Streszczenie
Skaza korkowa jest poważnym problemem w przemyśle winiar-
skim. Wadliwe wina charakteryzują się nieprzyjemnym zapachem
stęchlizny i pleśni, którego źródłem są związki chlorofenolowe.
Substancje odpowiedzialne za niekorzystny zapach migrują do bu-
telkowanego wina z korka lub powstają w trakcie produkcji napoju.
W pracy tej przedstawiono instrumentalne metody wykrywania
i ilościowego oznaczania chloroanizoli – związków odpowiedzial-
nych za większość przypadków skazy korkowej.

Summary
Cork taint is an important problem in wine industry. Tainted wines
are characterized by unpleasant musty, mouldy odour of chloro-
phenolic compounds. In bottles, these compounds migrate from
the cork to wine or are formed during winification. In this paper
the instrumental methods used for chloroanisole detection and
quantification are presented. This compounds are responsible for
the most cases of cork taint.

Słowa kluczowe
wino, aromat wina, skaza korkowa, 2,4,6-chloroanizol

Key words
wine, wine aroma, cork taint, 2,4,6-chloroanisole

Skaza (wada) korkowa stanowi poważny problem dotykający, jak szacują
różne źródła informacji, ok. 2-5% wszystkich produkowanych win
(16). Zapach korka w winie jest bardzo specyficzny i oceniany jako
nieprzyjemny. Może on być ostry, podobny do zapachu stęchlizny
czy pleśni, lub prawie niewyczuwalny. Szerokie badania prowadzone
na winach dotkniętych skazą korkową wykazały, że głównym źródłem
zapachu korkowego jest 2,4,6-trójchloroanizol (TCA) obecny w więk-
szości wadliwych napojów. Niepożądanymi substancjami w winach
o nieprzyjemnym zapachu pleśniowym są także: gwajakol, 2-metylo-
izoborneol, 1-okten-3-on, 1-okten-3-ol oraz inne chlorowcopochodne
anizolu: 2,3,4,6-czterochloroanizol (TeCA), pięciochloroanizol (PCA),
2,4,6-trójbromoanizol (TBA) (15).

Źródła skażenia wina mogą być różne, jednym z nich są mikro-

biologiczne zanieczyszczenie korka lub obecność substancji zawiera-
jących chlor. Związki zapachowe korka mogą migrować do napoju
alkoholowego. Korek nie jest jednak jedynym źródłem kontaminacji
wina. Dodatkowe zagrożenie stwarza stosowanie w produkcji wody
chlorowanej lub środków zawierających chlor, przeznaczonych do
odkażania sprzętu w winiarni. Skaza korkowa częściej związana jest
ze stanem higieny w winiarni i warunkami przechowywania napojów
alkoholowych niż z samym korkiem (19). Związki odpowiedzialne za
skazę korkową wykryto zarówno w pomieszczeniach winiarni, ujęciach
wody, jak i w beczkach. Obecność wyżej wymienionych substancji
stanowi duży problem dla winiarzy, ponieważ wymaga zachowania
szczególnej ostrożności podczas produkcji, aby nie dopuścić do
skażenia produktu (7, 14).

Najlepiej przebadanym związkiem wpływającym na powstawanie

skazy korkowej jest 2,4,6-trójchloroanizol. TCA charakteryzuje się
niskim progiem wyczuwalności zapachowej, wobec czego związek ten
wykrywany jest już w śladowych ilościach. Próg wyczuwalności TCA
w winie wynosi poniżej 10 ng/L i zależy bezpośrednio od indywidu-
alnych cech sensorycznych człowieka i rodzaju wina (16). Wina, które
są dotknięte skazą korkową, zawierają 20-370 ng/L TCA (2).

TCA w korkach powstaje ze związków fenolowych w wyniku

dwuetapowego mechanizmu. Fenole obecne w korku ulegają reak-
cji chlorowania za pomocą podchlorynu wapnia, w wyniku czego
powstaje 2,4,6-trójchlorofenol, z którego po bezpośredniej metylacji

Instrumentalne metody wykrywania

skazy korkowej w winach

mikrobiologicznej, przy katalitycznym udziale pleśni, powstaje 2,4,6-
-trójchloroanizol. Procesy te zachodzą podczas produkcji i przecho-
wywania korka oraz na dębowych beczkach stosowanych w produkcji
wina (20). Z powodu dużej lotności i zdolności do adsorbowania się
na powierzchni różnych materiałów TCA szybko przenosi się poprzez
sprzęt stosowany w winiarni. Pleśnie tworzące 2,4,6-trójchloroanizol
są tlenowcami wrażliwymi na obecność etanolu oraz siarczanów(IV),
dlatego nie rozwijają się na wewnętrznych ściankach pełnych beczek,
ale na ich zewnętrznej powierzchni. Każdy etap produkcji wina,
taki jak: rozdrabnianie owoców, fermentacja w otwartych tankach
(kontakt z powietrzem zawierającym TCA), czy obciąg wina mogą
prowadzić do jego skażenia. Dodatkowe źródło zanieczyszczenia
stanowią pestycydy zawierające chlor, obecne w surowcu winiarskim,
często metabolizowane przez pleśnie do chloropochodnych fenoli
(9, 15).

Skaza korkowa jest istotnym problemem ekonomicznym w prze-

myśle winiarskim (14). Roczne straty producentów win w samych
Stanach Zjednoczonych szacuje się na sto milionów dolarów, dlate-
go niezbędne stało się opracowanie metod analitycznych znacznie
bardziej czułych niż zmysły ludzkie (23). Ze względu na niskie
stężenie chlorowcopochodnych anizolu w winie oraz lotność tej
grupy związków najczęściej stosowaną metodą analizy ilościowej jest
chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS).
Zamiast detektora mas (MS) można zastosować znacznie tańszy de-
tektor wychwytu elektronów (ECD). Ponieważ omawiane pochodne
anizolu są oznaczane w różnego rodzaju materiałach (wina, korki,
woda, powietrze, opakowania), dotychczas opracowano wiele sposo-
bów przygotowania prób do analiz z zastosowaniem nowoczesnych
technik ekstrakcyjnych.

Obecnie większość badań skupia się na wykryciu TCA w winach

i materiałach korkowych przez wykorzystanie: ekstrakcji rozpuszczal-
nikiem (4), ekstrakcji płynem w stanie nadkrytycznym (SFE) (22),
ekstrakcji ciecz – ciało stałe (SPE) (20), mikroekstrakcji do fazy stałej
(SPME) (11) i wielokrotnej mikroekstrakcji MHS-SPME (5), ekstrakcji
sorpcyjnym prętem mieszającym (SBSE) (8) oraz technik dynamicz-
nej analizy fazy nadpowierzchniowej (PT) (3) i różnych modyfikacji
perwaporacji (PV) (7).

dr Paweł Sroka

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

3

/2008

34

Poszczególne metody różnią się granicą wykrywalności i oznaczal-

nością oraz parametrami, takimi jak względne odchylenie standardowe
(RDS) i odzysk metody (tabela 1).

Jako rozpuszczalniki do ekstrakcji TCA z wina i korków używano

n-pentanu, n-heksanu oraz mieszaninę n-pentanu z eterem dietylowym
lub octanem etylu. Ekstrakcje wykonywano poprzez mieszanie za po-
mocą aparatu Soxhleta, Kuderna-Danisha oraz w łaźni ultradźwiękowej
(2, 9, 10, 14, 15).

W przypadku rozdziału chromatograficznego ważnymi zagadnie-

niami podczas wyboru metody oznaczenia 2,4,6-trójchloroanizolu są
dostępność i koszt aparatury do przygotowywania próby oraz możli-
wość automatyzacji oznaczeń, co jest niezwykle istotne w przypadku
rutynowych analiz. Powyższe wymagania spełnia analiza TCA oparta
na nadpowierzchniowej mikroekstrakcji do fazy stałej (HS-SPME),
opisana we wcześniejszych numerach „Laboratorium – Przeglądu
Ogólnopolskiego” (21). Dotychczas do tego celu stosowano różne
typy włókien SPME, pokryte polidimetylosiloksanem (PDMS) 7 μm
i 100 μm, kopolimerem polidimetylosiloksanu z diwinylobenzenem
(PDMS-DVB) 65 μm, poliakrylanem (PA) 85 μm, CAR-PDMS 65 μm
i DVB-CAR-PDMS 50/30 μm (5, 11). Badania prowadzone przez
Martínez-Uruńuela i współpracowników (12) wykazały, że w przy-
padku win czerwonych TCA jest najlepiej absorbowane przez włókna
DVB-CAR-PDMS 50/30 μm w temperaturze 70°C, a optymalny
czas ekstrakcji wynosi 60 min. W przypadku stosowania włókien
PDMS 100 μm optymalna temperatura ekstrakcji jest niższa i wynosi
20°C. Udowodniono również, że mieszanie próby w czasie ekspozycji
włókna w fazie nadpowierzchniowej oraz wysycenie próby chlorkiem
sodu zwiększa względną odpowiedź detektora (6).

Soleas wraz ze współpracownikami (20) przebadali 2400 różnych win,

stosując ekstrakcję ciecz – ciało stałe (SPE) za pomocą kolumn C

18

.

Złoże kolumny kondycjonowano octanem etylu i roztworami etanolu,
a eluowano dwuchlorometanem, uzyskując 125-krotne zatężenie ana-
litu względem wyjściowej próby. Na podstawie uzyskanych wyników
wykazano największe skażenie TCA win zamykanych korkami aglo-
merowanymi (tabela 2).

Ze względu na specyfikę chromatografii gazowej oznaczenia

chlorowcopochodnych anizolu mogą być wykonywane jedynie przez

Technika

Granica wykrywalności

(oznaczalności)

(ng/L)

Względne

odchylenie

standardowe (%)

Odzysk (%)

Sposób detekcji

Literatura

Ekstrakcja

rozpuszczalnikiem

organicznymk

900-1190

(3950)

6-30

43-110

MS, ECD

2, 4, 10

PT

12,5

3-13b

4-11cz

3-12k

88-102

MS

3

PV

4-26

2-6

82-118

MS

7

SBSE

0,03

b

-0,06cz

(0,1-0,2)

2-4

b.d.

MS

24

SFEk

5 pg

(9 pg)

7

97

MS

22

SPE

0,1

(2)

2-6

86-102

MS

20

SPME

0,15-5,0

(0,4-18)

1-13

28-113

MS, ECD

1, 7, 11

Tabela 1. Parametry oznaczania TCA w winach i korkach uzyskane za pomocą chromatografii gazowej z różnymi technikami przygotowania prób
b – wina białe, cz – wina czerwone, k – korek, PT – zatężanie techniką wymywania i wychwytywanie na złożu stałego sorbentu, PV – pewaporacja,
SBSE – ekstrakcja z wykorzystaniem wirującego elementu sorpcyjnego, SFE – ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym, SPE – ekstrakcja do fazy stałej,
SPME – mikroekstrakcja do fazy stałej, b.d. – brak danych

35

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

3

/2008

35

wykwalifikowany personel, a nakłady inwestycyjne przeznaczone
na zakup aparatury analitycznej wynoszą kilkaset tysięcy złotych.
Nadal prowadzone są prace mające na celu oznaczanie związków
odpowiedzialnych za skazę korkową za pomocą znacznie tańszych
od GC metod instrumentalnych, które można zastosować w przy-
zakładowych laboratoriach winiarni. Przykładowo zespół Moore’a
(13) opracował biosensor do detekcji TCA. Jednak bezpośrednie
oznaczenie 2,4,6-trójchloroanizolu w winach wymienioną metodą
nie było możliwe ze względu na zbyt wysokie stężenie etanolu
w badanych próbach.

Obiecujące rezultaty uzyskał Sanvicens ze współpracownikami (18),

którzy opracowali metodę selektywnej ekstrakcji TCA i TBA z wyko-
rzystaniem specyficznych przeciwciał, połączoną z testem immuno-
enzymatycznym (ELISA). Metoda ta umożliwia oznaczenie w winach
obecności chloro- oraz bromopochodnych anizolu w stężeniu od
200-400 ng/L. Metodyka testów ELISA pozwala na przeprowadzenie
wielu oznaczeń równocześnie, a dzięki stosunkowo niskiemu kosz-
towi aparatury i jej prostocie może być wykonywana bezpośrednio
w winiarniach.

Podejmuje się także próby wykrycia skazy korkowej przy użyciu

tzw. sztucznego nosa. Do tego celu zastosowano brytyjskie urządze-
nie AromaScan (A32S/8S) z jednostką analizującą A32S, zawierającą
32-elementowy zestaw czujników. W celu kontroli jakości badane korki
umieszczono w termostatowanym pojemniku, z którego pobierano
powietrze zawierające lotne składniki korka (faza nadpowierzchniowa).
Zarejestrowane sygnały były przetwarzane przez specjalne oprogra-
mowanie, a po kalibracji umożliwiały szybkie i proste klasyfikowanie
prób na dwie grupy: do zaakceptowania i niespełniające wymagań
jakościowych (17).

W związku z wysokimi kosztami ponoszonymi przez producentów

win, związanymi z występowaniem skazy korkowej, wprowadzono
pewne zmiany. Obecnie coraz częściej stosowane są butelki z winem
zamykane korkami syntetycznymi lub zakrętkami. Wyeliminowano
środki dezynfekujące na bazie chloru, jak również zwrócono większą
uwagę na warunki przechowywania surowców i materiałów do pro-
dukcji win, w tym korków, palet, kartonów oraz tektury. Stosowanie
tradycyjnych zamknięć wymaga stałej, ścisłej kontroli jakościowej
korków, szczególnie pod względem zawartości składników lotnych oraz
przechowywania ich w odpowiednich warunkach uniemożliwiających
wtórne skażenie.

‰

Piśmiennictwo
1. Alzaga R., Ortiz L., Sánchez-Baeza F., Marco M.P., Bayona J.M.: Accurate

determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines at low parts per trillion by solid-
-phase microextraction followed by GC-ECD. „J. Agric. Food Chem.”, 2003,
51, 3509-3514.

2. Buser H.R., Zanier C., Tanner H.: Identification of 2,4,6-trichloroanisole as

a potent compound causing cork taint in wine. „J. Agric. Food Chem.”, 1982,
30, 359-362.

3. Campillo N., Aguinaga N., Vińas P., López-García I., Hernández-Córdo-

ba M.: Purge-and-trap preconcentration system coupled to capillary gas chromato-
graphy with atomic emission detection for 2,4,6-trichloroanisole determination in
cork stoppers and wines. „J. Chromatogr. A”, 2004, 1061, 85-91.

4. Chatonnet P., Bonnet S., Boutou S., Labadie M.D.: Identification and

responsibility of 2,4,6-tribromoanisole in musty, corked odors in wine. „J. Agric.
Food Chem.”, 2004, 52, 1255-1262.

5. Ezquerro O., Tena M.T.: Determination of odour-causing volatile organic

compounds in cork stoppers by multiple headspace solid-phase microextraction.
„J. Chromatogr. A”, 2005, 1068, 201-208.

6. Fischer C., Fischer U.: Analysis of cork taint in wine and cork material at olfac-

tory subthreshold levels by solid phase microextraction. „J. Agric. Food Chem.”,
1997, 45, 1995-1997.

7. Gómez-Ariza J.T., García-Barrera T., Lorenzo F.: Analysis of anisoles in

wines using pervaporation coupled to gas chromatography-mass spectrometry.
„J. Chromatogr. A”, 2004, 1049, 147-153.

8. Hayasaka Y., MacNamara K., Baldock G.A., Taylor R.L., Pollnitz A.P.:

Application of stir bar sorptive extraction for wine analysis. „Anal. Bioanal.
Chem.”, 2003, 375, 948–955.

9. Hill J.L., Hocking A.D., Whitfield F.B.: The role of fungi in the production of

chloroanisoles in general purpose freight containers. „Food Chem.”, 1995, 54,
161-166.

10. Juanola R., Subirá D., Salvadó V., Garcia-Regueiro J.A., Anticó E.: Evaluation

of an extraction method in the determination of the 2,4,6-trichloroanisole content
of tainted cork. „J. Chromatogr. A”, 2002, 953, 207-214.

11. Lizarraga E., Irigoyen A., Belsue V., González-Peńas E.: Determination of

chloroanisole compounds in red wine by headspace solid-phase microextraction and gas
chromatography-mass spectrometry. „J. Chromatogr. A”, 2004, 1052, 145-149.

12. Martínez-Uruńuela A., González-Sáiz J.M., Pizarro C.: Optimisation of

a headspace solid-phase microextraction method for the direct determination of
chloroanisoles related to cork taint in red wine. „J. Chromatogr. A”, 2004, 1056,
49-56.

13. Moore E., Pravda M., Guilbault G.G.: Development of a biosensor for the

quantitative detection of 2,4,6-trichloroanisole using screen printed electrodes. „Anal.
Chim. Act.”, 2003, 484, 15-24.

14. Peńa-Neira A., Fernández de Simón B., García-Vallejo M.C, Hernández T.,

Cadahía E., Suárez J.A.: Presence of cork-taint responsible compounds in wines
and their cork stoppers. „Eur. Food Res. Technol.”, 2000, 211, 257-261.

15. Pereira C.S., Pires A., Valle M.J., Boas L.V., Marques J.J.F., San-Romăo M.V.:

Role of Chrysonilia sitophila in the quality of cork stoppers for sealing wine bottles.
„J. Ind. Microbiol. Biotechnol.”, 2000, 24, 4, 256-261.

16. Prescott J., Norris L., Kunst M., Kim S.: Estimating a ‘‘consumer rejection

threshold’’ for cork taint in white wine. „Food Qual. Pref.”, 2005, 16, 345-349.

17. Rocha S., Delgadillo I., Ferrer Correia A. J., Barros A., Wells P.: Application

of an electronic aroma sensing system to cork stoppers quality control. „J. Agric.
Food Chem.”, 1998, 46, 145-151.

18. Sanvicens N., Moore E.J., Guilbault G.G., Marco M.P.: Determination

of haloanisols in white wine by immunosorbent solid-phase extraction followed
by enzyme-linked immunosorbent assay. „J. Agric. Food Chem.”, 2006, 54,
9176-9183.

19. Smoliński M.: Wada korkowa wina – 2,4,6-trójchloroanizol (TCA) – występowanie

i zapobieganie. „Przem. Ferm. Owoc. Warzyw.”, 2005, 3, 21-22.

20. Soleas G.J., Yan J., Seaver T., Goldberg D.M.: Method for the gas chromatogra-

phic assay with mass selective detection of trichloro compounds in corks and wines
applied to elucidate the potential cause of cork taint. „J. Agric. Food Chem.”,
2002, 50, 1032-1039.

21. Sroka P., Tuszyński T.: Zastosowanie mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME)

i chromatografii gazowej do oznaczania związków lotnych w napojach. Cz. II.
Napoje alkoholowe. „Laboratorium – Przegląd Ogólnopolski”, 2007, 9,
42-43.

22. Taylor M.K., Young T.M., Butzke C.E., Ebeler S.E.: Supercritical fluid

extraction of 2,4,6-trichloroanizole from cork stoppers. „J. Agric. Food Chem.”,
2000, 48, 2208-2211.

23. Vlachos P., Kampioti A., Kornaros M., Lyberatos G.: Development and

evaluation of alternative processes for sterilization and deodorization of cork barks
and natural cork stoppers. „Eur. Food Res. Technol.”, 2007, 225, 653-663.

24. Zalacain A., Alonso G. C., Lorenzo C., Ińiguez M., Salinas M. R.: Stir bar

sorptive extraction for the analysis of wine cork taint. „J. Chromatogr. A”, 2004,
1033, 173-178.

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

3

/2008

36