Ćw nr 2 Hodowla drobnoustrojów warunkach laboratoryjnych

Pożywki

• Badanie i obserwacja drobnoustrojów w warunkach sztucznych, laboratoryjnych, jest możliwa dzięki hodowli mikroorganizmów na pożywkach, zwanych inaczej podłożami.

• Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyosobnienie czystych kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych, diagnostycznych oraz wszelkiego rodzaju hodowli doświadczalnych

Pożywka jest mieszaniną roztworów odpowiednio dobranych składników

Pożywka powinna spełniać następujące warunki:

• Zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych

• Zawierać określone czynniki wzrostowe

• Mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne

• Zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp tlenu

• Wykazywać właściwe pH

Nie ma uniwersalniej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów

• Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne

• Heterotrofy mają już większe wymagania, które można zaspokoić dodając kompleksowe substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrakt drożdżowy.

Składniki pożywek

1. Substancje odżywcze

Źródło węgla

Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów są cukry (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki może służyć celom diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek wykorzystuje określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w pożywce waha się w ilości 0,5-2%.

Źródło azotu

Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany). Niektóre drobnoustroje mogą pobierać wolny azot z powietrza, a także azot ze związków organicznych (ekstrakty
z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz hydrolizaty białek). Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%

Do źródeł azotu zaliczamy:

• Ekstrakty mięsne - wodne wyciągi
  z tkanki mięsnej, serc i wątroby (źródło N, węglowodanów i witamin)

• Ekstrakty drożdżowe - źródło N, C, witaminy z grupy B

• Peptony - produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka (źródło N, witamin i węglowodanów)

• Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, nasion soi - bogate źródło aminokwasów,

• Czyste białka (kazeina) oraz białka rodzime (białka jaja, surowicy krwi)

• Wolne aminokwasy - czasami dodawane do podłoża

Sole mineralne

Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników nieorganicznych: fosforu siarki, potasu, sodu, magnezu, żelaza i in. Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne (NaCl) lub działają buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki (fosforany potasu)

• Czynniki wzrostowe

Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin (kosztowne) lub w formie wyciągu mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, ekstrakt glebowy i ziemniaczany)

Związki korygujące pH

Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4). Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne
(pH 5-6). Korektę pH pożywek przeprowadza się najczęściej za pomocą 1-5 M roztworów NaOH i HCl

• Substancje różnicujące i wybiórcze

Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem mikroorganizmów modyfikacji lub rozkładowi, co uwidacznia się zmianą barwy kolonii podłoża, lub powstaniu strefy przejaśnienia

Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki) hamują rozwój pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie drobnoustrojów

2. Czynniki zestalające (pozwalają one na uzyskanie pożywek w formie stałej) Agar-agar

Jest to dostępny handlowo w formie proszku lub włókien, wielocukier otrzymywany
z glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę
i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w temp. 90-100°C, a zestala się w temp.
45 -48°C. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru.

Składniki pożywek

Żelatyna

Jest to substancja białkowa, która powstaje w wyniku hydrolizy kolagenu, może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne (upłynnienie pożywki). Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%

Rodzaje pożywek

Kryteria podziału pożywek:

• Skład chemiczny i pochodzenie składników

• Zawartość składników

• Cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża)

• konsystencja

Podział pożywek w zależności od składu podłoża

• Naturalne - przygotowane wprost
  z surowca roślinnego lub zwierzęcego,
  w sposób zapewniający jego jałowość, np.. Mleko, serwatka, bulion

• Syntetyczne - wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych,
  o znanym składzie jakościowym i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla autotrofów

• Półsyntetyczne - podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np.. Mleko z lakmusem

Ze względu na zawartość składników rozróżnia się podłoża:

• Podstawowe (zwykłe) - stanowią bazę do przygotowania innych pożywek, np. bulion zwykły, brzeczka

• Wzbogacone - to podłoża podstawowe wzbogacone dodatkowymi składnikami odżywczymi np.. Bulion odżywczy, agar
  z krwią. Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości drobnoustrojów

Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:

• Namnażające lub namnażająco-wybiórcze - stosujemy wówczas, gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany drobnoustrój występuje z inna mikroflorą towarzyszącą.

• Selektywne (wybiórcze)- zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez wpływu na pożądane

Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:

• Różnicujące -zawiera oprócz składników odżywczych substancję diagnostyczną, która może być enzymatycznie rozłożona tylko przez określone gatunki drobnoustrojów. Są to podłoża stałe, np.. Agar z krwią, Endo

• Testowe - służą do oznaczenia witamin, aminokwasów i antybiotyków przy pomocy mikroorganizmów. Testowany czynnik nie występuje w podłożu co jest podstawą oznaczenia

Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:

• Identyfikacyjne (diagnostyczne) - na nie przesiewa się kolonie drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju czy określonej grupy, na podstawie określonych reakcji biochemicznych zachodzących pod wpływem danego organizmu

Podłoża wybiórczo-różnicujące

Podłoża pod względem konsystencji dzielimy na:

• Płynne - powinny być klarowne, a więc składniki muszą być całkowicie rozpuszczone, np.. bulion płynny, brzeczka

• Półpłynne - z dodatkiem 0,1-0,8% agaru

• Stałe - zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci jednolitej, gładkiej warstwy bądź też
  w postaci słupka lub skosu w probówce

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów na pożywkach

Wzrost i charakter drobnoustrojów w pożywkach płynnych

1. Bezwzględne tlenowce - rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek. Kożuch może być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się

2. Względne beztlenowce - charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki

Wzrost i charakter drobnoustrojów w pożywkach płynnych

3. Bezwzględne beztlenowce - rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięci osad unosi się w sposób pylisty, osiadający

4. Mikroareofile - rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od powierzchni probówki

Wzrost bakterii w hodowlach płynnych

1. Wzrost na powierzchni
   
   
   w postaci pierścienia

2. Wzrost dyfuzyjny

3. Częściowe zmętnienie i osad

4. Wzrost podpowierzchniowy

Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego

• Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje kolonii przeprowadza się przy pomocy lupy lub binokularu.

Na podłożu Wilson-Blaira kolonie szczepów Salmonella rosną na kolor czarny , z metalicznym połyskiem, podłoża pod koloniami są wybarwione na brunatno

Czyste kultury bakteryjne

Pod pojęciem czystych kultur bakteryjnych należy rozumieć kolonie powstałe z pojedynczych komórek drobnoustroju.

Badania diagnostyczne, fizjologiczne i morfologiczne można prowadzić tylko na czystych kulturach.

Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego

• Wielkość (średnica w milimetrach) oraz kształt kolonii

Kształt - okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty.

• Brzeg kolonii

Gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty

• Powierzchnia kolonii

Gładka i pomarszczona, może być lśniąca lub matowa

• Barwa kolonii i jej przejrzystość

Przeźroczysta, mętna, opalizująca, nieprzeźroczysta oraz zdolność do wytwarzania pigmentu zabarwiającego otoczenie kolonii: zabarwione, nie zabarwione

Szczepy S. aureus wyrastają w postaci dużych kolonii, średnicy 1-3 mm. Żółte zabarwienie pochodzi z rozkładu mannitolu

Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego

Konsystencja Struktura zawarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna

Profil kolonii

Ponad powierzchnia pożywki: płaski, wyniosły, soczewkowaty niski, soczewkowaty wysoki, pępkowaty

Z praktycznego punktu widzenia wyróżnia się typy kolonii:

• „S” (smooth - gładki) - o brzegu gładkim, powierzchni wypukłej bez wzniesień i wgłębień. Cecha charakterystyczna dla kolonii młodych (agar odżywczy) i zjadliwych form bakterii

• „R” (rought - szorstki) - o brzegu nierównym, płatowatym lub nitkowatym. Kolonie tworzą dłubie nici lub łańcuszki. Kolonie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii

• „G” (gonidial - gonidialny) - kolonie bardzo drobne, o średnicy 1 mm.

• „L” (L-formy) - powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach środowiskowych. Kolonia taka składa się
  z komórek bardzo drobnych a także form olbrzymich

• „M” - (mucoid - śluzowaty) - kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej, wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczką

Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym

• Charakter wzrostu - jednolity, perlisty (tworzą się oddzielne, niezlewające ze sobą komórki), krzewiasty ,niereguralny

• Powierzchni rysy - lśniąca, matowa, czasem cienka

• struktura;: gładka, ziarnista, pofałdowana

• Barwa i przeźroczystość

Typy wzrostu bakterii na skosie agarowym

Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej

Opisujemy następujące cechy:

• Ruchliwość

• Upłynnienie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także charakter upłynnienia

• Zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen

---