Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe

1

Ćwiczenie 11

K

WASY

N

UKLEINOWE

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:

amoniak

– C, N

azotan srebra

– C, N

błękit metylenowy

– Xn

chlorek żelaza

– Xn

difenyloamina

– T

etanol, 96%, 70%

– F

kwas azotowy(V),65% – C
kwas octowy, 96%

– R10

kwas siarkowy, 95%

– C

kwas solny

– C

wodorotlenek sodu

– C

siarczan dodecylu sodu – F
siarczan miedzi

– Xn

Tris

– Xi

1.

B

ADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH

1.1.

R

OZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH

Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają się dobrze w środowisku

zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonym kwasie octowym. W roztworach wodnych tworzą układy koloidalne, z których można je

wytrącić za pomocą czynników odwadniających. Znaczne obniżenie pH roztworu przez dodanie mocnych kwasów lub czynników

odwadniających doprowadza do ich wytrącenia z roztworu. Dwie nici DNA ulegają rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i pH<2,

ze względu na jonizację zasad. Jonizacja powoduje zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, co prowadzi do

zaburzenia wiązań wodorowych pomiędzy A i T oraz C i G. Ponadto przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca

cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do

depurynacji i depirymidyzacji – utraty zasad przez trawienie wiązania glikozydowego. Wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych

zasad staje się bardziej podatne na hydrolizę, co prowadzi do degradacji DNA. Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo

stabilne w odczynie zasadowym, wykonuje się najczęściej denaturację pod wpływem kwasów.

Wykonanie:

Przygotować dwie szklane, krótkie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.5% roztworu RNA a następnie 2 – 3

krople 2 M HCl. Wytraca się biały osad RNA. Po dodaniu 200 – 300 µl 10% roztworu NaOH osad ulega rozpuszczeniu. Do

drugiej probówki dodać 1 ml 5% RNA, 200 µl CH

3

COONa oraz 1 ml 96% etanolu – roztwór mętnieje, ponieważ wytrąca się

osad RNA.

1.2.

T

WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BARWNIKAMI

W środowisku kwaśnym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe, tworząc połączenia typu soli, co wykorzystuje się m.in. do

histochemicznego barwienia jąder komórkowych.

Wykonanie:

Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA a następnie 300 µl 1 M CH

3

COOH oraz 5 – 6 kropli 0.1%

błękitu metylenowego (używając pipety do 100 µl). Zawartość szklanej probówki przenieść do probówki typu Eppendorf i

zwirować. Po wirowaniu widoczny jest niebieski osad kompleksów RNA z błękitem metylenowym.

1.3.

T

WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAŁKAMI

Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi kompleksowe połączenia, zwane sztucznymi

nukleoproteidami. Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje się nasycone roztwory NaCl.

Wykonanie:

Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA oraz 300 µl 1 M CH

3

COOH a następnie 100 µl 3%

roztworu BSA. Wytrąca się osad kompleksowego połączenia białka z RNA. W celu rozpuszczenia osadu dodać 1 ml

nasyconego roztworu NaCl.

Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe

2

2.

P

REPARATYKA ORAZ ANALIZA SKŁADU

RNA

2.1.

I

ZOLACJA

RNA

Z DROŻDŻY

Opisana poniżej metoda izolowania RNA polega na rozbiciu komórek drożdży, usunięciu z roztworu białek i DNA za pomocą anionowego

detergentu - siarczanu dodecylu sodu (SDS) a następnie wytrąceniu RNA za pomocą etanolu.

Wykonanie: W zlewce o poj. 200 ml ogrzać do wrzenia 30 ml 5% roztworu SDS stale mieszając. Do wrzącego roztworu SDS

dodać 10 g rozdrobnionych drożdży piekarskich i kontynuować ogrzewanie przez 5 min. Zlewkę ochłodzić pod bieżącą wodą

a następnie zawartość zlewki przenieść do probówki wirowniczej o poj. 50 ml i zwirować (3000 RCF*, 10 min, 4°C). Nadsącz

zebrać i dodać do 60 ml schłodzonego 96% etanolu. Po 10 min precypitacji w lodzie roztwór przenieść ponownie do

probówki wirowniczej i zwirować (3000 RCF, 10 min, 4°C). Osad wytraconego RNA rozpuścić w 50 ml wody destylowanej.

2.2.

H

YDROLIZA KWASOWA

RNA

Kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w łańcuch polinukleotydowy. Nukleotyd składa

się z cząsteczki cukru (rybozy w RNA, deoksyrybozy w DNA), zasady azotowej (purynowej: adeniny, guaniny lub pirymidynowej: cytozyny,

tyminy, uracylu) oraz reszty fosforanowej. Nukleotydy to fosforany nukleozydów. Większość reakcji charakterystycznych dla

poszczególnych składników kwasów nukleinowych zachodzi dopiero po hydrolizie makrocząsteczki. Kwasy nukleinowe ogrzewane z

kwasami nieorganicznymi (np. 1 M HCl, 10% H

2

SO

4

) ulegają stopniowej hydrolizie do monofosforanów nukleozydów. Przy wystarczająco

długo prowadzonym ogrzewaniu w hydrolizacie uzyskujemy wolne zasady azotowe, pentozy i kwas fosforowy.

Wykonanie: Przygotować kolbę stożkową o poj. 200 ml. Do roztworu RNA wyizolowanego z drożdży dodać 10% H

2

SO

4

w

stosunku 1:2 i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min. Po ostudzeniu hydrolizat RNA przefiltrować a następnie

przeprowadzić na nim reakcje pozwalające na identyfikację poszczególnych składników (pkt. 2.3).

2.3.

I

DENTYFIKACJA SKŁADNIKÓW

RNA

2.3.1.

W

YKRYWANIE PENTOZY

–

REAKCJA

T

OLLENSA

W obecności stężonych kwasów mineralnych z pentozy powstaje z furfural (patrz: Ćw.9 Analiza monosacharydów), który kondensując z

floroglucyną (fenol) tworzy związek barwy czerwonej. Reakcja Tollensa, podobnie jak próba Taubera, służy do odróżniania pentoz od

heksoz.

Wykonanie: Przygotować długą szklaną probówkę. Do 1 ml hydrolizatu RNA dodać 1 ml stęż. HCl i kilka kryształków

floroglucyny. Roztwór ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstaje czerwone zabarwienie świadczące o obecności pentoz w

hydrolizacie RNA.

2.3.2.

W

YKRYWANIE RESZTY FOSFORANOWEJ

Obecny w hydrolizacie RNA kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO

3

, co prowadzi do powstania żółtego

osadu fosfomolibdenianu amonu.

Wykonanie: Przygotować długą szklaną probówkę. 0.5 ml hydrolizatu RNA zobojętnić amoniakiem (150 – 200 µl,

kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Dodać 0.5 ml stęż. HNO

3

oraz 2 ml 2.5% molibdenianu amonowego. Zawartość

probówki ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstający fosfomolibdenian amonowy wytrąca się przy większym stężeniu w

postaci żółtego osadu.

*RCF (ang. Relative Centrifugal Force) – względna siła odśrodkowa wyrażająca wartość przyśpieszenia stosowaną do
wirowania próbek

Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe

3

2.3.3.

W

YKRYWANIE ZASAD AZOTOWYCH

Zasady azotowe – heterocykliczne związki pierścieniowe – reagują z jonami Ag

+

lub Cu

+

tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.

Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA oraz stężonego

amoniaku do uzyskania słabo alkalicznego odczynu (kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Jeżeli roztwór nie jest

klarowny, należy go przesączyć. Następnie do klarownego przesączu dodać 0.5 ml 1% AgNO

3

. Wytrąca się osad

nierozpuszczalnych soli srebrowych puryn.

Do drugiej probówki dodać 1 ml hydrolizatu RNA a następnie 1 M NaOH od słabo kwaśnego odczynu (kontrolować

papierkiem wskaźnikowym). Po zagotowaniu roztworu dodać 0.5 ml 2% CuSO

4

a następnie wprowadzić kroplami nasycony

NaHSO

3

aż do wytrącenia osadu nierozpuszczalnych soli miedziawych. Kwaśny siarczyn sodowy redukuje jony Cu

2+

do Cu

+

,

które z purynami tworzą nierozpuszczalne sole miedziawe.

3.

O

DRÓŻNIANIE

RNA

OD

DNA

Reakcje pozwalające zidentyfikować i odróżnić roztwór RNA od DNA bazują na obecności różnych cukrów w cząsteczkach tych kwasów

nukleinowych: DNA zawiera deoksyrybozę, RNA – rybozę. Ryboza w odróżnieniu od deoksyrybozy zawiera grupę hydroksylową przy

węglu C2.

3.1.

M

ETODA ORCYNOWA

–

PRÓBA

B

IALA

Próba Biala jest kolejną reakcją stosowaną do odróżniania pentoz od heksoz. Pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach) ogrzewane

ze stęż. HCl ulegają cyklizacji do furfuralu (patrz: Ćw. 9 Analiza monosacharydów), który w obecności jonów Fe

3+

kondensuje z orcyną,

tworząc związek barwy zielonej. Kwas DNA zawierający deoksyrybozę w próbie Biala daje wynik ujemny.

Wykonanie:

Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej 1 ml 0.1% DNA, a

następnie do każdej po 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika orcynowego*. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej

na 15 min. Roztwór RNA barwi się na oliwkowozielono.

3.2.

M

ETODA Z DIFENYLOAMINĄ

–

PRÓBA

D

ISCHEGO

Deoksyryboza (wolna i związana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloaminą związek barwny. RNA, zawierający rybozę oraz

deoksyryboza związana w nukleotydach pirymidynowych dają wynik ujemny w tej reakcji.

Wykonanie:

Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej – 1 ml 0.1 % DNA, a

następnie do każdej po 1 ml 1% odczynnika difenyloaminowego** i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

W probówce zawierającej roztwór DNA powstaje niebieskie zabarwienie.

*

odczynnik orcynowy: nietrwały, bezpośrednio przed użyciem zmieszać: 1 ml roztworu A (6% orcyna w 96% etanolu) oraz 15 ml

roztworu B

(10% FeCl

3

w stęż. HCl). Objętość wystarczająca na 3 podgrupy do doświadczenia 3.1 oraz 4 (ślepa oraz próbki badane).

**

odczynnik difenyloaminowy: 1 g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml lodowatego CH

3

COOH zawierającego 2.75 ml stęż. H

2

SO

4

.

Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe

4

4.

A

NALIZA ILOŚCIOWA

RNA

METODĄ KOLORYMETRYCZNĄ Z ORCYNĄ

Stężenie RNA można oznaczyć mierząc ilość rybozy uwolnionej podczas ogrzewania RNA ze stęż. HCl. Zawartość powstałego w

obecności jonów Fe

3+

kompleksu furfural-orcyna barwiącego roztwór na kolor oliwkowozielonej mierzy się przy dł. fali 660 nm.

Wykonanie: przygotować pięć krótkich szklanych probówek. Do pierwszej z nich dodać 0.6 ml wody (próba ślepa, Ø), w

pozostałych przygotować po dwa rozcieńczenia próbek badanych P1 (P1.1, P1.2) i P2 (P2.1, P2.2) wg Tabeli 2. Do każdej

probówki dodać po 0.6 ml odczynnika orcynowego przygotowanego bezpośrednio przed użyciem (str.3), zamieszać. W celu

uzyskania hydrolizatu RNA probówki inkubować 20 min we wrzącej łaźni wodnej (łaźni nie przykrywać!). Probówki oziębić w

zlewce z zimną wodą. Oznaczoną pipetą automatyczną przenieść po 200 µl roztworu z każdej szklanej probówki do dołków

w płytce titracyjnej. W czytniku do płytek titracyjnych zmierzyć absorbancję próbek P1 i P2 wobec ślepej odczynnikowej przy

dł. fali 660 nm (płytkę przed wyciągnięciem spod dygestorium przykryć pokrywką, pomiaru dokonywać nie odkrywając płytki).

Po wykonaniu pomiaru absorbancji, wartości OD dla próbek badanych pomniejszyć o wartość OD dla ślepej korzystając z

opcji: "OD – blank" w programie KC4.

Do sporządzenia próbek wzorcowych użyto 1% roztworu RNA, który rozcieńczono zgodnie z Tabelą 1. W tabeli podano

również trzy różne zestawy wartości absorbancji do wykreślenia krzywej kalibracyjnej przez każdą z podgrup.

Tab. 1.

p

ró

b

k

i

w

z

o

rc

o

w

e

symbol

obj. wody

[ml]

obj. r-ru

wzor. RNA

[ml]

ilość RNA

w obj. 0.6 ml

[mg]

stężenie RNA

[mg/ml]

OD

660

I

II

III

Ø

0

0

0

0

0

W1

0.5

0.1

0.205

0.197

0.211

W2

0.4

0.2

0.428

0.384

0.404

W3

0.3

0.3

0.673

0.706

0.723

W4

0.2

0.4

0.904

0.883

0.912

W5

0.1

0.5

1.125

1.009

1.112

W6

0

0.6

1.341

1.184

1.295

Przed przygotowaniem obydwu powtórzeń dla próbki badanej P2 zgodnie z Tab.2, próbkę należy rozcieńczyć dwukrotnie.

Tab. 2.

p

ró

b

k

i

b

a

d

a

n

e

symbol

obj. wody

[ml]

obj. próbki

[ml]

OD

660

ilość RNA w

próbce badanej

odczytana z

krzywej [mg]

rozcieńczenie

próbki przed

pomiarem

stężenie białka

[mg/ml]

średnie

stężenie białka

[mg/ml]

P1.1

0.5

0.1

P1.2

0.1

0.5

P2.1

0.5

0.1

P2.2

0.1

0.5

Na podstawie wartości absorbancji uzyskanej dla obydwu powtórzeń próbek badanych P1 i P2 z krzywej wzorcowej należy

odczytać ilość RNA oraz obliczyć stężenie RNA w P1 i P2.

Biochemia: Ćw. 11 – Kwasy nukleinowe

5

5.

P

RECYPITACJA

DNA

Precypitacja (strącanie) kwasów nukleinowych z użyciem środków odwadniających jest jednym ze sposobów zagęszczenia roztworów tych

związków. Najczęściej do precypitacji używa się alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Przy małych stężeniach wydajność precypitacji kwasu

nukleinowego zwiększa użycie schłodzonego alkoholu; samą precypitację też wykonuje się w niskiej temperaturze (4

°

C lub -20

°

C).

Wykonanie: Przygotować sterylną probówkę typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100 µl 0.1% roztworu wyjściowego DNA

dodać 10 µl 3M CH

3

COONa, pH 5.2 (RT*) oraz 250 µl 96% etanolu (z -20°C). Wymieszać dokładnie i inkubować przez 30

min w temp. -20°C. Wytrącone DNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Zebrać dokładnie nadsącz końcówką kapilarną

a peletę przemyć 250 µl 70% etanolu (RT). Ponownie zwirować przez 10 min, 13000 RCF, RT. Po dokładnym zebraniu

nadsączu końcówką kapilarną peletę wysuszyć na powietrzu (ok.10 min) a następnie rozpuścić w 10 µl wody dejonizowanej.

6.

O

KREŚLENIE STĘŻENIA

DNA

METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ

W celu określenia odzysku DNA zmierzyć jego stężenie metodą spektrofotometryczną w świetle UV w roztworze wyjściowym oraz

roztworze 10-krotnie zagęszczonym po precypitacji.

Wykonanie: Przygotować trzy probówki typu Eppendorf o poj. 0.5 ml. Do pierwszej (próby ślepej) dodać 100 µl wody wolnej

od RNaz a do drugiej i trzeciej po 99 µl wody wolnej od RNaz. Do drugiej dodatkowo 1 µl roztworu wyjściowego DNA (przed

precypitacją), do trzeciej - 1 µl roztworu DNA po precypitacji. Zmierzyć absorbancję względem próby ślepej przy dł. fali 260

nm (spektrofotometr Bio-Rad). Spektrofotometr w oparciu o zadaną wartość współczynnika konwersji (ang. conversion

factor, zwykle 1:50 µg/ml) oraz rozcieńczenie przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stężenie wyrażone w [µg/ml].

Policzyć ilość DNA [µg] w 100 µl roztworu wyjściowego oraz 10 µl 10-krotnie zagęszczonego roztworu po precypitacji

.

Na zajęciach obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne. Każda podgrupa zobowiązana

jest do przyniesienia na zajęciach zestawu do wykreślenia krzywej kalibracyjnej: papieru milimetrowego, linijki, krzywki, ołówka,

kalkulatora.

*RT (ang. Room Temperature) – temperatura pokojowa

W sprawozdaniu należy zamieścić:

Wyznaczenie stężenia RNA metodą orcynową w próbkach badanych P1 i P2.


Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005, rozdział pt. "DNA, RNA i przepływ informacji
genetycznej"

(lub

odpowiedni rozdział we wcześniejszych wydaniach).