1

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok I stopnia

Biochemia

OTRZYMYWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH

(ekstrakcja DNA z włosa ludzkiego)

Wstęp

Kwasy nukleinowe od wielu lat są obiektem badań biochemicznych. DNA buduje większość genomów

(w tym wszystkie genomy komórkowych form życia), natomiast niektóre wirusy mają genomy zbudowane z

RNA. Pojęciem genomu określa się informację biologiczną potrzebną do powstania organizmu żywego i

utrzymaniu go przy życiu. Informacja biologiczna zawarta w genomie jest zakodowana w sekwencji

nukleotydowej jego cząsteczek DNA lub RNA i dzieli się na odrębne jednostki określone mianem genów.

Informacja zawarta w genie jest odczytywana przez rozmaite białka, które łączą się w odpowiednich miejscach z

genomem, rozpoczynając w ten sposób szereg reakcji biochemicznych, składających się na ekspresję genu,

powodując tym samym do określone skutki metaboliczne. Z tego faktu wynika rosnące niezmiennie od wielu lat

zainteresowanie biochemików złożonymi zagadnieniami genomiki.

Genom człowieka tworzą dwie odrębne części: genom jądrowy podzielony na 24 różne liniowe

cząsteczki DNA, z których najkrótsza ma 55 Mbp (megabase pairs- milion par zasad), a najdłuższa 250 Mbp i

każda zawiera się w osobnym chromosomie; oraz genom mitochondrialny, kolista cząsteczka DNA o długości

16 569 bp (base pairs - pary zasad), która w wielu kopiach znajduje się w organellach wytwarzających energię -

mitochondriach.

Podwójna helisa DNA jest stabilna chemicznie, ale wrażliwa na czynniki fizyczne. Długa, wijąca się nić

DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest podatna na działanie nawet słabych sił hydrodynamicznych. W

roztworach wodnych podwójna helisa DNA zwija się w kłębek, który jest usztywniony przez interakcje

pomiędzy parami zasad oraz oddziaływaniami elektrostatycznymi spolaryzowanych grup fosforanowych w

wiązaniach bocznych DNA. Przepływ hydrodynamiczny, będący efektem pipetowania, wytrząsania lub

mieszania może powodować rozrywanie nici DNA. Im dłuższy łańcuch DNA tym słabsze siły powodują jego

rozerwanie. Dlatego też genomowy DNA łatwo można otrzymać w pofragmentowanej formie ale trudno

uzyskać DNA o żądanej długości. Molekuły DNA o wielkości przekraczającej 150 kbp łatwo ulegają rozpadowi

pod działaniem siłgenerowanych podczas procedur ekstrakcyjnych zwykle stosowanych celem oczyszczenia

genomowego DNA.

Celem ćwiczenia jest uzyskanie DNA z włosa ludzkiego metodą stosowaną w medycynie sądowej.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Umieścić włos w jałowej probówce typu Eppendorf

2. Dodać:



300 µl 2% SDS w buforze ekstrakcyjnym

2



12 µl 1M DTT w buforze ekstrakcyjnym



15 µl proteinazy K (20 mg/ml)

3. Dokładnie wymieszać;

4. Inkubować w 56 °C przez 24 godziny;

5. Dodać równą objętość fenolu i wytrząsać 5 minut;

6. Odwirować 10 minut, 8000 rpm (wirówka Minispin);

7. Odciągnąć warstwę wodną do nowej probówki Eppendorfa i powtórzyć ekstrakcję z fenolem (p. 5 i 6);

8. Odciągnąć warstwę wodną do nowej probówki Eppendorfa i dodać równą objętość mieszaniny chloroform :

alkohol izoamylowy, wytrząsać 5 minut i odwirować 10 minut, 8000 rpm;

9. Odciągnąć warstwę wodną do nowej probówki Eppendorfa, dodać 30 µl 3M octanu sodu pH 5,5 i 600 µl

zmrożonego etanolu. Dobrze wytrząsać przez 15 minut (można zostawić w -20 °C do następnych analiz);

10. Wstawić do zamrażarki na przynajmniej 24 godziny;

11. Odwirować 14000 rpm przez 30 minut;

12. Usunąć płyn znad osadu pompką wodną;

13. Wysuszyć osad i rozpuścić w 20 - 30 µl wody MilliQ;

Zaliczenie ćwiczenia:

Przedstawić otrzymany preparat DNA oraz opis ćwiczenia w zeszycie.

3

Odczynniki:



bufor ekstrakcyjny o składzie: 10mM TRIS, 10mM EDTA, 100mM NaCl (0,605g TRIS; 1,86 g EDTA;

2,92 g NaCl; H2O do 500 ml), pH 8,0; pH ustalić użyciu 50% NaOH (ok. 0,2 ml). Rozporcjować po

100 ml i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w lodówce.



2% SDS w buforze ekstrakcyjnym: 0,4 g SDS; 20 ml buforu ekstrakcyjnego. Rozpuścić w sterylnym

naczyniu. Nie jałowic. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Nadaje się do użycia przez 1 tydzień.



1M DTT w buforze ekstrakcyjnym: 0,77 g dithiothreitolu; 5 ml buforu ekstrakcyjnego. Rozpuścić w

sterylnym naczyniu, rozporcjować do probówek filtrując przez filtr 0,2 µm. Przechowywać w -20ºC.



proteinaza K (20 mg/ml): roztwór proteinazy w jałowej wodzie przechowywać w -20ºC.



fenol



chloroform : alkohol izoamylowy (24 : 1)



3M octan sodu, pH 5,5



zmrożony etanol 95%



jałowe probówki typu Eppendorf



jałowe końcówki do pipet 200µl



jałowa woda MilliQ

Piśmiennictwo:

1. Wojtuszek E., Nałęcka M., Chmiel A., 2000. Badanie polimorfizmu DNA przy użyciu techniki PCR.

Wydawnictwo Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP, Warszawa

2. Słomski R., 2004, Przykłady analiz DNA. Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. A. Cieszkowskiego,

Poznań