MIKROBIOLOGIA ćw.3

Hodowla Drobnoustrojów

Hodowla - pożywka płynna lub stała z rozwijającymi się na niej lub w niej drobnoustrojami.

Hodowla:

- czysta: zawiera jeden gatunek drobnoustrojów,

- mieszana: zawiera drobnoustroje z różnych gatunków.

Cel hodowli:

- wyhodowanie drobnoustrojów z materiału klinicznego,

- ocena morfologii kolonii bakteryjnej,

- określenie niektórych cech metabolicznych np. zdolności do rozkładu laktozy, mannitolu czy es kuliny, zdolności do wzrostu w warunkach tlenowych bądź beztlenowych, zdolności do hemolizy.

Techniki posiewu:

Posiew - zakładanie kolonii(hodowli).

- podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikrobiologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej jak i badawczej to metoda uzyskiwania pojedynczych odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych,

- narzędziem obecnie używanym do posiewu jest eza.

Rodzaje posiewu:

1.Metoda uproszczona:

2.Posiew redukcyjny:

- umożliwia uzyskanie czystej kultury bakterii na prawidłowo posianej płytce po całonocnej inkubacji można zaobserwować pojedyncze kolonie bakterii.

- każda kolonia to potomstwo jednej bakterii, aby była widoczna gołym okiem, kolonia musi zawierać około 107 komórek.

- stosuje się do przesiewania bakterii z podłóż stałych.

Należy pamiętać, że każdorazowo przed rozsianiem materiału opalamy ezę w płomieniu palnika.

Materiał mikrobiologiczny nanosimy tylko raz.

Metody wysiewania na podłożu stałym wylanym do probówek:

- przechowywanie szczepów identyfikujące na podstawie wzrostu na odpowiednich podłożach.

Metoda seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń pozwala bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie.

X - od -5 do -10

Rodzaje posiewu:

a) Metoda Hoepricka: używać można jedynie do wysiewu materiału płynnego.

b)Posiew murawowy:

- do określania miana hodowli komórki bakteryjnej,

- przy wysokim stopniu rozcieńczenia hodowli (~10-6) uzyskuje się pojedyncze kolonie bakteryjne.

- oznaczenie wrażliwości bakterii chemoterapeutyki.

- w celu uzyskania max liczby trans formatów,

- w celu uzyskania max liczby transduktantów.

c)posiew kłuty : wykonuje się wkłuwając ezę w słupek,

d)posiew rysowy: przeprowadza się na powierzchni skosu agarowego.

Wykonując posiew:

- na podłożu płynnym należy pobrać ezą badany materiał, a następnie zaznaczyć w probówce z pożywką i lekko potrząsając ezą wypłukać materiał z oczka,

- na skosie agarowym pobieramy ezą badany materiał a następnie dotykamy ezą powierzchni skosu i ruchem falistym lub zygzakowatym przeciągamy ezę po powierzchni podłoża w kierunku wylotu probówki,

- na płytce Petriego odrobinę badanego materiału rozprowadza się zygzakiem lub promieniście na całej powierzchni zestalonego podłoża agarowego lub też dzieli się je na sektory i w nich rozprowadza materiał.

Po wykonaniu posiewu:

- bakterie inkubujemy w cieplarkach (37°C),

- po inkubacji płytki przechowywane są w chłodniach (lodówce+4°C do 10°C),

- w chłodni przechowuje się także wszystkie jałowe pożywki mikrobiologiczne.

Warunki hodowli drobnoustrojów:

- czynniki fizyczne(temperatura),

- czynniki chemiczne(kwasowość, tlenowość),

- zawartość składników odżywczych (rodzaje pożywek).

Temperatura:

- bardzo szerokim zakresie temperaturowym od -23°C do 113°C,

- większość mikroorganizmów 10-37°C, warunkach laboratoryjnych temperatura dla bakterii to 30-37°C, a dla grzybów 20-25°C.

Podział drobnoustrojów ze względu na różnicę w temperaturze wzrostu:

1.Psychrofilne (-23-0;15;20°C), bakterie Gram ujemne należące do rodzaju Pseudomonas oraz Vibrio, Acinetobacter, bakterie Gram dodatnie: Micrococcus, Bacillus oraz Lactobacillus, drożdże-Candiola spp. Zatrucia pokarmowe stwarzają: Listeria monocytogenes, Kersinia enterocolitica i Bacillus cereus.

2.Mezofilne (10-30;20-37;35-50°C) większość drobnoustrojów występujących w środowisku (glebie, wodzie, na powierzchni ciała, roślin, zwierząt) mikroorganizmy saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka wywołują zatrucia pokarmowe.

3.Termofilne (25-45;46-65/80;60-90°C) bakterie Gram dodatnie, przetrwalnikujące należące do rodzaju Bacillus, Streptococcus, Lactobacillus.

Tlenowość - potencjał oksydacyjno - redukcyjny:

1.Bezwzględne tlenowce (potrzebują tlenu)

- Bacillus spp., Micrococcus spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.

2.Względne beztlenowce (wzrost w warunkach tlenowych 2-8% O₂ lub beztlenowych)

- Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp.

3.Mikroaerofile (wymagają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, jednak jego stężenie w atmosferze powinno być obniżone 5% O₂)

- Helicobacter pylori.

4.Bezwzględne beztlenowce (nie są zdolne do wzrostu jeśli zawartość tlenu w atmosferze przekracza 0,5%)

- rodzaj Clostridium.

Wzrost na podłożu płynnym:

1 - bezwzględne tlenowce

2 - bezwzględne beztlenowce

3 - mikroaerofile

4 - względne beztlenowce

Podział ze względu na kwasowość:

1.Alkalofile - rozwijające się w środowisku alkalicznym (pH 8-11).

- Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Bacillus spp.

2.Neutrofile (pH 6,5-7).

3.Acidofile (pH 2-5).

Cechy charakterystyczne podłoża:

- Odpowiednia zawartość substancji odżywczych,

- odpowiednie pH,

- jałowość,

- klarowość i jednorodność.

PODZIAŁ PODŁOŻY

1. Ze względu na konsystencję:

a)płynne (bulion mięsny),

b)półpłynne(0,5-1% agar),

c)stałe(>1% agar).

2. Ze względu na zawartość substancji:

a)syntetyczne,

b)półsynetyczne,

c)naturalne.

3. Ze względu na ilość i jakość składników odżywczych:

a)proste (podstawowe) niskie wymagania

- woda peptonowa, bulion mięsny, agar zwykły, żelatyna.

b)złożone (wzbogacone)

- agar z 5% krwią baranią, agar Mueller-Hintona do antybiotyków,

- dla bakterii o wysokich wymaganiach.

3 rodzaje hemolizy:

- α hemoliza - częściowa, objawia się zielonkawym zabarwieniem wokół wzrastającej kolonii,

-β hemoliza - całkowita, objawia się przejaśnieniem wokół wzrastającej kolonii,

-γ - brak hemolizy.

PODZIAŁ PODŁOŻY

I. Wybiórczo - namnażające:

- rosną na nich określone drobnoustroje,

- bulion z żółcią do hodowli Salmonella spp. (hamuje wzrost bakterii Gram dodatnich),

-podłoże SS - dla Salmonella i Shigella (hamuje rozwój pałeczek z rodzaju Escherichia i rodzaju Profeus), szczepy wytwarzające H₂S (Salmonella spp) tworzą kolonie z czarnymi środkami.

II. Wybiórczo różnicujące:

- rosną na nich wybrane bakterie i są one różnicowane na drodze właściwości biochemicznych,

1. Podłoże Chapmana dla gronkowców:

- czynnik wybiórczy :7,5% NaCl (hamuje rozwój większości drobnoustrojów),

- czynnik różnicujący: mannitol (Staphylococcus aureus fermentuje mannitol zakwaszając środowisko- duże kolonie otoczone żóltą strefą, Staphylococcus epidermidis - małe kolonie żółtego zabarwienia).

2. Podłoże MacConkey'a (MCA) dla pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae.

- czynnik wybiórczy: dezoksycholan sodu i fiolet krystaliczny - hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich.

- czynnik różnicujący: laktoza- bakterie rozkładające laktozę tworzą różowo zabarwione kolonie (np. escherichia coli), bakterie nierozkładające laktozy - kolonie przezroczyste (np. Proteus vulgaris)

- pałeczki rozkładające dezoksycholan sodu daje wokół kolonii strefę wytrącanego kw. .Dezoksycholowego.

3. Podłoże z azydkiem sodu (DCA) dla paciorkowców kałowych.

- czynnik wybiórczy: azydek sodu - pozwala na wzrost paciorkowców,

- czynnik różnicujący: es kulina - rozkładana przez Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium daje czarne zabarwienie podłoża.

4. Podłoże z cetrymidem (PYA) dla Pseudomonas aeruginosa.

- cetrymidem dodany do podłożam hamuje wzrost bakterii Gram(+) i większości Gram(-), Anie hamuje wytwarzania piocyjaniny.

Pseudomonas ma zielony lub niebieski, żółty kolor i charakterystyczny zapach jaśminu

5.Podłoże Sabourauda

-wybiórcze dla grzybów (obniżone pH, zawiera antybiotyki : cykloheksamid i chloramfenikol).

III. Podłoże specjalne:

- hodowla drobnoustrojów wybrednych, o specjalnych wymaganiach wzrostowych.

1.Agar czekoladowy

- zawiera hemolizowaną krew (otrzymuje się przez zagotowanie agaru z krwią, proces ten uwalnia czynniki wzrostowe krwinek X i V). X-NAD⁺ V - hemina

- Haemophillus spp., Neisseria spp.

2. Podłoże Löfflera (zawiera ściętą surowicę końską dla Corynebacterium diphteriae) - skośne w probówce.

3. Podłoże Lowensteina - Jensena dla Mycobacterium tuberculosis(prątek gruźlicy) - na skosie stałym.

- zawiera zieleń malachitową, która hamuje wzrost innych drobnoustrojów.

4. Bulion z tioglikolanem sodu do hodowli bakterii beztlenowych - półpłynne.

Podłoża transportowe:

- umożliwiają przeżycie bakterii podczas transportu.

Podłoża transportowo-namnażające:

- ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii podczas transportu.

Metody Hodowli Bakterii Beztlenowych:

- wytworzenie ujemnego potencjału oksydoredukcyjnego, w tym celu stosowane są następujące metody:

a)fizyczne: podłoża przygotowane są na świeżo lub regenerowane przez zagotowanie i gwałtowne ochłodzenie w przypadku podłoży płynnych.

Płytki z podłożem umieszcza się w an aerostatach, z których usuwa się tlen na drodze reakcji chemicznych w generatorach lub przez zastąpienie powietrza gazem obojętnym.

b)chemiczne: do podłoża dodaje się substancje obniżające potencjał oksydoredukcyjny np. kw. Tioglikolanowy i rezazurynę jako wskaźnik.

c)biologiczne: na jednej części podłoża posiewany jest drobnoustrój bezwzględnie tlenowy np. Bacillus subtillis, który pochłania tlen, a na drugiej części drobnoustrój beztlenowy (płytki oklejone są para filmem) Skład podłoża jest optymalny dla obu gatunków.

Specjalna aparatura:

- eksykatory próżniowe lub an aerostaty,

- generatory i odtleniacze chemiczne.

Hodowla Mikroaerofili:

- rosną w środowisku o zmniejszonej zawartości tlenu atmosferycznego,

-oprócz firmowych generatorów stosuje się specjalne eksykatory i cieplarki z przepływem CO₂.

---