

Alergen



Alergen główny



Ekstrakt alergenowy



Szczepionka alergenowa



Desensytyzacja

Celem standaryzacji jest jednoczesne utrzymanie

składu i mocy wyciągów na stałym poziomie

Standaryzacja wyciągów alergenowych obejmuje:



pomiar mocy wyciągu



przyporządkowanie wyciągowi jednostek

standaryzacyjnych



identyfikację i charakteryzację materiału źródłowego

Obejmuje metody in vivo i in vitro.

Do metod in vivo

należą: punktowe testy skórne oraz

testy śródskórne

Zaś do metod in vitro należą: blokowanie RAST, test

uwalniania histaminy, test ELISA, ocena aktywności
enzymatycznej

Test RAST (radioalergosorpcji)

służy do pomiaru stężenia przeciwciał

klasy IgE reagujących z określonym alergenem.

Blokowanie tego testu opiera się na współzawodnictwie o przeciwciało

zawarte w surowicy między antygenem w ekstrakcie i alergenem
związanym z fazą stałą np. krążkiem celulozowym.

Im mniej przeciwciał zwiąże się z fazą stałą, tym wyciąg alergenowy

jest mocniejszy.

W celu określenia mocy ekstraktu, używa się średnich

wartości z rozcieńczeń jednostkowych dotyczących
poszczególnych grup.

Średnie te wyliczane są dla całej badanej grupy.

Im dany wyciąg jest słabszy, tym niższe jego rozcieńczenie

daje

ten

sam

efekt

biologiczny

co

najwyższe

rozcieńczenie w przypadku najmocniejszego wyciągu.

1.

Metoda Noona –

przyporządkowanie 1 gramowi pyłku traw 1 milion

jednostek Noona

2.

Metoda wagowo/objętościowa –

określenie stosunku wagi materiału wyjściowego do

objętości płynu służącego do sporządzenia wyciągu

3.

Metoda oceny azotu białkowego –

ocenienie

wyciągu

alergenowego

na

podstawie

ilościowego pomiaru zawartości wszystkich białek
występujących w roztworze

Standaryzacja alergenów

System Nordycki

System Amerykański

BU/ml

BAU/ml

biological unit

bioequivalent allergy unit



elektroforeza nośnikowa (SDS-PAGE)



ogniskowanie izoelektryczne (IEF)



immunoelektroforeza (CIE)



Western Blotting



Potraktowanie

cząsteczki

białka

przez

SDS

skutkuje

powstaniem kompleksów białko - SDS

o ustalonym stosunku

ładunku elektrycznego do masy



1 g białka wiąże 1,4 g SDS



W takim kompleksie SDS skutecznie maskuje oryginalny

ładunek białka –

białko uzyskuje ładunek ujemny



SDS-PAGE pozwala na łatwe i dokładne oznaczenie Mcz
rozdzielonych białek

Obecność SDS przynosi szereg korzyści:



zdecydowana większość białek jest rozpuszczalna w
elektrolitach zawierających SDS



separacja białek odbywa się zgodnie z ich M

cz



barwienie kompleksów białko- SDS jest znacznie

wydajniejsze niż samego białka



Obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną
degradację białek w trakcie separacji



umożliwia rozdział białek w gradiencie pH
utworzonym w porowatym

nośniku



podczas ogniskowania, polipeptydy

wędrują pod

wpływem przyłożonego napięcia do miejsca w żelu
gdzie pH = ich pI



odbywa

się w nośniku, w którym wartość pH buforu

zmienia

się w sposób ciągły od wartości najwyższej

przy katodzie do

najniższej przy anodzie



gradient

pH

tworzy

mieszanina

syntetycznych

niskocząsteczkowych

związków

alifatycznych

zwanych

amfolitami



Wykazują przewodnictwo elektryczne



wykazują bardzo dużą pojemność buforową



nie są toksyczne dla białek



nie wykazują absorpcji przy λ=280 nm



można je łatwo oddzielić od preparatu białka



Opiera się na zjawisku precypitacji kompleksów
antygen

– przeciwciało i pozwala na detekcję

obecności antygenu oraz określenie ilości
antygenu w próbce



Jedną z jej odmian jest

elektroforeza rakietkowa



Prowadzona

jest

w

nośniku

wysyconym

przeciwciałem w warunkach pH= pI przeciwciała



W kierunku od katody do anody elektroforetycznie
migruje

próbka zawierająca antygen



W miejscu kontaktu antygen

– przeciwciało dochodzi

do precypitacji

kompleksów – widocznych jako

charakterystyczne linie o

kształcie startującej

rakiety

Jeśli całkowita ilość alergenów głównych jest znana wówczas

na drodze

porównania wysokości względnych rakietek

możliwe jest półilościowe zmierzenie zawartości jednego lub

większej ilości alergenów głównych



Metoda

służąca

do wykrywania

określonych białek



Rozdziela zdenaturowane

białka według ich mas

oraz natywne

według ich struktury 3D



Następnie białka są przenoszone na membranę
nitrocelulozową (lub PVDF)



Obecność określonych białek jest sprawdzana za
pomocą barwników lub przeciwciał przyłączających
się do ich epitopów.



Powstają

w wyniku modyfikacji chemicznej alergenu

, w

której znaczna część epitopów wiążących przeciwciała nie jest
już rozpoznawana



Uzyskuje się je w wyniku np. polimeryzowania alergenu pod

wpływem formaldehydu, aldehydu glutarowego, formaliny lub
ciepła jako czynnika fizycznego

ALERGOIDY

Alergoidy wysokomolekularne

M

cz

> 100 kDa

Alergoidy niskocząsteczkowe

M

cz

~ 30 kDa



Alergoidy

słabo reagują z przeciwciałami IgE i nie indukują

reakcji IgE

zależnych



Jest natomiast zachowana

immunogenność preparatu



Wykazano korzystne zmiany w wytwarzaniu cytokin (IL-10 i
IFN-

γ) przez limfocyty Th w trakcie immunoterapii alergoidem

Zmniejszona reaktywność alergenowa tych szczepionek

wpływa na:



skuteczność i bezpieczeństwo jej stosowania



szybkość osiągania maksymalnej dawki



komfort i dobrą współpracę lekarza z pacjentem

Wadą natomiast jest to, iż:



alergoidy nie mogą być prezentowane przez większość

komórek prezentujących antygen,



proces ich produkcji może doprowadzić do usunięcia

epitopów dla limfocytów T, co skutkuje zmniejszoną
aktywnością immunologiczną

Są syntetyzowane przez obcy organizm,

wykorzystujący wprowadzoną zewnątrz

informacją genetyczną

1.

Z

materiału macierzystego alergenu izoluje się

kodujące go fragmenty DNA lub RNA

2.

Tak przygotowany gen wprowadza

się do komórki

np. bakterii,

drożdży, owadów, ssaków za pomocą

plazmidów, bakteriofagów

Metoda ta pozwala na uzyskiwanie

nieograniczonej

ilości czystej substancji.

Można

w

ten

sposób

uzyskiwać

potrzebne

przeciwciała, alergeny, cytokiny, hormony

Zastosowanie

alergenów rekombinowanych i ich

pochodnych pozwala:



Wyeliminować białka niealergenowe



Zmniejszyć ryzyko wprowadzenia alergenów z innych źródeł



Zmniejszyć ryzyko wprowadzenia materiału infekcyjnego z
materiału wyjściowego do ekstrakcji



Zapewnić wiarygodną standaryzację szczepionek



Zwiększyć bezpieczeństwo leczenia odczulającego

Metodami służącymi w tworzeniu zrekombinowanych

mogą być:



metoda

służąca do oddzielenia dzikich alergenów od

innych

fragmentów wyciągu

a

następnie użycie tych

fragmentów

jako

indywidualnych

cząstek

modyfikujących odpowiedź immunologiczną albo
wykorzystywanie ich do fuzji w celu generowania
nowej

molekuły



Ukierunkowana mutageneza

prowadząca do

sztucznego

wywołania

mutacji

w

ściśle

określonym miejscu genomu

Adiuwant ma za zadanie

wzmacniać proces

immunizacji a

jednocześnie być

bezpieczny.

Jego zadanie polega na:



Prezentacji antygenu, co prowadzi do wzrostu

ilości

przeciwciał blokujących, wzrostu syntezy IL-1, IL-4, IL-
10,

IL-12,

INF-

γ,

TNF-

α,

GM-CSF,

hamowanie

aktywności limfocytów Th2 i eozynofilów



Przyczynić się stworzenia antygenu o przedłużonym
działaniu w miejscu szczepienia i powolnym jego
uwalnianiu



Działaniu nośnikowemu



Działaniu immunostymulującemu



Działaniu modulującemu przez stymulację subpopulacji
Th1

Obecnie w charakterze adiuwantów wykorzystywane są:



Monofosforylowany lipid A (MPL-A)



IL-12



IL-18



Immunostymulujące oligosacharydy z niemetylowanymi CpG



zabite poprzez ogrzewanie bakterie Listeria monocytogenes



Zabite poprzez ogrzewanie bakterie Lactobacillus platnarum

Jednak najczęściej stosowane są:



Sole glinu



L-tyrozyna



Sole wapnia