Hodowla

drobnoustrojów

w warunkach

laboratoryjnych

Badanie i obserwacja

drobnoustrojów

w warunkach

sztucznych,

laboratoryjnych,

jest możliwa dzięki

hodowli

mikroorganizmów

na pożywkach, zwanych

inaczej podłożami

.

Wzrost i rozwój

drobnoustrojów

na pożywkach pozwala

na wyosobnienie

czystych kultur,

na prowadzenie badań

morfologicznych,

fizjologicznych,

biochemicznych,

diagnostycznych

oraz wszelkiego rodzaju

hodowli doświadczalnych.

Pożywka jest mieszaniną

roztworów odpowiednio

dobranych składników

- zapewniać odpowiednią ilość przyswajalnych

składników pokarmowych, zarówno organicznych,

jak i nieorganicznych (energetycznych i

budulcowych),
- zawierać określone czynniki wzrostowe,
- mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
- zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do

tlenu,
- wykazywać właściwą temperaturę i pH.

Pożywka powinna spełniać

następujące warunki:

Nie ma uniwersalnych pożywek

dla wszystkich drobnoustrojów

Jest to spowodowane występowaniem

zróżnicowanych wymagań pokarmowych.

Wyróżniamy:



Podłoża dla autotrofów - nieskomplikowane, zawierają

tylko związki mineralne.



Podłoża dla heterotrofów - które muszą spełniać
większe wymagania.

Składniki

pożywek

Źródło węgla

Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla

drobnoustrojów

są cukry (g . glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza).
Dodatek cukru do pożywki może służyć celom

diagnostycznym lub

wybiórczym, gdyż dany gatunek mikroorganizmów

wykorzystuje

określony rodzaj cukru.
Zawartość cukru w pożywce waha się w ilości 0,5 do 2%.
Oprócz cukrów drobnoustroje mogą też wykorzystywać

glicerol

i mannitol oraz niektóre kwasy organiczne.

Składniki

pożywek

Źródło azotu

Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń
nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany).
Jon amonowy stanowi podstawowy związek w przemianach
azotowych.
Niektóre drobnoustroje mogą pobierać wolny azot atmosferyczny.
Poza tym, drobnoustroje czerpią azot również ze związków
organicznych, niekiedy bardzo skomplikowanych.
Należy tu wymienić przede wszystkim ekstrakty (wyciągi) z tkanek
roślinnych i zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty białek
zwierzęcych i roślinnych.
Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparaty handlowe,
w postaci proszków lub past. Dodatek związków białkowych do
pożywek wynosi 0,5-2%.

Do źródeł azotu zaliczamy:

Ekstrakty mięsne – wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty z serc
i wątroby; zawierają one substancje azotowe oraz węglowodany i witaminy
rozpuszczalne w wodzie;
Ekstrakty drożdżowe – obok związków azotu i węgla organicznego są
bogatym źródłem witamin z grupy B;
Peptony – to specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka,
są głównym źródłem azotu organicznego w pożywce; zawierają liczne wolne
aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne witaminy, czasami
węglowodany;
Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, jaj, nasion

soi- bogate źródło aminokwasów, jedno z najczęściej wykorzystywanych

źródeł azotu organicznego w pożywce;

Czyste białka (żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja, surowicy
krwi) – opcjonalne źródło azotu wykorzystywane przez bakterie proteolityczne;
Wolne aminokwasy – czasami dodawane do podłoża.

Składniki

pożywek

Sole mineralne

Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem

składników

nieorganicznych: fosforu, siarki, potasu, sodu, magnezu, manganu,
żelaza i in.
Drobnoustroje pobierają je w postaci odpowiednich soli, najczęściej
KH

2

PO

4

, K

2

HPO

4

, Na

2

HPO, NaH

2

PO, NaCl, siarczany i chlorki

żelaza, magnezu.
Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne, np. NaCl,

dodawane

w ilościach 3-5 g/l pożywki. Inne, np. fosforany potasu, działają

buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki

.

Składniki pożywek

Czynniki wzrostowe

Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów

syntetycznych

witamin (kosztowne) lub w formie wspomnianych wyżej

wyciągów

mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów

roślinnych

(sok pomidorowy, brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub
ziemniaczany).

Składniki

pożywek

Związki korygujące

Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko
alkalicznym (6,8-7,4).
Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne (pH 5-6,0).
Korektę pH pożywek przeprowadza się najczęściej za pomocą

1-5M

roztworów NaOH i HCl.

Składniki

pożywek

Substancje różnicujące i wybiórcze

Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają
pod wpływem mikroorganizmów modyfikacji lub rozkładowi,
co uwidacznia się w zmianie barwy kolonii lub podłoża, lub
powstaniu strefy przejaśnienia. Czynniki wybiórcze (sole

kwasów

żółciowych, niektóre barwniki np. zieleń brylantowa, fiolet
krystaliczny, związki chemiczne np. azydek sodu) hamują

rozwój

pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej

grupie

drobnoustrojów.

Czynniki zestalające

Pozwalają na uzyskanie pożywek w formie

stałej.

Agar-agar

Jest to w dostępny handlowo w formie proszku lub włókien, wielocukier
otrzymywany z glonów morskich. Odznacza się właściwościami

żelującymi,

silnie chłonie wodę i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się
W temperaturze 90-100

0

C, a zestala w 45-48

0

C.

Chemicznie agar jest polisacharydem – galaktonem (zawiera m.in.

galaktozę),

który nie jest wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik

odżywczy,

a tylko przez niektóre drobnoustroje może by rozkładany.
W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru.

Czynniki zestalające

Żelatyna

Jest to substancja białkowa, która powstaje w wyniku hydrolizy
kolagenu,
może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy
proteolityczne, następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy
przechowywać płytek z takimi hodowlami do góry dnem).
Żelatyna upłynnia się w temperaturze 25-27

0

C, a zestala w 18-20

0

C,

przy czym ogrzewana kilkukrotnie do 100

0

C traci własności

żelujące.
Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%.

Czynniki zestalające

Inne czynniki zestalające są stosowane rzadko, należą tu
m.in.
żel krzemionkowy (do pożywek mineralnych dla
autotrofów),
jaja i surowica krwi (w badaniach specjalnych).

RODZAJE POŻYWEK

Kryteria podziału pożywek:
• skład chemiczny i pochodzenie składników,
• zawartość składników,
• cel hodowli (zastosowanie i funkcja

podłoża),

• konsystencja.

Podłoża w zależności od

składu



Naturalne – przygotowane wprost z surowca roślinnego

lub zwierzęcego, w sposób zapewniający jego

jałowość, np. mleko, serwatka, mięso, bulion,

brzeczka, owoce i warzywa itp.



Syntetyczne – wykonane z dokładnie określonych

związków chemicznych, o znanym składzie jakościowym

i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla

autotrofów.



Półsyntetyczne – to podłoża syntetyczne z dodatkiem

wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np.

mleko z lakmusem, agar ziemniaczany z tiaminą.

Podłoża ze względu

na zawartość składników



Podstawowe (zwykłe) – stosowane do hodowli

mikroorganizmów o niskich wymaganiach odżywczych

lub stanowią bazę do przygotowania innych pożywek,

np. bulion zwykły, brzeczka



Wzbogacone – to podłoża podstawowe wzbogacone

dodatkowymi składnikami odżywczymi np. bulion

odżywczy, bulion tryptofanowy, agar z krwią itp.

Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości

drobnoustrojów.

Podłoża zależnie od funkcji

jaką ma pełnić pożywka

(1)



Namnażające lub namnażająco-wybiórcze – stosujemy

wówczas, gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest

niewielka lub poszukiwany drobnoustrój występuje z inną

mikroflorą towarzyszącą. Są to zwykle podłoża płynne, np.

zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella,

pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek z typu Coli.



Selektywne – zawierają składniki wybiórcze (oprócz

składników odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów

przeszkadzających bez wpływu na pożądane.



Różnicujące – zawierają składniki wpływające na rodzaj

wzrostu lub wywoływujące taką zmianę, która pozwala na

zróżnicowanie pomiędzy poszczególnymi grupami (typami)

bakterii, często pełnią rolę podłóż wybiórczych i wzbogaconych.

Są to podłoża stałe, np. agar z krwią, agar, SS, Endo.



Testowe służą do oznaczania witamin, aminokwasów

i antybiotyków przy pomocy mikroorganizmów; zwykle mają bardzo

złożony i specyficzny skład, a testowany czynnik nie występuje

w podłożu co jest podstawą oznaczenia.



Identyfikacyjne (diagnostyczne) – na nie przesiewa się kolonie

drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację

wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju

czy określonej grupy, na podstawie określonych reakcji

biochemicznych zachodzących pod wpływem danego

mikroorganizmu. Na przykład I szereg identyfikacyjny dla

drobnoustrojów z rodzaju Salmonella jest następujący:

a) woda peptonowa z tryptofanem

b) podłoże z mocznikiem

c) podłoże Kliglera

d) podłoże z 10% laktozą.

Podłoża zależnie od funkcji

jaką ma pełnić pożywka (2)

Podłoża ze względu na

konsystencję



Płynne – powinny być klarowne, a więc składniki
muszą być całkowicie rozpuszczone, np. brzeczka,
bulion płynny



Półpłynne – z dodatkiem 0,1-0,8% agaru



Stałe – zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na
płytce Petriego w postaci jednolitej, gładkiej warstwy
bądź też w postaci słupka lub skosu w probówce

Podłoże z krwią. Gładkie kolonie Corynebacterium diptheriae

(gravis)

Przykłady pożywek

stosowanych w mikrobiologii

Pożywki ogólnego zastosowania:



bulion zwykły i odżywczy,



bulion z agarem,



brzeczka słodowa,



agar zwykły i odżywczy,



żelatyna

Pożywki wybiórcze stosowane do

hodowli bakterii:



podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska,

Wilsona-Blaira),



podłoża dla pałeczek z grupy Coli (z żółcią i

zielenią brylantową Kesslera-Swenartona, Endo),



podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem

sodu),



podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna

z mannitolem).

Przykłady pożywek stosowanych

w mikrobiologii

Przykłady pożywek stosowanych

w mikrobiologii

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli
grzybów pleśniowych i drożdży:



brzeczka agarowa



pożywka Czapka – Doxa



podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.

Zasady przygotowania

pożywek

Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do
Wody destylowanej poszczególne składniki zgodnie z podaną
recepturą, następnie ogrzewa na gazie do momentu
uzyskania klarowności płynu i koryguje pH (jeżeli jest różne
od oczekiwanego).
W zależności od rodzaju pożywki i wymaganych temperatur
sterylizacji wyjaławia się rozpuszczoną pożywkę w aparacie
Kocha lub w autoklawie w określonym czasie.
Po sterylizacji i ostygnięciu pożywki należy również sprawdzić

i ewentualnie skorygować pH za pomocą roztworów NaOH
lub HCl.

Dodatek witamin (jeśli potrzebne) oraz przesączenie

pożywki wykonuje się po jej ostudzeniu.

Ostudzoną (nie za bardzo!) pożywkę o odpowiednim

składzie rozlewa się do naczyń hodowlanych w

zależności od potrzeb, do jakich ma służyć

przygotowane podłoże. Jeżeli potrzebujemy podłoża

stałe to możemy je rozlać na płytki Petriego lub do

probówek, gdzie zestala się je w formie skosu lub słupka

(rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej

od 45

0

C gdyż nie będzie się równo zestalało).

Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub kolbek.

Zasady przygotowania
pożywek

Obserwacja wzrostu

drobnoustrojów

na pożywkach należy

do ważnych informacji

diagnostycznych

przy identyfikacji

drobnoustrojów.

W zależności od rodzaju

podłoża w diagnostyce

uwzględnia się różne cechy.

Cechy diagnostyczne wzrostu

mikroorganizmów na różnych

podłożach

Bulion płynny

Płytka Petriego



Występowanie błonki



Charakter błonki



Zmętnienie lub osad



Charakter zmętnienia



Stopień zmętnienia



Charakter osadu



Zapach



Wymiary kolonii



Kształt kolonii



Brzeg kolonii



Powierzchnia kolonii



Konsystencja



Barwa kolonii lub podłoża



Wyniosłość - profil

Skośny agar

Słupek żelatynowy



Intensywność wzrostu



Charakter brzegu linii wzrostu



Konsystencja



Barwa



Powierzchniowy



Wzdłuż linii kłucia



W dolnej części słupka



Upłynnienie żelatyny

Wzrost drobnoustrojów

na podłożach płynnych

Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala

na określenie zapotrzebowania bakterii na tlen.



Bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w

postaci pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek.

W zależności od gatunku bakterii kożuch może być

biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający

się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach;



Względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny,

objawiający się jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki;



Bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie

probówki. Po wstrząśnięciu osad unosi się w sposób pylisty,

osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty;



Mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym

oddaleniu od powierzchni pożywki.

Wymienione typy wzrostu na podłożach płynnych

można obserwować w różnych kombinacjach,

np. zmętnienie i osad, zmętnienie i kożuszek.

a) wzrost na powierzchni w

postaci pierścienia,

b) wzrost dyfuzyjny,
c) częściowe zmętnienie i osad,
d) wzrost podpowierzchniowy.

Wzrost bakterii w hodowlach

płynnych:

Wzrost i charakterystyka

mikroorganizmów na podłożach

stałych

Ma zastosowanie w diagnostyce, przy otrzymywaniu

czystych

kultur oraz w analizach ilościowych.

Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem,

wyrosłe

najczęściej z jednej komórki. W standardowych

warunkach

środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami,

uwzględnianymi w diagnostyce.

Obserwacje koloni przeprowadza się przy

pomocy lupy lub binokularu biorąc pod

uwagę:



wielkość (w milimetrach) oraz kształt koloni, np.

okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty.

Niektóre bakterie mogą nie tworzyć pojedynczych

kolonii, lecz zarastać całe podłoże, dając wzrost

mgławicowy, rozlany (Proteus), inne tworzą kolonie

rozpełzające się po powierzchni podłoża (Bacillus).



brzeg koloni: gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty

regularny lub nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny,
nitkowaty:

Obserwacje koloni przeprowadza się przy

pomocy lupy lub binokularu biorąc pod

uwagę:



powierzchnię koloni: gładka i pomarszczona; może być lśniąca

lub matowa:

Obserwacje koloni przeprowadza się przy

pomocy lupy lub binokularu biorąc pod

uwagę:

Obserwacje koloni przeprowadza się przy

pomocy lupy lub binokularu biorąc pod

uwagę:

barwę koloni i jej przejrzystość: przeźroczysta,
mętna, opalizująca, nieprzeźroczysta oraz zdolność do
wytwarzania pigmentu zabarwiającego otoczenie koloni:
zabarwione, niezabarwione. Na przykład Sarcina lutea i
Pseudomonas herbicola – tworzą kolonie żółte,
Staphylococcus aureus – pomarańczowo-złote;
Serratiamarcescens – krwisto-czerwone; Azotobacter –
ciemno brązowe, Pseudomonas fluorescens –
seledynowe fluoryzujące.
Ponadto wytwarzane przez pseudomonady barwniki
dyfundują do podłoża zmieniając kolor na zielonkawy,
niebieskawy, fioletowy, niekiedy fluoryzujący;

Obserwacje koloni przeprowadza się przy

pomocy lupy lub binokularu biorąc pod

uwagę:

konsystencję: struktura: zwarta, drobnoziarnista,
gruboziarnista, luźna;

profil koloni ponad powierzchnię pożywki: płaski;
wyniosły; soczewkowaty niski, soczewkowaty wysoki;
pępkowaty.

Z praktycznego punktu widzenia

rozróżnia się następujące typy kolonii

powierzchniowych:

„S” (smooth – gładki) – o gładkim brzegu, powierzchni wypukłej bez wzniesień i
wgłębień. Jest to cecha charakterystyczna dla kolonii młodych i prowadzonych na
agarze odżywczym, a także zjadliwych form bakterii chorobotwórczych,

„R” (rought – szorstki) – o brzegu nierównym, płatowatym lub nitkowatym i
szorstkiej powierzchni. Bakterie tworzące takie kolonie układają się w długie nici lub
łańcuszki. Kolonie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii, chociaż te same bakterie
wytwarzające kolonie gładkie, są chorobotwórcze

„G” (gonidial – gonidialny) – kolonie bardzo drobne o średnicy 1 mm tworzone
przez drobne bakterie

„M” (mucoid – śluzowaty) – kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej,
wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczką

„L” (L-formy) – powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach
środowiskowych. Kolonia taka składa się z komórek bardzo drobnych –
przesączalnych, poprzez formy ziarniste i pałeczkowate, do form olbrzymich o
średnicy dochodzącej do 10 µm.

Nieco odmienne kolonie

wytwarzają promieniowce –

Actinomycetales, które będąc

bakteriami morfologicznie

przypominają grzyby

strzępkowe.

Na podłożach stałych tworzą

grzybnię zbudowaną ze

strzępek, tzw. pseudomycelium,

które może ulegać fragmentacji.

U niektórych promieniowców

końce pseudomycelium

przekształcają się w konidia

powietrzne, które są formami

przetrwalnymi.

Grzyby – Fungi, których plecha ma

budowę nitkowatą, złożoną z mniej

lub

bardziej rozgałzionych, jedno-

(komórczak)

lub wielokomórkowych, jedno- lub

wielojądrowych strzępek. Wytwarzają

grzybnię dwóch rodzajów:



grzybnię wrastającą w podłoże i

służącą

do pobierania pokarmu;



puszystą, zwartą lub luźną

grzybnię

powietrzną, zbudowaną ze strzępek

z różnymi formami owocowania, na

ogół

wegetatywnego. Początkowo jest

ona

bezbarwna lub biała. W miarę

wzrostu

i w zależności od wytwarzanego

barwnika (koloru zarodników

konidialnych) kolonia przybiera

różną

barwę;

Wzrost grzyba

histoplasma capsulatum

(będącego przyczyną zakażeń

układu oddechowego) na

dwóch podłożach:

- Sabouraud (L)

- Sabhi (P)

Drożdże – rosnąc na powierzchni

podłoży stałych tworzą pojedyncze

kolonie, które można sklasyfikować

tak jak u bakterii (S – gładkie;

R- pomarszczone; M- śluzowate)

bądź tworzą jednolity nalot.

Powierzchnia koloni może być

gładka

z wyniesieniem na środku,
pomarszczona, lśniąca lub

matowa. Wewnątrz podłoża tworzą

charakterystyczne kolonie o

kształcie

soczewkowatym. W podłożach

płynnych

drożdże rosnąc tworzą na

powierzchni

błonkę lub na dnie osad.

Wzrost i charakterystyka hodowli

na skosie agarowym

Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą
wyodrębnionych koloni, jednak sposób wzrostu jest również
ważną cechą diagnostyczną.
Wzrost bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące

cechy:



charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu

komórek); perlisty (tworzą się oddzielne, niezlewające ze sobą

kolonie) o brzegach gładkich, ząbkowanych, kolczastych,

ziarnistych; krzewiasty, nieregularny, itp.;



powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha

błonka;



struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana;



barwa i przeźroczystość

.

Typy wzrostu bakterii

w hodowlach rysowych:



1 – drzewiasty



2 – mgławicowy



3 – pierzasty



4 – korzonkowy



5 – perlisty



6 – jednolity

Wzrost drobnoustrojów

na słupku w hodowli

kłutej opisujemy

uwzględniając

następujące cechy:



ruchliwość



upłynnianie żelatyny

(w przypadku bakterii

proteolitycznych)



charakter upłynnienia

wzdłuż
nakłucia.

Wzrost bakterii na żelatynie

kłutej

1 – brak upłynnienia
2 – upłynnienie kraterowate
3 – upłynnienie workowate
4 – upłynnienie lejkowate
5 – upłynnienie walcowate
6 – upłynnienie kielichowate

Zależność bakterii

od zapotrzebowania na tlen

Określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu
polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym
zaszczepionym igłą do dna probówki.



bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni
pożywki;



bezwzględne beztlenowce rosną tylko w dolnych
partiach pożywki;



względne beztlenowce rosną na całej wysokości
słupka;



mikroaerofile rosną tuż pod powierzchnią pożywki.

Posiew

Posiew jest podstawową metodą diagnostyki

bakteriologicznej i mikologicznej zarówno

w mikrobiologii klinicznej, jak i "badawczej".

Najkrócej rzecz ujmując posiew to metoda

uzyskania pojedynczych, odosobnionych kolonii

bakterii, czy grzybów na podłożach

mikrobiologicznych.

Metod i sposobów uzyskania tego jest wiele - lecz

jedynie kilka jest powszechnie używanych.

Posiew mikrobiologiczny jest to

przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub

badanego materiału do jałowej pożywki.

Zaszczepioną pożywkę umieszcza się w cieplarce, w określonych, stałych
warunkach temperatury i natlenienia, zapewniających rozwój
wprowadzonym drobnoustrojom.
W zależności od kierunku prowadzonych badań, celem posiewu może być:
- odświeżenie hodowli drobnoustrojów. Do tego typu posiewów należą
przesiewy szczepów muzealnych w celu utrzymania ich żywotności i
aktywności;
- izolacja czystych kultur z badanego materiału;
- diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich
przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów.
- stwierdzenie stanu mikrobiologicznego produktu (jałowości, jakości
mikroflory);
- oznaczenie liczby drobnoustrojów w badanym materiale;
- przygotowanie inokulatów do prowadzenia hodowli w warunkach
doświadczalnych czy też do celów przemysłowych.

Wszystkie czynności

związane z posiewem

należy prowadzić

zachowując

warunki jałowości.

Najlepiej posiew wykonać

w pomieszczeniu

przeznaczonym do tego

celu.

Posiew wykonuje się

przy palniku gazowym,

opalając wyloty naczyń

i pipet w płomieniu,

a także wyżarzając

używane podczas

posiewu ezy i igły.

Za pomocą ezy wykonuje się posiewy na podłoża płynne i stałe.

Ezę z pobranym materiałem zanurza się w pożywce płynnej,

wymywając komórki z jej powierzchni.

W pożywkach zestalonych natomiast, czy to w płytce Petriego,

czy też w postaci skosu w probówce,posiewu dokonuje się

punktowo,

dotykając ezą powierzchni pożywki albo pocierając powierzchnię

zestalonego podłoża w sposób rysowy lub falisty.

Dokonując posiewu igłą,

wkłuwamy ją w słupek zestalonego podłoża.

Do posiewu drobnoustrojów znajdujących się w środowisku płynnym

służy pipeta. Za pomocą pipety zwykłej albo pasteurowskiej

materiał

można przenieść na pożywkę płynną lub zestaloną.

Posiewu drobnoustrojów dokonuje się ezą, tą lub pipetą.

Niekiedy posiew przeprowadza się z użyciem jałowych

tamponów z waty lub gazy albo szklanych pręcików,

wygiętych pod specjalnym kątem, tzw. głaszczek.

Posiew metodą uproszczoną

Metody tej można używać tylko przy wysiewaniu na

podłoża

stałe. Główną zaletą tej metody jest jej prostota.
Posiew wykonuje się "rysując" ezą wgłębienia w podłożu.
Używa się jej głównie przy hodowlach z materiału
zawierającego niewiele bakterii (np. z moczu).

1 Kierunek prowadzenia rozmazu
2 Przykładowy wygląd hodowli

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjny jest najpopularniejszą metodą posiewu, Istnieje
kilka możliwości poprawnego wysiania materiału metodą redukcyjną,
nieznacznie różniących się między sobą. Sam proces posiewania
podzielić można na cztery części.
Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika
ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości
szalki Petriego (etap 1). Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla
wygody obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną
powtarzamy czynność (etap 2). Obracamy znów płytkę Petriego
(trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3). W
etapie 4 kolejną ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w
górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku.

Schemat posiewu redukcyjnego

Kolonie laseczek wąglika (Bacillus anthracis)

z materiału posianego redukcyjnie

Sposób wykonywania posiewów

mikroorganizmów



Etap I- przygotowanie
rozcieńczeń próbki

a - próbka badana,
b - probówka ze sterylną

wodą

buforowaną.



Etap II- posiew na podłoża
płynne lub stałe.

Obserwacja wyrosłych

hodowli.

Posiewy z powierzchni

Polegają na dokonaniu wymazu z użyciem jałowych
tamponów.
Zebraną za pomocą tamponu mikroflorę przenosimy na
odpowiednią, najczęściej zestaloną pożywkę. Można również
wypłukać tampon w rozcieńczalniku i wykonać posiew
bezpośrednio z zawiesiny lub z rozcieńczeń. Przy dokonywaniu
posiewów często jest niezbędne sporządzanie zawiesin
drobnoustrojów lub badanego materiału. Do tego celu służą
odpowiednie rozcieńczalniki.
Najczęściej stosuje się roztwór fizjologiczny - 0,85-procentowy
roztwór NaCl lub płyn Ringera. Są to roztwory izotoniczne dla
komórek drobnoustrojów.

Posiew ilościowy

Do oznaczenia ilości drobnoustrojów w produkcie
spożywczym lub badanym materiale odważa się lub
odmierza określoną ilość produktu i odpowiednio
rozdrobniony wprowadza się do roztworu

rozcieńczalnika.

Następnie przygotowuje się dalsze rozcieńczenia
dziesiętne w zależności od spodziewanego

zakażenia,

przenosząc po 1 cm3 do probówki z 9 cm3 jałowego
rozcieńczalnika.

Zasada przygotowywania rozcieńczeń
dziesiętnych