Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 1 z 6

Podstawowe techniki bada

Podstawowe techniki bada

ń

ń

immunohematologicznych

immunohematologicznych

Joanna Urbaniak

Katedra Analityki Medycznej

Zakład Chemii Klinicznej

Serologia transfuzjologiczna

Immunohematologia

Serologia grup krwi

Zajmuje si

ę

mi

ę

dzy innymi:

okre

ś

laniem budowy antygenowej składników krwi

(zwłaszcza erytrocytów)

badaniem odpowiedzi immunologicznej na antygeny
znajduj

ą

ce si

ę

na komórkach i białkach krwi

Wiadomo

ś

ci ogólne

1.

Prawie 300 ró

ż

nych antygenów

2.

Co najmniej 30 układów grupowych

3.

Za istotne klinicznie uwa

ż

a si

ę

te antygeny, które mog

ą

indukowa

ć

powstawanie przeciwciał nieregularnych

odpowiedzialnych za:

- wczesne lub pó

ź

ne reakcje poprzetoczeniowe

- rozwój choroby hemolitycznej płodu i noworodka

- hemoliz

ę

po przeszczepieniu szpiku lub KKM

Układ grupowy

Tworz

ą

antygeny zdeterminowane bezpo

ś

rednio

lub po

ś

rednio przez allele zajmuj

ą

ce to samo locus

w chromosomie lub miejsca poło

ż

one tak blisko siebie,

ż

e zjawisko crossing-over zdarza si

ę

mi

ę

dzy nimi

bardzo rzadko.

Układ grupowy

Antygen zalicza si

ę

do układu grupowego, je

ś

li:



Antygen indukuje powstawanie swoistych przeciwciał



Wykryto i zlokalizowano gen i ustalono jego

sekwencj

ę

nukleotydow

ą



Wykazano,

ż

e gen jest ró

ż

ny od innych dotychczas

poznanych



Wykazano dziedziczenie antygenu

Antygeny nie spełniaj

ą

ce wszystkich kryteriów zalicza

si

ę

do

kolekcji

lub

serii

Układy grupowe erytrocytów

Gill

029

Kx

019

Kidd

009

RhAG

030

Gerbich

020

Diego

010

Globside

028

H

018

Duffy

008

I

027

Chido/Rodgers

017

Lewis

007

John Milton Hagen

026

Landsteiner-Wiener

016

Kell

006

Raph

025

Colton

015

Lutheran

005

Ok

024

Dombrock

014

Rh

004

Indian

023

Scianna

013

P

003

Knops

022

Xg

012

MNSs

002

Cromer

021

YT

011

ABO

001

Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 2 z 6

Poszukiwany

antygen na krwinkach

krwinki badane

+

przeciwciała o znanej

swoisto

ś

ci

(wzorcowe)

Poszukiwane

przeciwciała w surowicy

surowica badana

+

krwinki o znanej

budowie antygenowej

(wzorcowe)

Warunki reakcji uzale

ż

nione s

ą

od wła

ś

ciwo

ś

ci przeciwciał

Składowe reakcji aglutynacji

Natura ł

ą

czenia antygenu z przeciwciałem



wi

ą

zania jonowe



wi

ą

zania wodorowe



siły Van der Waalsa



interakcje hydrofilowe i hydrofobowe

Dwie fazy reakcji aglutynacji

I. Uczulanie, opłaszczanie

II. Sieciowanie, aglutynacja

W

ś

rodowisku „solnym” (0.15 M NaCl)

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

potencjał zeta

25 nm

odległo

ść

pomi

ę

dzy krwinkami

Odległo

ść

pomi

ę

dzy miejscami wi

ążą

cymi antygen:

dla przeciwciał klasy IgM 30 nm; klasy IgG 14 nm

I. Uczulanie

wi

ą

zanie przeciwciał z antygenem na powierzchni

erytrocytów

Czynniki odgrywaj

ą

ce rol

ę

w fazie uczulenia



Temperatura; optymalna dla IgM 4-27

o

C, IgG 37

o

C



pH; stosuje si

ę

roztwory o pH około 7.0



Czas inkubacji; zale

ż

ny od:

- klasy przeciwciał

- powinowactwa przeciwciała do antygenu

-

ś

rodowiska reakcji



Siła jonowa; reakcja przebiega szybciej przy ni

ż

szej sile

jonowej



Stosunek ilo

ś

ciowy antygenu i przeciwciała; zwi

ę

kszanie

ilo

ś

ci przeciwciał w stosunku do antygenu na krwinkach

zwi

ę

ksza czuło

ść

reakcji

II. Sieciowanie

Przeciwciała „kompletne”

IgM



Temperatura pokojowa



0.15 M NaCl

Przeciwciała „niekompletne”

IgG



Temperatura 37

o

C



Ś

rodowisko o obni

ż

onej

sile jonowej (0.03 M NaCl)



Enzym proteolityczny



Surowica antyglobulinowa



Polibren



PEG

Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 3 z 6

Przeciwciała „kompletne” umo

ż

liwiaj

ą

powstawanie aglutynatów

w

ś

rodowisku soli fizjologicznej

w temperaturze pokojowej

Aglutynacja krwinek przy udziale przeciwciał „niekompletnych”

wymaga zmniejszenia odległo

ś

ci pomi

ę

dzy krwinkami poprzez

zmniejszenie ładunku ujemnego lub/i otoczki wodnej



papaina i bromelina

usuwaj

ą

reszty kwasu sjalowego

i/lub modyfikuj

ą

cz

ą

steczki wi

ążą

ce wod

ę

i/lub zmniejszaj

ą

przeszkody steryczne



polibren, polimer o ładunku dodatnim,

neutralizuje ładunek powierzchniowy

Test LEN

Inkubacja z LEN

LISS + papaina

Surowica

badana

Krwinki

wzorcowe



Poliwalentna

anty-IgG i C3b i C3d



Monowalentna

anty-IgG lub

anty-C3b lub

anty-C3d lub

IgA lub ...

Aglutynacj

ę

krwinek przy udziale przeciwciał

„niekompletnych” umo

ż

liwia zastosowanie surowicy

antyglobulinowej po

ś

redni test antyglobulinowy, PTA)

Po

ś

redni test antyglobulinowy, PTA

Inkubacja

Przemywanie

Surowica

badana

Krwinki

wzorcowe

Surowica

antyglobulinowa

Bezpo

ś

redni test antyglobulinowy, BTA

Do przemytych erytrocytów dodaje si

ę

surowic

ę

antyglobulinow

ą

Erytrocyty in vivo opłaszczone przeciwciałami s

ą

aglutynowane

Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 4 z 6

Test hamowania aglutynacji

Do badanego roztworu dodaje si

ę

znane przeciwciała

a nast

ę

pnie krwinki czerwone zawieraj

ą

ce poszukiwany

antygen. Je

ś

li w badanym roztworze był obecny

rozpuszczalny antygen poł

ą

czy si

ę

z przeciwciałami,

a krwinki wzorcowe pozostan

ą

wolne.

{osocze + anty-A} + krwinki grupy A

aglutynacja









brak rozpuszczalnego antygenu A

brak aglutynacji









obecny antygen A

Test hamowania aglutynacji

Brak aglutynacji, obecny rozpuszczalny antygen A

Aglutynacja, brak rozpuszczalnego antygenu A

1.

Testy szkiełkowe

2.

Testy probówkowe

3.

Testy mikropłytkowe

4.

Testy kolumnowe

Techniki reakcji serologicznych



Metody manualne



Metody automatyczne

Reakcje antygen przeciwciało przeprowadza si

ę

:

na płytach szklanych, porcelanowych,

polistyrenowych, szkiełkach podstawowych

Testy szkiełkowe

Najcz

ęś

ciej wykorzystywana, je

ś

li jednym ze

składników reakcji s

ą

przeciwciała „kompletne”

W Polsce głównie: AB0 i Rh

Całkowita aglutynacja, jeden du

ż

y zlep ++++ score 12

Całkowita aglutynacja, du

ż

e zlepy

+++ score 10

Cz

ęś

ciowa aglutynacja,

ś

rednie zlepy, ++ score 8

w tle niezaglutynowane krwinki

Cz

ęś

ciowa aglutynacja, drobne zlepy, + score 5

w tle niezaglutynowane krwinki

Bardzo słaba aglutynacja, w

ą

tpliwa, +/- score 2

Brak aglutynacji, reakcja ujemna, - score 0
jednorodna zawiesina krwinek

Reakcje antygen przeciwciało przeprowadza si

ę

w „probówkach serologicznych” Ø 7 mm

Testy probówkowe

Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 5 z 6

Testy probówkowe



Testy enzymatyczne (LEN)



Modyfikacje po

ś

redniego testu antyglobulinowego

(PTA-NaCl, PTA-LISS, PTA-PEG)



Bezpo

ś

redni test antyglobulinowy (BTA)



Reakcje zwykle przeprowadzane technik

ą

szkiełkow

ą

,

je

ś

li konieczne jest zwi

ę

kszenie czuło

ś

ci reakcji

Płytki mikrotitracyjne z dnem U lub V kształtnym.

Przy zastosowaniu płytek o specjalnej budowie dołka
technika została zautomatyzowana.

Testy mikropłytkowe

Testy kolumnowe

Mikrokolumienki wypełnione

ż

elem lub kulkami szklanymi,

pełni

ą

funkcje sita molekularnego

Testy kolumnowe

Odczyt wyniku reakcji: wzrokowy lub automatyczny

4 3 2 1 0

Testy kolumnowe s

ą

metod

ą

zalecan

ą

ze wzgl

ę

du na:



mo

ż

liwo

ść

standaryzacji badania



eliminacj

ę

reakcji nieswoistych, np. rulonizacji

krwinek



wysok

ą

czuło

ść

badania



bardziej obiektywny odczyt wyniku



skrócenie czasu badania



mniejsze zu

ż

ycie krwinek i odczynników wzorcowych



mo

ż

liwo

ść

automatyzacji

Reakcje nietypowe

Rulonizacja

Hemoliza

Aglutynacja mieszana

Poliaglutynacja

Panaglutynacja

Serologia grup krwi:
Podstawowe techniki badań immunohematologicznych

2010/2011

Joanna Urbaniak
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Strona 6 z 6

Rulonizacja

Rulonizacja makroskopowo przypomina słab

ą

aglutynacj

ę

,

Surowica badana „aglutynuje” krwinki ka

ż

dej grupy

mo

ż

e pojawi

ć

si

ę

u osób z zaburzeniami składu

białek osocza (makroglobulinemie, choroby

nowotworowe, oparzenia)

po podaniu dekstranu lub

ś

rodka kontrastowego

do bada

ń

radiologicznych

Ró

ż

nicowanie:

ocena mikroskopowa

Rulonizacja

Rulonizacja makroskopowo przypomina słab

ą

aglutynacj

ę

,

Surowica badana „aglutynuje” krwinki ka

ż

dej grupy

mo

ż

e pojawi

ć

si

ę

u osób z zaburzeniami składu

białek osocza (makroglobulinemie, choroby

nowotworowe, oparzenia),

po podaniu dekstranu lub

ś

rodka kontrastowego

do bada

ń

radiologicznych.

Ró

ż

nicowanie:

ocena mikroskopowa

Hemoliza

Hemoliza krwinek wyst

ę

puje, gdy przeciwciała

(

allohemolizyny

) po zwi

ą

zaniu z antygenem krwinek

aktywuj

ą

dopełniacz

hemolizy nie wolno przeoczy

ć

, oznacza reakcj

ę

dodatni

ą

trzeba powtórnie przeprowadzi

ć

reakcj

ę



po rozcie

ń

czeniu surowicy NaCl 1:9 lub



po zniszczeniu dopełniacza, np. przez ogrzewanie
surowicy przez 30 minut w temperaturze 56

o

C

hemoliza mo

ż

e by

ć

spowodowana bł

ę

dami

technicznymi, tj. domieszk

ą

wody

Aglutynacja mieszana

Pod wpływem odczynnika wzorcowego cz

ęść

krwinek ulega

aglutynacji, cz

ęść

pozostaje w zawiesinie

Obecno

ść

słabej odmiany antygenu (A

3

, B

3

)

Przetoczenie krwinek innej grupy (np. krwi

uniwersalnej)

Po przeszczepieniu allogenicznych komórek

macierzystych od dawcy o innej grupie krwi AB0

(chimera transplantacyjna)

Poliaglutynacja/Panaglutynacja

zjawisko aglutynowania w testach serologicznych

wszystkich krwinek badanych pod wpływem ka

ż

dej

surowicy pochodzenia ludzkiego na skutek odsłoni

ę

cia

determinant T, Tn i/lub innych na krwinkach pod wpływem

enzymów bakteryjnych (m.in. neuraminidazy)

Poliaglutynacja - odsłoni

ę

cie determinant zachodzi in vivo,

zwykle w przebiegu zaka

ż

enia

Panaglutynacja - odsłoni

ę

cie determinant zachodzi in vitro,

z powodu zaka

ż

enia samej próbki