W.Duszkiewicz-Reinhard, R.Grzybowski, E.Sobczak „Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej.”

A.Różalski „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej.”

A.A.Slayers, D.D.Whitt „Mikrobiologia” (Różnorodność, chorobotwórczość i środowisko).

W.J.H.Kunicki-Goldfinger „Życie bakterii.”

Hodowla drobnoustrojów

1.Podział drobnoustrojów ze względu na stosunek do tlenu:

-tlenowce- wyrastają tylko w obecności tlenu, np. Bacillus, Pseudomonas

-beztlenowce- (bezwzględne beztlenowce) są niezdolne do wzrostu w obecności tlenu, np. Clostridium sp., Bacteroides sp. / Saccharomyces cerevisiae beztlenowiec- osad na dnie probówki przez agregaty komórek,

-mikroaerofile- to grupa pośrednia-względnie beztlenowe (niska zawartość tlenu cząsteczkowego), np. E. coli, Staphylococcus aureus (wzrost dyfuzyjny + wzrost na ściankach ponad pożywką).

2.Typy wzrostu kolonii na podłożach płynnych:

Podłoża płynne to np. bulion, brzeczka:

-osad na dnie probówki, kolbki- Clostridium botulinum (laseczka jadu kiełbasianego), zwracamy uwagę na ilość i rodzaj osadu (ziarnisty, pylisty, błonkowaty, opalizujący),

-zmętnienie podłoża oraz wzrost powierzchniowy- Staphylococcua aureus, E.coli- dyfuzyjny (pałeczka okrężnicy), opis intensywności (zmętnienie słabe, umiarkowane, silne, w całej objętości pożywki lub tylko przy dnie),

-wzrost powierzchniowy: błonka- Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej), kożuszek- Bacillus subtilis,

1. Typ dyfuzyjny (dyfuzja- ruch)/zmętnienie - E.coli (pałeczka okrężnicy).

2. Typ powierzchowny- tlenowce, tzw. błonka- cienka- Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej), nalot, kożuszek- gruby Bacillus subtilis (laseczka sienna).

3. Typ denny-osad na dnie- Clostridium, Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarnicze- komórki tworzą agregaty, są ciężkie i opadają na dno).

4. Typ mieszany-błonka + zmętnienie/osad Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty), Staphylococcus epidermidis (gronkowiec biały).

3.Morfologia kolonii bakteryjnych:

1. Wielkość kolonii (małe, duże, średnie, drobne, średnica w mm)

2. Typ wzrostu kolonii na podłożu (powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny)

3. Kształt kolonii (regularny, nieregularny, okrągła, okrągła z pomarszczonym brzegiem, okrągła z wałem brzeżnym, rozgałęziona, soczewkowata, nitkowata, strzępiasta, amebowata, korzonkowa ta, pofałdowana, nieregularna, koncentryczna, złożona)

4. Powierzchnia kolonii (matowa, z połyskiem, gładka, pomarszczona, pofałdowana, krzaczkowata)

5. Brzeg kolonii (gładki, falisty, ząbkowany, z wyżłobieniami, rozgałęziony, nitkowaty)

6. Wzniesienie kolonii (kolonia płaska, lekko wypukła, wzniesiona)

7. Przejrzystość kolonii (przejrzysta, półprzejrzysta, opalizująca, nieprzejrzysta, fluorescencja)

8. Barwa i zapach (rodzaj zabarwienia, czy barwnik dyfunduje z podłoża)

9. Struktura kolonii-konsystencja (sucha, krucha, ziarnista, skórzasta, ciągnąca się, mazista, śluzowata)

10. Fluorescencja (tak, nie)

4.Hodowla drobnoustrojów w warunkach tlenowych i beztlenowych:

Dla identyfikacji bakterii należy wyhodować ich szczepy. Różne bakterie hodowane są w różnych warunkach. Wiele drobnoustrojów wymaga atmosfery odmiennej niż skład powietrza. Neisseria meningitidis wymaga np. wzrostu w warunkach tlenowych, najlepiej jeżeli jest ono wzbogacone o CO₂.

Oddychanie tlenowe bakterii:

-układy oksydacyjno-redukcyjne

-łańcuch oddechowy

Oddychanie beztlenowe:

-redukcja azotanów

-redukcja siarczanów

-redukcja węglanów i CO₂

-redukcja związków żelazowych i manganowych

Hodowle tlenowców:

1. Hodowla powierzchniowa-duże powierzchnie podłóż stałych - aby posiadały swobodny dostęp do tlenu -duże płytki Petriego , butle roux, kolby Dernbacha. Drobnoustroje rosną w sposób zlewny- pokrywają całą powierzchnie podłoża. Można je zebrać z pożywki przez zmycie 0,85% NaCl.

2. Hodowla wgłębna- dla otrzymania większej ilości masy bakteryjnej, lub innych drobnoustrojów stosuje się hodowle płynne. Ilość tlenu w podłożu płynnym jest dość mała co może nie być korzystne zwłaszcza dla bezwzględnych tlenowców, aby zwiększyć stężenie tlenu, hodowle napowietrzamy ( aerujemy). Najprościej poprzez intensywne potrząsanie, mieszanie i wytrząsanie. Zwiększenie tego efektu osiągnąć możemy poprzez dodanie do mieszaniny szklanych kuleczek. Hodowle wytrząsane są w specjalnych boksach w wytrząsarkach stołowych, w określonej temperaturze. Innym sposobem napowietrzania hodowli płynnych jest wtłaczanie powietrza pod ciśnieniem z kompresora. Taką metodę stosuje się w hodowlach wielkolaboratoryjnych (na większą skalę), lub w hodowlach przemysłowych czy tez półprzemysłowych.

Hodowle beztlenowców:

1. Metody fizyczne- tzw. usunięcie powietrza z pożywki płynnej przez jej zagotowanie i szybkie schłodzenie, a następnie zalanie podłoża warstwą jałowego, płynnego oleju parafinowego. Innym sposobem jest hodowla w anaerostacie (słoju próżniowym- stoją po prawej stronie przy wejściu do sali, w szafce) w próżni lub w atmosferze gazu obojętnego (azot, argon, hel, wodór). Można również stosować stare metody hodowli- na podłożu płynnym z kawałkami wątroby lub mięśnia sercowego (Wrzoska z wątrobą), zalane parafiną oraz tzw. hodowle `kłute' na słupkach. Efektywna jest również metoda łączenia tlenu z wodorem w obecności katalizatora. Obecnie dostępnymi zestawami do tego typu działań są np. zestawy `Gas-Pak', z borowodorkiem sodu i dwuwęglanem sodowym. Odczynniki te umieszczamy w słoju próżniowym z niewielką ilością wody oraz z hodowlą. Borowodorek sodu reaguje z wodą i powstaje H₂ który reaguje z tlenem w obecności katalizatora- dla bezwzględnych beztlenowców. Efektywność tego procesu sprawdzana jest za pomocą wskaźnika z błękitem metylenowym, niebieski w środowisku tlenowym, bezbarwny po usunięciu tlenu. Jeżeli wskaźnik jest niebieski oznacza to iż środowisko jest tlenowe, jeżeli jest żółty- środowisko beztlenowe. Dwuwęglan sodowy CO_2, wskaźnik, powstaje C reaguje O₂ CO₂ + H₂O- reakcja dla drobnoustrojów wymagających niewielkich ilości CO₂, oraz O₂.

2. Metody chemiczne- w hodowlach beztlenowców stosujemy podłoża zawierające substancje chemiczne absorbujące tlen, np. pirogalol + podsiarczyn sodowy lub chlorek miedzowy, a także związki chemiczne obniżające potencjał oksydacyjno- redukcyjny, np. kwas askorbinowy+ tioglikan sodowy, cysteina, siarczyn sodowy. Przykładem jest podłoże VL z chlorowodorkiem cysteiny.

3. Metody biologiczne- w tej metodzie stosujemy hodowle na tym samym podłożu dwóch drobnoustrojów tlenowca- B.subtilis i beztlenowca Clostridium sporogenes. Bakterie posiewane są na dwie oddzielone od siebie połówki płytki agarowej Fortnera z bulionem cukrowym + 3% krwi owcy. Płytkę oklejamy plasteliną lub plastrem i inkubujemy. Najpierw korzystając z obecności tlenu w środowisku wyrasta tlenowiec, potem bez tlenu następuje chwila kiedy środowisko jest beztlenowe korzystne dla beztlenowca.

5.Metody posiewu drobnoustrojów na podłożach płynnych, stałych, posiew redukowany. 7.Hodowle statyczne, ciągłe i napowietrzane, oraz synchronizowane. 8.Fazy wzrostu hodowli statycznej:

Ze względu na rodzaj podłoża na jakim namnażamy drobnoustroje hodowle dzielimy na:

-płynne-zależnie od ilości podłoża prowadzimy je w probówkach, kolbach, butlach lub fermentorach.

-stałe-wykonywane są na płytkach Petriego, słupkach, skosach, w butlach (roux, legroux) zawierających podłoże zestalone agarem, żelatyną lub krzemionką.

Najczęściej stosujemy hodowle okresowe- na podłożach z których drobnoustroje całkowicie wykorzystują składniki pokarmowe, lub zatruwają się związkami z własnej przemiany materii. Są to tzw. hodowle statyczne- zamknięte, fazowe-nie doprowadza się do nich związków pokarmowych, nie odprowadza się namnożonej masy drobnoustrojów, ani produktów przemiany materii. Taką hodowlę możemy scharakteryzować poprzez: stałą szybkość podziałów drobnoustrojów (v), wiek osobniczy (czas generacji- g), oraz swoistą szybkość wzrostu (μ). Wartość v to ilość podziałów (liczba pokoleń) drobnoustrojów w jednostce czasu (godzinach).Wiek osobniczy g oznacza czas jaki upływa pomiędzy kolejnymi podziałami ich komórek (E.coli g=20 minut). Swoista szybkość wzrostu to (μ) to przyrost masy drobnoustrojów w fazie logarytmicznego wzrostu w danej hodowli w przeliczeniu na jednostkę czasu i jednostkę powstałej masy komórkowej. Fazy hodowli statycznej:

1. Faza adaptacyjna (zastoju, przygotowawcza) trwa od momentu wprowadzenia drobnoustrojów do podłoża do czasu rozpoczęcia podziałów zależy od rodzaju drobnoustroju, podłoża i fazy wzrostu hodowli. Pod koniec tej fazy drobnoustroje wykazują szybszy metabolizm, zwiększają wymiary komórek, ale nie dzielą się- nazywa się to okresem młodości fizjologicznej . Nie ma ona wpływu na dalsze fazy wzrostu.

2. Faza logarytmicznego wzrostu- najintensywniejsze podziały komórek i stałym przyrost ich liczby w jednostce czasu, nie zmienia się wiek osobniczy, i częstość podziałów. Jej długość zależy od szeregu czynników: ilości substancji odżywczych, nagromadzenia toksyn, pH, ilości tlenu, temperatury, gatunku drobnoustroju, sposobu prowadzenia hodowli, intensywności aeracji.

3. Faza zwolnionego wzrostu- częstość podziałów maleje, pojawiają się pojedyncze martwe komórki.

4. Faza równowagi- (stacjonarna) ustala się tu równowaga pomiędzy liczba drobnoustrojów żywych i martwych, a liczba komórek w hodowli pozostaje stała.

5. Faza zwolnionego zamierania- liczba żywych komórek zmniejsza się , wzrasta natomiast liczba komórek martwych. Pojawiają się formy inwolucyjne- komórki o zmienionych kształtach.

6. Faza logarytmicznego zamierania (śmierci logarytmicznej)- ostatnia faza. Szybkie obumieranie drobnoustrojów i spadek ich liczby jednostce czasu jest stały. Okres trwania tej fazy zależy od wrażliwości drobnoustrojów na toksyny nagromadzone w dużej ilości. Hodowle drobnoustrojów wrażliwych na trujące związki mogą nawet doprowadzić do samo wyjałowienia.

Pełen przebieg hodowli determinują parametry krzywej wzrostu:

-całkowity przyrost drobnoustrojów (różnica pomiędzy ich masą w szczytowym punkcie hodowli a materiałem wprowadzonym do hodowli), wartość μ, czas trwania log- fazy przygotowawczej, poprzedzającej podziały. Całkowity przyrost biomasy to plon. Największy przyrost występuje w fazie logarytmicznego wzrostu, jej plon stwierdza się w fazie stacjonarnej (zbiór wszystkich komórek z każdej fazy). Czynnikami ograniczającymi wzrost drobnoustrojów są wyczerpanie składników odżywczych (C, N, P), nagromadzenie toksyn, zmiana równowagi jonowej, zmiana pH.

Hodowle ciągłe- polegają na stałym wprowadzaniu do hodowli określonych ilości nowej pożywki i odprowadzaniu takiej samej ilości pożywki zużytej. Metoda ta pozwala na ciągły rozwój drobnoustrojów. Można tu kontrolować także przyrost liczby, masy drobnoustrojów. Hodowle tego typu utrzymuje się w określonej fazie wzrostu. Warunkiem utrzymania równowagi jest ciągłe kontrolowanie szybkości rozcieńczania hodowli (D). D musi = μ. D to stosunek szybkości dopływu podłoża do hodowli w określonym czasie f do objętości naczynia v. D=f/v. Podczas hodowli nie jest możliwe sprawdzenie wszystkich jej parametrów, np. zużycia C, N, O, liczby drobnoustrojów, przyrostu metabolitów. Wybieramy jeden z nich. Hodowle w których kontrolujemy zużycie C,N,O prowadzimy w chemostatach, a w turbidostatach badamy gęstość optyczna hodowli (liczbę w środowisku wzrostu). Mają kształt linii ciągłej.

Hodowle synchronizowane- są to hodowle w których wszystkie osobniki dzielą się w tym samym czasie . Stan taki osiąga się dzięki selekcji osobników (poprzez wirowanie, sączenie), przez zahamowanie wzrostu drobnoustrojów-czasowe usunięcie czynnika wzrostowego.

Hodowla napowietrzana-to taka podczas której dostarcza się drobnoustrojom tlen poprzez np. wytrząsanie- aerowanie.

Metody posiewu na podłożach płynnych, stałych, posiew redukowany:

W celu prowadzenia badań (wyizolowania konkretnego gatunku, utrzymania aktywności i żywotności kultur) stosuje się przeszczepianie drobnoustrojów ze środowiska naturalnego na sztucznie stworzone pożywki. Są to posiewy. Podstawą jest tu nie dopuszczenie do zakażenia materiału posiewanego oraz podłoża poprzez

Odpowiednia technika posiewu, przestrzeganie zasad postępowania zabezpiecza materiał przed zakażeniem.

Zasady wykonywania posiewów:

1. Pomieszczenie wyjałowić lampą kwarcową, stoły przetrzeć alkoholem skażonym.

2. Posiewy wykonywać przy palącym palniku gazowym.

3. Posługiwać się jałowym szkłem, przyrządami, jałowymi pożywkami

4. Opalać wloty probówek i naczyń, pipet, głaszczek, wyżarzać ezę.

6.Metody otrzymywania czystych kultur:

1. Bezpośrednie

2. Pośrednie

Hodowla-kultura to zespół osobników żyjących w tym samym środowisku. Osobniki wyrosłe na jednym podłożu. Wyróżnić możemy hodowle czyste i mieszane. Hodowla czysta (osobniki takie same fenotypowo) to grupa osobników tego samego gatunku, a mieszana-różnych gatunków (wstępne etapy klinicznej diagnostyki laboratoryjnej, po posianiu materiału od pacjenta na pożywce wyrastają różne drobnoustroje). Potem zastosować należy technikę czystych kultur. Również w środowisku naturalnym bakterie rosną w hodowlach mieszanych, stąd izolujemy je na podłożach namnażająco wybiórczych. Czyste Kultury to otrzymywanie kolonii powstałych z pojedynczych komórek drobnoustrojów. Badania diagnostyczne, fizjologiczne i morfologiczne drobnoustrojów można otrzymać wyłącznie z czystych kultur.

Metody:

Pośrednie:

1. Seryjnych rozcieńczeń- takie rozcieńczenie aby w 1 cm³ ostatniego rozcieńczenia otrzymać nie więcej niż jedną komórkę. Jeżeli na pożywki przeniesie się po 1 cm³ tego rozcieńczenia i będzie hodować w odpowiedniej temperaturze to w niektórych pojawi się wzrost, pochodzący z namnożenia jednej komórki. Czystość takiej hodowli sprawdzamy pod mikroskopem. (nie ma praktycznego zastosowania, brak pewności co do ilości komórek posianych).

2. Posiew wgłębny/płytki lane -pośrednia- metoda płytek lanych polega na serii rozcieńczeń (1:10, 1:100, 1:1000) materiału w ochłodzonej i rozpuszczonej pożywce a następnie wylania na płytki Petriego i wstawienia do termostatu. Liczba wyrosłych kolonii maleje w miarę rozcieńczania materiału. Kolonie występujące tu to- wgłębne, denne i powierzchniowe. Inkubację przeprowadza się tu przez 24h.

3. Metoda wysiewu powierzchniowego/płytki mazane - polega na wykonaniu serii rozcieńczeń próby w wodzie jałowej, lub w płynie fizjologicznym. Z każdego rozcieńczenia pobiera się pipetą 0,5 cm³ materiału a następnie wysiewa na pożywkę i rozprowadza głaszczką. Na płytkach szczepionych próbami z małych rozcieńczeń występuje nalot, natomiast przy dużych rozcieńczeniach mamy do czynienia z wzrostem pojedynczych kolonii.

4. Metoda tuszowa- kroplę tuszu chińskiego rozcieńczona wodą 1:10 miesza się z kroplą rozcieńczonego materiału. Mikropipetą lub piórkiem umieszcza się krople na szkiełku przykrywkowym pokrytym cienką warstwą pożywki żelatynowej lub agarowej. Dalej tak jak w metodzie kropelkowej.

5. Posiew redukcyjny płytek agarowych- pobrać materiał ezą nanieść punktowo na pożywkę (podzielona na 4 części dermatografem), dotykamy ezą miejsca naniesienia i nanosimy dalej na wszystkie powierzchnie, dotykając uprzednio naniesionej próby z poprzedniej ćwiartki. Wyżarzać ezę! Metodę tą możemy nazwać czystą kulturą.

6. Metoda replik (płytek odciskowych- Lederberga)- stosowana w badaniach genetycznych do izolowania mieszaniny komórek o pożądanych właściwościach. Można dzięki niej odróżnić drobnoustroje fermentujące i niefermentujące laktozę, wrażliwe i oporne na antybiotyki, zdolne do wzrostu na podłożu bez witaminy (ten sam gatunek). W celu odróżnienia zawiesinę wysiewamy na płytkę agarową. Po wyrośnięciu kolonii przykładamy stempel pokryty welurem. Do materiału przylgną komórki z kolonii. Następnie ten sam stempel umieszczamy na powierzchni płytek:

-minimalnej bez witaminy- bakterie zdolne do wzrostu bez witaminy,

-z antybiotykiem-wzrost drobnoustrojów opornych,

-z podłożem z laktozą i wskaźnikiem-zdolne do rozkładania cukru. Fermentujące zmieniają barwę podłoża.

Porównując odciski na tych trzech płytkach z płytka wyjściową możemy zlokalizować kolonie o określonych właściwościach i ocenić je ilościowo.

Bezpośrednie:

1. Metoda z zastosowaniem mikromanipulatora- pobierać bezpośrednio pod mikroskopem jedną komórkę i przenieść ją na pożywkę. Możliwe jest to dzięki mikromanipulatorowi. Przenoszenie odbywa się za pomocą specjalnego układu mikropipet, śrub i igieł. Są to urządzenia wyposażone w kapilary szklane którymi zasysa się z zewnątrz np. z hodowli mieszanej 1 komórkę. Metody (Leitza, Emersena).

2. Metoda kropelkowa-(Lindnera)-bezpośrednia z odpowiednio rozcieńczonej płynnej pożywki pobiera się mikropipetą lub piórkiem kreślarskim jedna bądź kilka kropel materiału na jałowe szkiełka przykrywkowe. Szkiełka te ustawia się kroplą w dół na uszczelnionych wazeliną komorach Lindnera lub Bötchera. Aby preparat nie wysychał na dno komór daje się kroplę jałowej wody. Pod mikroskopem należy sprawdzić w której kropli jest jedna komórka i oznaczyć ją tuszem. Komory wstawić do termostatu. Po kilku dniach przeszczepić powstałe kolonie na świeżą pożywkę. Inkubacje przeprowadza się tu przez 24h.

Przechowywanie czystych kultur:

- na skosach lub pożywkach półpłynnych w lodówkach w temperaturze +4^o C aby zapobiec obumarciu lub zmianie cech fizjologicznych przechowywanych kultur, należy je przeszczepiać raz na 1-2 miesiące.

- w stanie zliofilizowanym

Liofilizacja to wysuszenie uprzednio zamrożonej kultury. Jest to sposób wygodny, pozwala na przechowywanie w temperaturze pokojowej, przez długi okres bez obawy o degeneracje komórek.

- w stanie zamrożonym z dodatkiem glicerolu.

1

---