

P

– objętość początkowa w ml

ε – współczynnik molowy dla mierzonego barwnego produktu
1000 – współczynnik dla przeliczenia objętości z ml na litry

1

1000

⋅

⋅

⋅

P

K

V

V

ε

Jednostka aktywności enzymów

Konieczność podawania zmiany absorbancji na
minutę, nawet

jeśli

pomiary absorbancji

prowadzone są

w

czasie dłuższym

oraz

wyliczenie

faktora,

który

odnosi

się

do

objętości litra badanego materiału wynika z
definicji

międzynarodowej

jednostki

aktywności IU.

Metodyka Fix-Time

(metody substratowe)

•

Metodyka tych pomiarów jest identyczna jak
dla metod kinetycznych, wartością oznaczaną
nie jest jednak szybkość reakcji, lecz zmiana
absorbancji.

•

Pomiary absorbancji wykonywane są
dwukrotnie; pierwszy raz na początku i drugi
raz na końcu read time

Metodyka Fix-Time

(metody substratowe)

Etapy testu kinetycznego

•

Każdy test kinetyczny składa się z dwóch faz:

•

- faza wstępna (

lag time

), w czasie której reakcja

pomiarowa osiąga V max; jest to czas od chwili
dodania do odczynników materiału badanego, aż
do momentu rozpoczęcia pomiarów

•

- faza pomiarowa (

read time

), w której w

określonych odstępach czasowych dokonywane
są pomiary absorbancji, na podstawie których
obliczana jest szybkość reakcji.

0

5

10

15

20

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

długo

ś ć

fali

a

b

s

o

rb

a

n

c

ja

NAD

NADH+H

TEST OPTYCZNY WARBURGA

2011-03-24

4

TEST OPTYCZNY WARBURGA