3.1 Budowa kwasów nukleinowych

Koduje informację związaną z sekwencją nukleotydów w RNA i aminokwasów w białkach, regulacją ich syntezy

○

Odkryty w 1869 przez Johanna Fredricha Mieschera

○

1938 r. - opracowanie metody izolacji wysokocząsteczkowego DNA

○

Funkcjonowanie dwóch błędnych teorii budowy DNA (I - Paulinga i Coreya, II - Frasera)

○

1953r. - pierwsza publikacja na łamach Nature na temat budowy DNA opracowana przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka; ich model zakładał istnienie dwuniciowego
polinukleotydu zwiniętego helikoidalnie wokół jednej osi

○

DNA (Kwas deoksyrybonukleinowy) - liniowy, nierozgałęziający się polimer zbudowany z nukleotydów

•

Jednostki budujące DNA: 4chemicznie odrębne nukleotydy; każdy składa się z:

○

I)reszty fosforanowej;
II) 2'-deoksyrybozy (pentozy);
III) zasady azotowej (pirymidynowej - cytozyny lub tyminy, albo purynowej - adeniny lub guaniny)
Obecnośd pierścieni w zasadach azotowych warunkuje płaski kształt cząsteczki

○

Połączenia między nukleotydami - wiązania fosfoestrowe między atomem węgla 5' jednej reszty cukrowej deoksyrybozy a atomem węgla 3' sąsiadującej reszty cukrow ej

○

Synteza zasad azotowych w komórce - de novo

○

Synteza nukleotydów w k-ce - de novo lub powtórne wykorzystanie zasad purynowych uwolnionych w wyniku hydrolizy kwasów nukleinowych (tzw. Szlak rezerwowy)

○

Zasada komplementarności: zasada pirymidynowa łączy się wiązaniami wodorowymi z komplementarną do niej zasadą purynową na przeciwległej nici DNA: A=T, G≡C

○

Połączenie między deoksyrybozą, a zasadą azotową - N-glikozydowe

○

W grupie fosforanowej wyróżnia się do trzech reszt fosforanowych ( α, β, γ), gdzie reszta α jest zawsze dołączona do pentozy danego nukleotydu; pozostałe dwie są odłączane
podczas syntezy DNA (w postaci pirofosforanu Ppi, synteza DNA jest korzystna termodynamicznie dla k -ki)

○

Kierunek orientacji nici DNA: 5'->3'

○

DEOKSYNUKLEOTYD - ester fosforanowy nukleozydu (reszta fosforanowa + pentoza + zasada), ich nazewnictwo pochodzi od nazw zasad, podstawowa jedn ostka budulcowa DNA

○

DEOKSYNUKLEOZYD - N-glikozyd (pentoza + zasada), ich nazewnictwo pochodzi od nazw zasad

○

Nici muszą byd do siebie komplementarne



Asymetryczne kooce DNA (5' i 3') decydują o polarności nici



Pierwszorzędowa struktura DNA: sekwencja nukleotydów (liniowy układ nukleotydów na nici)

○

Drugorzędowa struktura DNA: przyjmuje najczęściej kształt podwójnej helisy prawoskrętnej (na jeden skręt przypada 10 nukleotydów), s tabilnośd zapewniają wiązania
wodorowe między zasadami i interakcje π-π (hydrofobowe oddziaływania między sąsiadującymi zasadami)

○

Budowa DNA

•

3.4 Rodzaje RNA

RNA (kwas rybonukleinowy) - drugi kwas nukleinowy, w k-ce ok. 4% - RNA kodujące, 96% - RNA funkcjonalne

•

Zamiast Tyminy jest Uracyl



Cukier to ryboza, a nie deoksyryboza



Najczęściej jest jednoniciowy



W strukturze RNA (najczęściej tRNA) mogą występowad zmodyfikowane zasady azotowe, co prowadzi do braku zachowania zasady komplementarności łączenia zasad,
nierzadko dochodzi do połączenia między trzema zasadami



Wiązania fosfodiestrowe są słabsze niż w DNA



Podobna do budowy DNA, ale:

○

Budowa RNA:

•

RNA jest bardziej zróżnicowane strukturalnie i funkcjonalnie od DNA (można to wytłumaczyd faktem, że DNA jest tylko magazynem informacji)

•

I) pętli (w rRNA)
II) szpilek do włosów (w tRNA)
III) wybrzuszeo (gdy po jednej stronie dupleksu RNA występuje więcej nukleotydów - zaburzenie w układzie przestrzennym i zmniejszenie stabilności cząsteczki)
IV) wewnętrznych pętli (gdy w łaocuchu RNA występują niekomplementarne połączenia zasad typu pirydyna -pirydyna, puryna-puryna)

Formy tworzone przez RNA stabilizowane są miejscowymi podwójnymi wiązaniami w postaci:

•

Występuje także helisa A-RNA i A'-RNA i potrójny łaocuch

•

Kodujące/funkcjonalne (ogólny podział)

○

RNA kodujące (mRNA) - transkrypt genów kodujących białka, po zakooczeniu transkrypcji ulega degradacji

○

Czapeczka - funkcje ochronne podczas transportu snRNA i mRNA z jądra do cytoplazmy, a także podczas inicjacji translacji



Sekwencja kodująca - specyficzna dla danego mRNA, początkowo (pre-mRNA) zawiera eksnony i introny (wycinane w procesie splicingu)



Ogon poli(A) - rola niewyjaśniona do kooca



Ogólna budowa (u Procaryota): czapeczka na koocu 5', specyficzna sekwencja nukleotydów, ogon poli(A) zlokalizowany na koocu 3'

○

rRNA (rybosomalne RNA): obecne u wszystkich organizmów, zwykle najbardziej rozpowszechniony ze wszystkich RNA, jest integralną częścią rybosomów (50-70% ich
składu), decyduje o kształcie i wielkości rybosomów, o rozmieszczeniu białek w nich, poza zestawem czterech podstawowych rybonukleotydów zawiera wiele
zmodyfikowanych pseudorybonukleotydów



tRNA (transportujące RNA): ściśle związane z syntezą białek, tRNA rozpoznaje kod genetyczny mRNA, a następnie transportuje odpowiednie aminokwasy do rybosomu
podczas translacji , drugorzędowa budowa w formie spinki do włosów/czterolistnej kooczyny, w miejscu zagięcia tRNA znajduje się antykodon (sekwencja trzech
nukleotydów, komplementarna do kodonu na mRNA), na szczycie przyłączony jest aminokwas, tRNA + aminokwas = aminoacylo-tRNA



snRNA (małe jądrowe RNA): U-RNA, bogate w urydynę, kluczowa rola w regulacji ekspresji genów poprzez udział w składaniu pre-mRNA w procesie splicing, występuje w
jądrze, ściśle związane z białkami w kompleksy snRNPs



snoRNA (małe jąderkowe RNA): zlokalizowane w obszarach jąderkowych w jądrze eukariontów, rola - chemiczne modyfikacje rRNA poprzez zarządzaniem enzymami, które
dokonują tych zmian, bierze także udział w telomerazie u ssaków - jako enzym rybonukleoproteinowy dobudowywuje brakujący 3'->5' terminalny odcinek nici opóźnionej
DNA podczas replikacji DNA, ponadto bierze też udział w procesie importingu genów zlokalizowanych na chromosomach płciowych



miRNA (mikroRNA): małe, regulatorowe RNA, odgrywające rolę w regulacji ekspresji genów, zwłaszcza podczas rozwoju embrionalnego organizmu (wycisza ekspresję
genów poprzez tłumienie translacji w procesie interferencji RNA), obecny jest w cytoplazmie (w jądrze jako pre-miRNA), wiąże się z mRNA poprzez niedoskonałe parowanie
zasad (jest tylko częściowo komplementarne do mRNA) co powoduje wstrzymanie translacji



siRNA (małe ineterferujące RNA): występuje w formie dwuniciowej (dsRNA), podobnie jak miRNA bierze udział w interferencji mRNA, jest komplementarny do wyciszanego
genu, po wniknieciu do cytoplazmy zostaje przecięty na dwie nici, które blokują translację danego genu



RNA funkcjonalne:

○

Rodzaje RNA

•

Synteza prekursorowego RNA (preRNA)

○

Modyfikacja kooców - rozpoczyna się podczas syntezy eukariotycznego mRNA, do kooca 5' dołączany jest pojedynczy nukleotyd guanylowy (czapeczka), d o kooca 3' ogon poli(A)

○

Składanie mRNA (splicing) - usuwanie intronów poprzez cięcie i łączenie eksonów

○

Cięcie - proces istotny zwłaszcza dla dojrzewania rRNA, tRNA, (pre -rRNA i tRNA syntezowane jako jedna jednostka transkrypcyjna cięta na mniejszej fragmenty w celu uzyskania
dojrzałego RNA)

○

Modyfikacje chemiczne - przyłączenie grup funkcyjnych do rybonukleotydów prekursorów rRNA, tRNA i mRNA

○

Dojrzewanie RNA:

•

3.5 Różnice między kwasami nukleinowymi

Cecha

DNA

RNA

Budowa

Polimer, deoksyryboza, zasady azotowe, reszty fosforanowe Polimer, ryboza, zasady azotowe, reszty fosforanowe

Lokalizacja

Jądro, mitochondria

Jadro, cytoplazma, mitochondria

Cukier

Deoksyrboza

Ryboza

Zasady azotowe

Adenina (A), tymina (T), cytozyna (C), guanina (G)

Adenina (A), Uracyl (U), Cytozyna (C), guanina (G)

Parowanie się zasad A-T, C-G

A-U, C-G

Struktura

Podwójna helisa

Pojedyncze lub podwójne nici, struktura spinki do włosów, struktura pętli

3 Kwasy nukleinowe

3 Kwasy nukleinowe Strona 1

Struktura

Podwójna helisa

Pojedyncze lub podwójne nici, struktura spinki do włosów, struktura pętli

Funkcja

Przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej

Regulacja ekspresji genów, synteza białek, inhibicja ekspresji genów

3.6 Replikacja genomu

Polega na powieleniu genomu

•

Leży u podstaw dziedziczenia

•

Mechanizm wiernego kopiowania genomu odbywa się u wszystkich komórek podlegających podziałom

•

W przypadku eukariontów replikacja zachodzi przed każdym podziałem mitotycznym i przed pierwszym podziałem mejotycznym

•

Poglądy na ten temat pierwsi zaproponowali Watson i Crick

•

Proces replikacji opiera się na rozpleceniu dwuniciowej helisy DNA do dwóch pojedynczych nici, a następnie na ich podstawie polimeryzacji nowych, komple mentarnych łaocuchów
potomnych

•

Proces replikacji okazał się bardziej skomplikowany

•

Replikacja na poziome enzymatycznym zapewnia oprócz mechanizmu tworzenia nici potomnych DNA tak że wysoką efektywnośd i wiernośd kopii w pełnej synchronizacji z cyklem
komórki

•

Proces wydłużania nici odbywa się w kierunku 5'->3' (w konsekwencji budowy)

•

Proces replikacji ma charakter semikonserwatywny, co oznacza, że każda nid stanowi matrycę do wytworzenia nowej, potomnej

•

Obie nici po replikacji mają identyczny zapis genetyczny

•

Komórkowy system kontroli enzymatycznej replikacji i sprawdzania błędów podczas replikacji zapewnia prawie perfekcyjnie wierne odtworzenie nici macierzystej

•

Błędy powodujące powstawanie mutacji zdarzają się niezwykle rzadko

•

Dyspersyjny (powstają dwie podwójne nici DNA, w którym każda składa się w części z nowej nici, a w części z matrycowej)

○

Konserwatywny (powstają dwie helisy DNA, jedna zawiera obie nici rodzicielskie, druga - obie nici potomne)

○

Semikonserwatywny (powstają dwie podwójne helisy DNA, w każdej z nich jedna nid jest nicią macierzystą, druga - potomną)

○

Wcześniej panowały 3 hipotezy dotyczące replikacji (przed udowodnieniem semikonserwatywnego charakteru):

•

1958 r. - udowodnienie hipotezy semikonserwatywnej replikacji, dzi ęki eksperymentowi na E. coli prowadzonych przez M. Meselsona i F. Stahla

•

U Eucaryota - powielanie chromosomów

○

U Procaryota - powielanie całego, kolistego genomu

○

Miejsce inicjacji zaznaczone jest jako pętla D



Spowodowane jest to fragmentem RNA, który hybrydyzuje do jednej z nici DNA i działa jako miejsce startowe dla syntezy DNA



Wg tego modelu replikacja DNA przebiega asymetrycznie



Najpierw syntezie podlega jedna z nici następnie druga



W DNA mitochondrialnym, u wirusów bakteryjnych i eukariotycznych - replikacja przebiega wg modelu przemieszczającej się pętli

○

Proces replikacji podzielono na trzy części: inicjację, elongację i terminację

○

Inicjacja - rozpoczyna się w ściśle określonych miejscach tzw. ori, które zawierają specyficzne sekwencje nukleotydów służące do przede wszystkim do wiązania białek
inicjatorowych, a także sekwencje w obrębie których nici DNA się rozdzielają

○

U eukariontów replikacja rozpoczyna si ę w wielu miejscach jednocześnie

○

Przeciętnie komórka eukariotyczna potrzebuje 15-30 minut aby skopiowad chromosom, średnio 5-10 h żeby skopiowad cały genom

○

Komórki zawierające kolisty DNA - replikacja zwykle zachodzi w dwóch kierunkach, zaczynając od tego samego miejsca ori, jednak szybkośd nie zawsze jest taka sama

○

Replikon - jednostka replikacji, w jego skład wchodzi odcinek DNA z miejscem inicjacji replikacji, a także wszystkie sekwencje przylegające do niego i replikowane raze m z nim; jest
to autonomiczny fragment DNA zdolny do niezależnej replikacji

○

Bakterie i wirusy mają jeden replikon, u eukariontów - każdy chromosom ma ich kilkaset

○

Replikacja jest procesem nie ci ągłym - tylko nid wiodąca może byd replikowana w sposób ciągły, dotyczy to nici matrycowej biegnącej 3' ->5'

○

Jako że widełki replikacyjne mogą przesuwad się tylko w jednym kierunku, nid 5' ->3' (nid opóźniona) jest syntezowana w przeciwnym kierunku do ruchu widełek replikacyjnych, a
syntezowane fragmenty mają postad krótkich fragmentów Okazaki, które są następnie łączone w jedną całośd

○

Jednym z najważniejszych parametrów określających typ replikacji jest kształt DNA, liczba łaocuchów, z których składa się genomowe DNA, poz a tym ważna jest konfromacja,
struktura dwuniciowa oraz zwinięcie superhelikalne DNA w chromosomach, a także łatwośd rozdzielenia nici w miejscach inicjacj i replikacji

○

Istnieje kilka wariantów tego typu replikacji

•

Jest skoordynowana z cyklem komórkowym (w momencie podziału komórki są dostępne tylko dwie kopie genomu)



Proces replikacji może byd zatrzymany w razie uszkodzenia DNA w celu naprawy



Regulacja replikacji w genomie eukariontów przebiega na dwóch poziomach

○

Faza M -mitoza i cytokineza



Faza G1 - przerwa, w której zachodzą procesy metaboliczne służące budowie podstawowych składników komórki, jak transkrypcja i translacja



Faza S - synteza DNA (replikacja)



Faza G2 - przerwa, przed mitozą



W skład syklu komórkowego wchodzą:

○

W fazie S u eukariontów następuje duplikacja chromosomów i białek histonowych

○

Przejście komórki z jednej fazy do drugiej jest regulowane przez wzajemne oddziaływania między kinazami, fosfatazami i proteazami

○

Etapem rozpoczynającym fazę S jest inicjacja replikacji, w każdym regionie ori rozpoczyna się w ściśle określonym czasie (zależnym od fizycznej organizacji genomu)

○

W tym samym momencie replikacja może rozpoczynad się w kilku miejscach ori, zgrupowanych w genomie w postaci klastrów, zorganizowanych w punkty ogniskowe replikacji

○

Regiony takie określane są mianem "fabryk DNA"

○

Aktywnie transkrybowane geny zawarte euchromatynie oraz centromer replikowane s ą wcześniej niż telomery i miejsca niepodlegające transkrypcji (heterochromatyna)

○

Replikacja DNA u Eucaryota

•

Składa się z trzech etapów: inicjacji, elongacji i terminacji

○

Zaczyna się zawsze w tym samym miejscu DNA (miejsce ori)



Fragment o długości ok 200-300 par zasad



Po zainicjowaniu tworzą się tzw. widełki replikacyjne mogące się rozgałęziad w dwóch przeciwnych kierunkach



Rozpoczyna się przez przyłączenie białek inicjatorowych do specyficznych sekwencji DNA zlokalizowanych w miejscach ori powodując zamiany w strukturze (ułatwia to
wytworzenie widełek replikacyjnych) i regulację dołączanie do miejsc ori białek replikacyjnych niezbędnych do rozpoczęcia syntezy DNA



Inicjacja:

○

 W momencie przejścia do tej fazy helikaza DnaB inicjuje powstawanie widełek replikacyjnych poprzez rozplecenie nici DNA
 Na poziome chemicznym syteza DNA przebiega bardzo podobnie do procesu transkrypcji, mechanizm jest jednak odmienny
 Replikacja jest bardziej skomplikowana, gdyż syntezie ulegają obie nici DNA, natomiast polimeraz DNA może prowadzid ten proces tylko w jednym kierunku (5'->3'), co

oznacza że nid wiodąca jest syntezowana w sposób ciągły, opóźniona - w postaci fragmentów Okazaki

 Ponadto polimeraza DNA nie jest w stanie zainicjowad syntezy DNA opierając się na jednoniciowej matrycy (potrzebny do tego jest krótki odcinek dwuniciowy z wolny

koocem 3', do którego dodawane są kolejne nukleotydy = starter)

 jeden starter występuje na nici wiodącej, na nici opóźnionej jeden starter przypada na jeden fragment Okazaki
 Po usunięciu starterów następuje synteza brakujących fragmentów, po czym sąsiadujące fragmenty Okazaki łączą się przy udziale ligazy (powstaje ciągła nid

komplementarna do nici wiodącej)

○ Elongacja:

 Wymaga zatrzymania mechanizmu enzymatycznego kopiującego DNA
 U prokariontów miejsce terminacji znajduje się naprzeciwko miejsca inicjacji i znajdują się tam cztery sekwencje ter (terA/terD i terB/terC,)
 W regionie ter zachodzi wiązanie białka terminacyjnego (kodowanego przez gen tus), które spełnia w komórce rolę supresora replikacji (jest ono inhibitorem helikazy DnaB)
 U eukariontów, gdzie jest wiele miejsc ori (i wiele replikonów), replikacja kooczy się gdy widełki replikacyjne podążające w przeciwne strony zetkną się
 Ponadto istnieje ryzyko utraty części DNA na koocach chromosomów: do syntezy nici opóźnionej niezbędne jest przyłączenie fragmentu RNA tuż przed widełkami

replikacyjnymi (stanowiącego starter dla nowego fragmentu Okazaki), a na koocach chromosomów brakuje miejsca do syntezy startera dla ostatniego fragmentu Okazaki,
przez co możliwa byłaby utrata części materiału podczas każdego cyklu replikacyjnego

○ Terminacja:

U prokariotów ze względu na koliste DNA ten problem nie występuje, u eukariontów zapobiegają temu telomery



 Są to krótkie, powtarzalne sekwencje DNA
 W obrębie gatunku ich średnia długośd pozostaje niezmienna

□ Są uczestnikami terminacji (ich obecnośd zapewnia niezmienną długośd genomu)
□ Chronią one przed łączeniem się chromosomów między sobą oraz przed działaniem nukleaz

 Obecnośd telomerów na koocach chromosomów jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania organizmu

Za ich syntezę odpowiedzialna jest telomeraza

○ Telomery:

Etapy replikacji genomu

•

3 Kwasy nukleinowe Strona 2

 Za ich syntezę odpowiedzialna jest telomeraza
 Początkiem syntezy telomerów jest zawsze koocowa sekwencja telomeru pozostałego z poprzedniego cyklu replikacyjnego
 Matrycą jest telomerazowy RNA, który tworzy pary zasad z koocowym odcinkiem cząsteczki DNA i przedłuża ją o krótki odcinek
 Następnie telomerazowy RNA ulega translokacji do następnego miejsca parowania zasad wzdłuż DNA i znów wydłuża go o kolejny krótki odcinek (powtarzane jest to do

uzyskania przez telomerowy odcinek odpowiedniej długości)

 uzyskuje się w ten sposób nid bogatą w zasady A i C, do której następnie dobudowywana jest komplementarna nid, bogata w T i G (i jest dłuższa od pierwszej)
 Wolny koniec ulega zawinięciu (tzw. Struktura szpilki do włosów)
 Następnie tworzą się wiązania wodorowe między zasadami guaninowymi, które mogą przyjmowad formę czteroniciową
 Ponadto kooce są dodatkowo zabezpieczone przez białkowe czapeczki (ochrona przez naprawczym działaniem enzymów)
 Obecnośd tej czapeczki stanowi informację dla systemu naprawczego, że jest to prawidłowy koniec chromosomu, a nie powstały w wynikunp. pęknięcia
 Telomeraza nie jest aktywna we wszystkich komórkach ssaków
 Podczas całego rozwoju aktywna jest w komórkach macierzystych i rozrodczych, u reszty komórek chromosomy ulegają skróceniu po każdym cyklu replikacyjnym
 Po wielu podziałach komórki chromosom ulega na tyle skróceniu, że geny znajdujące się przy jego koocach ulegają degradacji
 Zjawisko skracania się telomerów jest także ściśle związane z tzw. procesem stężenia się komórek - łatwo zauważalnym w liniach komórek hodowanych in vitro
 Cechą rozpoznawczą jest zaprzestanie podziałów mitotycznych
 Zjawisko to nie występuje w komórkach nowotworowych (komórki te mogą dzielid się nieprzerwanie ze względu na stałą aktywnośd telomerazy, w niektórych [rzy[adkach

długośd telomerów może znacząco wzrosnąd)

3 Kwasy nukleinowe Strona 3