Immunologia – prelekcja 8

Immunologia

– prelekcja 8.10.2007

Podział odporności:

ODPORNOŚĆ

Humoralna

Komórkowa

Swoista

Wrodzona

Swoista

Wrodzona

Limfocyty B
Przeciwciała

CRP

Lizozym

etc.

Limfocyty T

APC

Fagocytoza

Kom. NK

Budowa immunoglobulin

IgA, IgG, IgD posiadają trzy regiony C

i region zawiasowy (ang. „hinge region”), natomiast IgM i IgE – cztery regiony C

IgM, IgA, IgD posiadają w łańcuchu ciężkim strukturę „ogonka”.
Fragment Fab służy wiązaniu antygenu, natomiast Fc pełni funkcje efektorowe i transportowe.
Obraz domeny to pętla złożona z ok. 110 aminkowasów.
IgA w wydzielinach przeważa jako forma dimeryczna, w surowicy natomiast jako forma monomeryczna.

Właściwości immunoglobulin

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

Masa cz. x10

150

160

970 (5 x 194)

185

190

Liczba cz. cztero
łańcuchowych

1,2

Łańcuch ciężki

Łańcuch lekki

κ lub λ

Wartościowość
dla antygenu

2,4

5-10

Stężenie w

8-16 mg/ml

1-4,4 mg.ml

0,5-2 mg/ml

0-0,04 mg/ml

5*10^-9

surowicy

mg/ml

% Ig surowicy

0-1

0,002

Wiązanie
dopełniacza

+++

Przechodzenie
przez łożysko

Wiązanie z kom.
tucznymi i
neutrofilami

Wiązanie z
monocytami i
makrofagami

Czas półtrwania
(dni)

5,5

2,8

Występowanie
w mleku

0-ślad

Właściwości podklas IgG

IgG1

IgG2

IgG3

IgG4

% całkowitego
IgG

43-75

16-48

1,7-7,5

0,8-11,7

Przechodzenie
przez łożysko

Ag białkowe

+/-

Ag
polisacahrydowe

(-)

Alergeny

(-)

Akt dopełniacza

+++

(-)

Łączenie się IgG z docelowymi komórkami



Fcγ RI (CD64): monocyty, makrofagi, neutrofile, kom. dendrytyczne



Fcγ RII (CD32): monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, trombocyty, limf. B, kom. dendrytyczne, kom.
endotelialne



Fcγ RIII (CD16): neutrofile, eozynofile, makrofagi, komórki NK, limf. T

Markery antygenowe immunoglobulin

Izotypy – występowanie Ig z uwględnieniem zróżnicowania w budowie łańcuchów ciężkich i lekkich, umożliwiające podział na
klasy i typy.

Allotypy – występowanie różnic w obrębie części stałych łańcuchów ciężkich i lekkich (głównie ciężkich) różnych aminokwasów
w określonych pozycjach łańcucha peptydowego.

Idiotypy – występowanie różnic w obrębie części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich.

Przeciwciała monoklonalne – są to przeciwciała o tym samym izo-, allo- oraz idiotypie, produkowane przez ten sam klon
limfocytów B i plazmocytów. Możemy dzięki nim otrzymywać w dużych ilościach przeciwciała o dużej swoistości. W tym celu
immunizujemy zwierzę, np. mysz danym antygenem, po czym łączymy jej limfocyty B z komórką szpiczaka (nowotworu
pochodzącego z szeregu rozwojowego limfocytów B), w której brak HGRPTazy. Zachodzi fuzja tych dwóch komórek, wskutek
czego otrzymujemy hybrydy – komórki hybridoma. Następnie oczyszczamy hybrydę z komórek szpiczaka stosując medium HAS
(hipoksantyna-aminopterydyna-tymidyna) przez co zabijamy komórki nowotworowe – hybrydy mają HGPRTazę dzięki czemu
przeżywają. Następnie przeprowadzamy testy swoistości wobec antygenu przeciwko któremu dane próbki komórek hybridoma
produkują przeciwciała. Po uzyskaniu odpowiednio swoistego klonu możemy go namnażać in vitro bądź in vivo. Limfocyt B
określa swoistość hybrydy, natomiast szpiczak jako „motor napędowy” nadaje jej „nieśmiertelność” i dostarcza rybosomów i
aparatu Golgiego niezbędnego do syntezy białek.

Zastosowanie przeciwciał monokolonalnych:



diagnostyka mikrobiologiczna chorób zakaźnych



oznaczanie stężeń białek i leków w płynach ustrojowych



typowanie tkanek i krwi



diagnostyka nowotworów, białaczek, chłoniaków, chorób autoimmunologicznych



ocena układu odpornościowego



oznaczanie stężenia hormonów



terapia – uwaga na HAMA – human anti-mouse antibodies, p/ciała wytwarzane przez nasz organizm przeciwko białkom
pochodzącym bądź co bądź z mysich komórek

Preparaty immunoglobulinowe:



ludzkie



obcogatunkowe



chimerowe – 33% mysie (od strony Fab) + 67% ludzkie



humanizowane, 5-10% mysie (od strony Fab), reszta ludzka

Stosowane preparaty immunoglobulinowe:



Ig ludzkie nieswoiste – od osób nieimmunizowanych (zlewanie surowicy od minimum 1000 dawców i pobieranie z niej
przeciwciał) – leczenie pierwotnych i wtórnych niedoborów odpornościowych typu humoralnego, zakażeń bakteryjnych i
wirusowych zagrażających życiu, profilaktyka WZW typu A i odry.



Ig ludzkie swoiste (o wysokiej zawartości przeciwciał) – przeciw HBV (antygen HBSPa), VZV (odra, półpasiec),
wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu, wirusowi wścieklizny, CMV (cytomegalia), toksynie tężcowej, Ig anty Rh

Mogą to być Ig chimerowe lub humanizowane. Przykłady:

Immunoglobulina

Skład

Wskazania

anty TNF-alfa

chimerowe

terapia RZS, choroby Crohna,
colitis ulcerosa

anty HER 2

humanizowane

terapia raka piersi z przerzutami

przeciwko receptorowi
aktywnych płytek krwi (GP
IIb/IIIa)

chimerowe

terapia i profilaktyka ostrych
stanów niedokrwiennych serca

przeciwko receptorowi CD20

humanizowane

leczenie chłoniaków
pochodzących z limfocytów B

anty CD 52

humanizowane

przewlekła białaczka
limfocytarna

anty IgE

humanizowane

nadwrażliwość typu I

przeciwko receptorowi CD25
(IL-2R)

humanizowane

profilaktyka ostrego odrzucenia
przeszczepu

anty CTLA4

humanizowane

terapia RZS, melanoma

CTL4 – powstaje podczas aktywacji limfocytów T. Po zadziałaniu na CTL4 klon limfocytów T ulega delecji.

Odczyn precypitacji

Jest to odczyn w którym antygen jest w postaci rozpuszczonej, w przeciwieństwie do aglutynacji gdzie jest upostaciowiony.
Charakteryzuje go mniejsza czułość niż aglutynację. Wymaga udziału wielowartościowego antygenu i co najmniej
dwuwartościowego przeciwciała tak jak w aglutynacji. Musi być także zachowany odpowiedni stosunek antygen:p/ciało,
ponieważ reakcja najlepiej zachodzi w strefie ekwiwalencji ilościowej ich stężeń. W strefie nadmiaru antygenu bądź przeciwciała
tworzą się rozpuszczalne kompleksy immunologiczne.

Podział precypitacji:



W środowisku płynnym – USR, VDRL stosowane w screeningu kiły (nie musi być swoisty, ale czuły, bowiem dodatni
wynik zawsze weryfikujemy).



W środowisku półpłynnym

Immunodyfuzja podwójna

o Immunodyfuzja pojedyncza
o Immunoelektroforeza



Western-blot



Nefelometria



Turbidymetria

Percypitacja w środowisku płynnym

Metody te są głównie jakościowe. Zalicza się do nich np. wykrywanie antygenów Baccillus antracis w skórach i innych tkankach
zwierzęcych – tzw. odczyn Ascoliego. Antygen jest ekstrahowany z tkanki, po czym przeprowadza się reakcję surowicy
odpornościowej z roztworem zawierającym antygen. Powstanie pierścienia precypitacyjnego oznacza wynik dodatni.

Odczyny nieswoiste – USR, VDRL – stosujemy w screeningowej serodiagnostyce kiły. Poszukiwanym antygenem są reaginy
kiłowe. Są to tzw. odczyny kłaczkujące. Ponieważ jest to metoda screeningowa, aby potwierdzić wynik pozytywny musimy w
następnej kolejności przeprowadzić swoisty test TPHA.

Immunodyfuzja podwójna (metoda Otcherlonyego)

Jest to metoda pozwalająca określić stopień pokrewieństwa antygenów

W przypadku gdy oba antygeny (oznaczone A) są identyczne linia precypitacyjna ma kształt łuku, gdy są częściowo identyczne –
łuku z ostrogą, gdy są różne – są to dwie przecinające się proste linie.
Do metod immunodyfuzji podwójnej zalicza się także test Elecka, służący badaniu toksyczności maczugowca błonicy - nie
wszystkie szczepy tej bakterii są toksyczne. Przeciwciało przeciwko toksynie maczugowca umieszczamy na bibułce filtracyjnej, a
prostopadle do niego nanosimy bakterie. Tworzenie „wąsów precypitacyjnych” oznacza że dany szczep jest toksyczny.

Immunodyfuzja pojedyncza (immunodyfuzja radialna, metoda Mancini)

Metoda ta znalazła zastosowanie w ilościowym oznaczaniu stężenia immunoglobulin w surowicy, a także składników dopełniacza
(C3, C4) oraz niektórych białek ostrej fazy (transferyna, laktoferyna).
Polega ona na umieszczeniu w specjalnym krążku przeciwciała – w otworach w żelu agarozowym oraz poszukiwanego antygenu
– w centrum krążka w baseniku. Antygen dyfunduje radialnie w żelu zawierającym przeciwciało, a gdy wyczerpie się jego zapas
powstaje w tym miejscu pierścień precypitacyjny, którego szerokość oceniamy porównując średnicę otrzymanego pierścienia z
pierścieniami wzorcowymi (wykonujemy równolegle 3-4 standardy) otrzymanymi przez użycie wzorcowego antygenu:

Wadą tej metody jest dość długi czas reakcji (24-48 h) oraz spory błąd pomiarowy (10- 15%) – sami wykonujemy wzorce
kalibracyjne.

Immunoelektroforeza

Jest to metoda jakościowa i półilościowa, oceniamy łuki precypitacyjne, prowadzimy ją na szkiełku pokrytym żelem. Po wycięciu
otworów dla surowic (badanej i kontrolnej) najpierw zachodzi elektroforeza białek, a po niej wycinamy rowki do których
dodajemy p/ciała – zachodzi immunoprecypitacja. Po wybarwieniu interpretujemy wynik.
Immunoelektroforeza wg Grabara jest metodą półilościową, pozwalającą na diagnozę hiper-, nipo- bądź agammaglobulinemii.
Stosujemy tu surowicę badaną i kontrolną wg. powyższego opisu. Aby zdiagnozować w/w gammapatie porónujemy obraz
prawidłowej surowicy kontrolnej oraz surowicy pacjenta.
Immunoelektroforeza służy także diagnozowaniu szpiczaka mnogiego, gdzie za pomocą swoistych przeciwciał wykrywamy i
identyfikujemy białko monoklonalne, używając jako odniesienia odpowiedniego wzorca.
Elektroforeza przeciwprądowa – można ją przeprowadzić gdy antygen i przeciwciało mają przeciwne ładunki, sprawiamy że
migrując do przeciwnych elektrod jednocześnie migrują one „do siebie” w trakcie elektroforezy. Jest to rzadko stosowana metoda
używana głównie w celach naukowych.

Western-blot

Metoda ta służy do wykrywania antygenu i przeciwciała, częściej przeciwciała, głównie w diagnostyce zakażeń wirusem HIV –
screeningowo wykonujemy test metodą ELISA obarczony sporym błędem pomiarowym (wyniki fałszywie dodatnie), Western-
blot służy potwierdzeniu wyniku. Często używa się sonifikowanego (rozbitego ultradźwiękami) wirusa, któego fragmenty służą

jako wzorcowe antygeny „wyłapujące” przeciwciała w surowicy krwi. Powstałe kompleksy immunologiczne wykrywamy
surowicą antyglobulinową sprzężoną z enzymem – oznaczamy stężenie produktu reakcji enzymatycznej.
Techniką tą możemy także wykrywać antygen, co zostało wykorzystane w diagnostyce zakażenia prionami w BSE. Zasada
metody polega na denaturacji białek proteazami, na które wrażliwy jest nawet obecny fizjologicznie w komórkach prion.
Trawieniu nie podlegają jedynie priony chorobotwórcze, które następnie wykrywane są za pomocą swoistych przeciwciał.
Zastosowanie także w diagnostyce boreliozy, serodiagnostyce HCV które często przebiega bezobjawowo dając powikłania w
postaci raka lub marskości wątroby, a także zakażenia Helicobacter pylori, jedynego bakteryjnego karcynogenu klasy I –
rozłożone elektroforetycznie antygeny H. pylori (w tym CAK-2) wiążą się ze swoistymi przeciwciałami.

Nefelometria

Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze natężenia światła rozproszonego w roztworze zawierającym
kompleksy immunologiczne. Zaletą metody jest łatwość i krótki czas wykonania. Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie
immunoglobulin (G, A, M), składowych dopełniacza (C3, C4), białek ostrej fazy (alfa1-IP, ceruloplazmina, CRP), albuminy.

Turbidymetria

Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze spadku natężenia światła po przejściu przez zawiesinę
zawierającą kompleksy immunologiczne. Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie immunoglobulin, składowych dopełniacza,
białek ostrej fazy.

Class switching

Jest to zjawisko zachodzące w limfocytach B podczas odpowiedzi zależnej od limfocytów T. Limfocyt B dziewiczy posiada jako
receptory IgM oraz IgA. Część zmienna łańcucha ciężkiego każdej z immunoglobulin kodowana jest przez geny VDJ, natomiast
część stała zostaje do niej dołączona później – w każdej immunoglobulinie część stałą koduje inny zestaw genów; są one ułożone
kolejno po sobie, tak że na początku zawsze syntetyzowana jest IgM, a potem kolejno: ... W obrębie genów VDJ w limfocytach
B zachodzą mutacje somatyczne co wzmaga swoistość receptorów czyli IgM wobec antygenu. Zachodzą one jednak losowo,
przez co organizm wypracował sobie pewien system selekcji najbardziej swoistych limfocytów B. Kolejne populacje tych
komórek łączą się z antygenem na wypustkach dendrytycznych komórki prezentującej antygeny – przeżywają tylko te które
najsilniej się z nią zwiążą. Class switching jest regulowany przez limfocyty T w zakresie rodzaju produkowanego przeciwciała, a
każda kolejna z w/w klas ma większe powinowactwo do antygenu niż poprzednia.