Hodowla drobnoustrojó w warunkach laboratoryjnych

ODOWLA DROBNOUSTROJÓW W WARUNKACH

LABORATORYJNYCH

OŻYWKI

Badanie i obserwacja drobnoustrojów w warunkach sztucznych,

laboratoryjnych, jest możliwa dzięki hodowli mikroorganizmów na pożywkach,

zwanych inaczej podłożami.

Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyosobnienie

czystych kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych,

biochemicznych, diagnostycznych oraz wszelkiego rodzaju hodowli

doświadczalnych.

Pożywka jest mieszaniną roztworów odpowiednio dobranych składników.

Pożywka powinna spełniać następujące warunki:

- zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych,

zarówno organicznych, jak i nieorganicznych (energetycznych

i budulcowych),

- zawierać określone czynniki wzrostowe,

- mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,

- zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu,

- wykazywać właściwą temperaturę i pH.

Nie ma uniwersalnej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów.

Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki

mineralne. Heterotrofy mają już większe wymagania, które można zaspokoić

dodając kompleksowe substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrkt

drożdżowy, brzeczkę.

Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie

odwodnionej lub proszku o wystandaryzowanym składzie – zapewnia to

powtarzalność warunków hodowli, a co za tym idzie pozwala na

porównywanie wyników doświadczeń prowadzonych w różnym czasie lub

różnych laboratoriach. Ponadto znacznie skraca czas przygotowania do

doświadczeń. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga stosowania

składników i związków chemicznych o najwyższym stopniu czystości.

KŁADNIKI POŻYWEK

1. S

UBSTANCJE ODŻYWCZE

Źródło węgla

Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów są cukry

(gł. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki

może służyć celom diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek

mikroorganizmów wykorzystuje określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w

pożywce waha się w ilości 0,5 do 2%.

Oprócz cukrów drobnoustroje mogą też wykorzystywać glicerol i mannitol

oraz niektóre kwasy organiczne.

Źródło azotu

Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych

(sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany). Jon amonowy stanowi

podstawowy związek w przemianach azotowych. Niektóre drobnoustroje mogą

pobierać wolny azot atmosferyczny. Poza tym, drobnoustroje czerpią azot

również ze związków organicznych, niekiedy bardzo skomplikowanych.

Należy tu wymienić przede wszystkim ekstrakty (wyciągi) z tkanek roślinnych i

zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych.

Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparaty handlowe, w postaci

proszków lub past. Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%.

Do źródeł azotu zaliczamy:

Ekstrakty mięsne – wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty

z serc i wątroby; zawierają one substancje azotowe oraz węglowodany

i witaminy rozpuszczalne w wodzie;

Ekstrakty drożdżowe – obok związków azotu i węgla organicznego są

bogatym źródłem witamin z grupy B;

Peptony – to specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy

białka, są głównym źródeł azotu organicznego w pożywce; zawierają

liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne

witaminy, czasami węglowodany;

Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, jaj,

nasion soi – bogate źródło aminokwasów, jedno z najczęściej

wykorzystywanych źródeł azotu organicznego w pożywce;

Czyste białka (żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja,

surowicy krwi) – opcjonalne źródło azotu wykorzystywane przez bakterie

proteolityczne;

Wolne aminokwasy – czasami dodawane do podłoża.

Sole mineralne

Dodawane do pozywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników

nieorganicznych: fosforu, siarki, potasu, sodu, magnezu, manganu, żelaza, i in.

Drobnoustroje pobierają je w postaci odpowiednich soli, najczęściej KH

HPO

, Na

HPO, NaH

PO, NaCl, siarczany i chlorki żelaza, magnezu.

Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne, np. NaCl, dodawane w

ilościach 3-5 g/l pożywki. Inne, np. fosforany potasu, działają buforująco

i utrzymują właściwy odczyn pożywki.

Czynniki wzrostowe

Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin

(kosztowne) lub w formie wspomnianych wyżej wyciągów mięsnego,

wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów roślinnych (sok pomidorowy,

brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub ziemniaczany).

Związki korygujące pH

Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4).

Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne (pH 5-6,0). Korektę pH pożywek

przeprowadza się najczęściej za pomocą 1-5M roztworów NaOH i HCl.

Substancje różnicujące i wybiórcze

Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem

mikroorganizmów modyfikacji lub rozkładowi, co uwidacznia się zmianie

barwy kolonii lub podłoża, lub powstaniu strefy przejaśnienia.

Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki np. zieleń

brylantowa, fiolet krystaliczny, związki chemiczne np. azydek sodu) hamują

rozwój pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie

drobnoustrojów.

2. C

ZYNNIKI ZESTALAJĄCE

Pozwalają one na uzyskanie pożywek w formie stałej.

Agar-agar

Jest to w dostępny handlowo w formie proszku lub włókiem, wielocukier

otrzymywany z glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi,

silnie chłonie wodę i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w

temperaturze 90-100ºC, a zestala w 45-48ºC. Chemicznie agar jest

polisacharydem – galaktonem (zawiera m.in. galaktozę), który nie jest

wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik odżywczy, a tylko przez

niektóre drobnoustroje może być rozkładany. W celu zestalenia podłoża

wystarczy 1,5-3% agaru.

Żelatyna

Jest to substancja białkowa, która powstaje w wyniku hydrolizy kolagenu,

może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne,

następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy przechowywać płytek z

takimi hodowlami do góry dnem. Żelatyna upłynnia się w temperaturze 25-

27ºC, a zestala w 18-20ºC, przy czym ogrzewana kilkukrotnie do 100ºC traci

własności żelujące. Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-

15%.

Inne czynniki zestalające są stosowane rzadko, należą tu m.in. żel

krzemionkowy (do pożywek mineralnych dla autotrofów), jaja i surowica

krwi (w badaniach specjalnych).

ODZAJE POŻYWEK

Kryteria podziału pożywek:

A) skład chemiczny i pochodzenie składników,

B) zawartość składników,

C) cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża),

D) konsystencja.

1. Podział w zależności od składu podłoża:

Naturalne – przygotowane wprost z surowca roślinnego lub zwierzęcego, w

sposób zapewniający jego jałowość, np. mleko, serwatka, mięso, bulion,

brzeczka, owoce i warzywa itp.

Syntetyczne – wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych, o

znanym składzie jakościowym i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla

autotrofów.

Półsyntetyczne – to podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek

roślinnych lub zwierzęcych, np. mleko z lakmusem, agar ziemniaczany z

tiaminą.

2. Ze względu na zawartość składników rozróżnia się podłoża:

- podstawowe (zwykłe) – stanowią bazę do przygotowania innych

pożywek, np. bulion zwykły, brzeczka

- wzbogacone – to podłoża podstawowe wzbogacone dodatkowymi

składnikami odżywczymi np. bulion odżywczy, bulion tryptofanowy, agar

z krwią itp. Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości

drobnoustrojów.

3. Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy je na:

- namnażające lub namnażająco-wybiórcze – stosujemy wówczas, gdy

liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany

drobnoustrój występuje z inną mikroflorą towarzyszącą. Są to zwykle

podłoża płynne, np. zbufirowana woda peptonowa dla pałeczek

Salmonella, pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek z typu Coli.

- selektywne – zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników

odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez

wpływu na pożądane.

- różnicujące – zawierają składniki wpływające na rodzaj wzrostu lub

wywoływać taką zmianę, która pozwala na zróżnicowanie pomiędzy

poszczególnymi grupami (typami) bakterii, częśto pełnią rolę podłóż

wybiórczych i wzbogaconych. Są to podłoża stałe, np. agar z krwią, agar

SS, Endo.

- testowe – służą do oznaczania witamin, aminokwasów i antybiotyków

przy pomocy mikroorganizmów; zwykle mają bardzo złożony

i specyficzny skład, a testowany czynnik nie występuje w podłożu co jest

podstawą oznaczenia

- identyfikacyjne (diagnostyczne) – na nie przesiewa się kolonie

drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację

wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju czy

określonej grupy, na podstawie określonych reakcji biochemicznych

zachodzących pod wpływem danego mikroorganizmu. Na przykład I

szereg identyfikacyjny dla drobnoustrojów z rodzaju Salmonella jest

następujący:

a) woda peptonowa z tryptofanem

b) podłoże z mocznikiem

c) podłoże Kliglera

d) podłoże z 10% laktozą.

4. Podłoża pod względem konsystencji dzielimy na:

Płynne – powinny być klarowne, a więc składniki muszą być całkowicie

rozpuszczone, np. brzeczka, bulion płynny

Półpłynne – z dodatkiem 0,1-0,8% agaru

Stałe – zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci

jednolitej, gładkiej warstwy bądź też w postaci słupka lub skosu w probówce

5. Przykłady pożywek stosowanych w mikrobiologii:

Pożywki ogólnego zastosowania

•

bulion zwykły i odżywczy,

•

bulion z agarem

•

brzeczka słodowa

•

agar zwykły i odżywczy,

•

żelatyna

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:

•

podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)

•

podłoża dla pałeczek z grupy Coli (z żółcią i zielenią brylantową,

Kesslera-Swenartona, Endo)

•

podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)

•

podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży:

•

brzeczka agarowa

•

pożywka Czapka – Doxa

•

podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.

RZYGOTOWYWANIE POŻYWEK

Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody

destylowanej poszczególne składniki zgodnie z podaną recepturą, następnie

ogrzewa na gazie do momentu uzyskania klarowności płynu i koryguje pH

(jeżeli jest różne od oczekiwanego).

W zależności od rodzaju pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji

wyjaławia się rozpuszczoną pożywkę w aparacie Kocha lub w autoklawie w

określonym czasie. Po sterylizacji i ostygnięciu pożywki należy również

sprawdzić i ewentualnie skorygować pH za pomocą roztworów NaOH lub HCl.

Dodatek witamin (jeśli potrzebne) oraz przesączenie pożywki wykonuje

się po jej ostudzeniu.

Ostudzoną (nie za bardzo!) pożywkę o odpowiednim składzie rozlewa się

ją do naczyń hodowlanych w zależności od potrzeb, do jakich ma służyć

przygotowane podłoże. Jeżeli potrzebujemy podłoża stałe to możemy je rozlać

na płytki Petriego lub do probówek, gdzie zestala się je w formie skosu lub

słupka (rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej od 45

C, gdyż

nie będzie się równo zestalało). Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub

kolbek.

HARAKTERYSTYKA WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

NA POŻYWKACH

Obserwacja wzrostu drobnoustrojów na pożywkach należy do ważnych

informacji diagnostycznych przy identyfikacji drobnoustrojów. W zależności od

rodzaju podłoża w diagnostyce uwzględnia się różne cechy.

Cechy diagnostyczne wzrostu mikroorganizmów na różnych podłożach

Bulion płynny

Płytka Petriego

Występowanie błonki

Charakter błonki

Zmętnienie lub osad

Charakter zmętnienia

Stopień zmętnienia

Charakter osadu

Zapach

Wymiary kolonii

Kształt kolonii

Brzeg kolonii

Powierzchnia kolonii

Konsystencja

Barwa kolonii lub podłoża

Wyniosłość - profil

Skośny agar

Słupek żelatynowy

Intensywność wzrostu

Charakter brzegu linii wzrostu

Konsystencja

Barwa

Powierzchniowy

Wzdłuż linii kłucia

W dolnej części słupka

Upłynnienie żelatyny

ZROST I CHARAKTERYSTYKA DROBNOUSTROJÓW W POŻYWKACH PŁYNNYCH

Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenie

zapotrzebowania bakterii na tlen.

Bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci

pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek. W zależności od

gatunku bakterii kożuch może być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany,

jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach;

Względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się

jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki;

Bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po

wstrząśnięciu osad unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty

lub ziarnisty;

Mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu

od powierzchni pożywki.

YMIENIONE TYPY WZROSTU NA PODŁOŻACH PŁYNNYCH MOŻNA

OBSERWOWAĆ W RÓŻNYCH KOMBINACJACH

ZMĘTNIENIE I OSAD

ZMĘTNIENIE I KOŻUSZEK

Wzrost bakterii w hodowlach płynnych:

a) wzrost na powierzchni w postaci pierścienia,

b) wzrost dyfuzyjny,

c) częściowe zmętnienie i osad,

d) wzrost podpowierzchniowy.

ZROST I CHARAKTERYSTYKA MIKROORGANIZMÓW NA PODŁOŻACH STAŁYCH

Ma zastosowanie w diagnostyce, przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w

analizach ilościowych.

Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego

Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z

jednej komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie

charakteryzują się stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce.

Obserwacje koloni przeprowadza się przy pomocy lupy lub binokularu

biorąc pod uwagę:

o wielkość (∅ w milimetrach) oraz kształt koloni, np. okrągły,

nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty. Niektóre bakterie mogą nie

tworzyć pojedynczych kolonii, lecz zarastać całe podłoże, dając wzrost

mgławicowy, rozlany (Proteus), inne tworzą kolonie rozpełzające się po

powierzchni podłoża (Bacillus).

o brzeg koloni: gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty

regularny lub nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny,

nitkowaty:

o powierzchnia koloni: gładka i pomarszczona; może być lśniąca lub

matowa:

o barwa koloni i jej przejrzystość: przeźroczysta, mętna, opalizująca,

nieprzeźroczysta oraz zdolność do wytwarzania pigmentu zabarwiającego

otoczenie koloni: zabarwione, niezabarwione.

Na przykład Sarcina lutea i Pseudomonas herbicola – tworzą kolonie

żółte, Staphylococcus aureus – pomarańczowo-złote; Serratia marcescens

– krwisto-czerwone; Azotobacter – ciemno brązowe, Pseudomonas

fluorescens – seledynowe fluoryzujące. Ponadto wytwarzane przez

pseudomonady barwniki dyfundują do podłoża zmieniając kolor na

zielonkawy, niebieskawy, fioletowy, niekiedy fluoryzujący;

o konsystencja: struktura: zwarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna;

o profil koloni ponad powierzchnię pożywki: płaski; wyniosły;

soczewkowaty niski, soczewkowaty wysoki; pępkowaty.

Z praktycznego punktu widzenia rozróżnia się następujące typy kolonii

powierzchniowych:

•

„S” (smooth – gładki) – o gładkim brzegu, powierzchni wypukłej bez

wzniesień i wgłębień. Jest to cecha charakterystyczna dla kolonii młodych i

prowadzonych na agarze odżywczym, a także zjadliwych form bakterii

chorobotwórczych,

•

„R” (rought – szorstki) – o brzegu nierównym, płatowatym lub nitkowatym i

szorstkiej powierzchni. Bakterie tworzące takie kolonie układają się w długie

nici lub łańcuszki. Kolonie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii, chociaż

te same bakterie wytwarzające kolonie gładkie, są chorobotwórcze

•

„G” (gonidial – gonidialny) – kolonie bardzo drobne o średnicy 1 mm

tworzone przez drobne bakterie

•

„M” (mucoid – śluzowaty) – kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej,

błyszczącej, wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczką

•

„L” (L-formy) – powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach

środowiskowych. Kolonia taka składa się z komórek bardzo drobnych –

przesączalnych, poprzez formy ziarniste i pałeczkowate, do form olbrzymich

o średnicy dochodzącej do 10 µm.

Nieco odmienne kolonie wytwarzają promieniowce – Actinomycetales,

które będąc bakteriami morfologicznie przypominają grzyby strzępkowe. Na

podłożach stałych tworzą grzybnię zbudowaną ze strzępek, tzw.

pseudomycelium, które może ulegać fragmentacji. U niektórych

promieniowców końce pseudomycelium przekształcają się w konidia

powietrzne, które są formami przetrwalnymi.

Grzyby – Fungi, których plecha ma budowę nitkowatą, złożona z mniej

lub bardziej rozgałęzionych, jedno- (komórczak) lub wielokomórkowych, jedno-

lub wielojądrowych strzępek. Wytwarzają grzybnię dwóch rodzajów:

grzybnię wrastającą w podłoże i służącą do pobierania pokarmu;

o puszystą, zwartą lub luźną grzybnię powietrzną, zbudowaną ze strzępek z

różnymi formami owocowania, na ogół wegetatywnego. Początkowo jest

ona bezbarwna lub biała. W miarę wzrostu i w zależności od

wytwarzanego barwnika (koloru zarodników konidialnych) kolonia

przybiera różną barwę;

Drożdże – rosnąc na powierzchni podłoży stałych tworzą pojedyncze

kolonie, które można sklasyfikować tak jak u bakterii (S – gładkie; R-

pomarszczone; M- śluzowate) bądź tworzą jednolity nalot. Powierzchnia koloni

może być gładka, gładka z wyniesieniem na środku, pomarszczona, lśniąca lub

matowa. Wewnątrz podłoża tworzą charakterystyczne kolonie o kształcie

soczewkowatym. W podłożach płynnych drożdże rosnąc tworzą na powierzchni

błonkę lub na dnie osad.

ZROST I CHARAKTERYSTYKA HODOWLI NA SKOSIE AGAROWYM

Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych

koloni, jednak sposób wzrostu jest również ważną cechą diagnostyczną. Wzrost

bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy:

o charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu komórek);

perlisty (tworzą się oddzielne, niezlewające ze sobą kolonie) o brzegach

gładkich, ząbkowanych, kolczastych, ziarnistych; krzewiasty,

nieregularny, itp.;

o powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka;

o struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana;

o barwa i przeźroczystość.

Typy wzrostu bakterii w hodowlach rysowych:

1 – drzewiasty
2 – mgławicowy
3 – pierzasty
4 – korzonkowy
5 – perlisty
6 – jednolity

Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej opisujemy

uwzględniając następujące cechy:

o ruchliwość

o upłynnianie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także

charakter upłynnienia wzdłuż nakłucia.

Wzrost bakterii na żelatynie kłutej.(2)

1 – brak upłynnienia
2 – upłynnienie kraterowate
3 – upłynnienie workowate
4 – upłynnienie lejkowate
5 – upłynnienie walcowate
6 – upłynnienie kielichowate