Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe

1

K

WASY NUKLEINOWE

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:

amoniak

– C, N

azotan srebra

– C, N

błękit metylenowy

– Xn

chlorek żelaza

– Xn

difenyloamina

– T

etanol, 96%, 70%

– F

kwas azotowy(V),65% – C

kwas ortofosforowy

– C

kwas octowy, 96%

– C

kwas siarkowy, 95% – C

kwas solny

– C

wodorotlenek sodu

– C

siarczan dodecylu sodu – Xn

siarczan miedzi

– Xn

W komórkach organizmów eukariotycznych obecne są dwa typy kwasów nukleinowych:

- DNA (kwas deoksyrybonukleinowy, ang. deoxyribonucleic a

cid) zawiera cukier deoksyrybozę; przechowuje

informację genetyczną, występuje głównie w jądrze komórkowym, ponadto w mitochondriach i chloroplastach,

- RNA (kwas rybonukleinowy, ang. ribonucleic acid),

w skład którego wchodzi ryboza; bierze udział w translacji

białek; obecny w cytoplazmie (rRNA – rybosomalny kwas rybonukleinowy, ang. ribosomal RNA i tRNA –

transportujący kwas rybonukleinowy, ang. transfer RNA) oraz mRNA (matrycowy/informacyjny kwas

rybonukleinowy, ang. messenger RNA) prze

noszący informację o budowie białek z jądra do cytoplazmy.

Kwasy nukleinowe są biopolimerami nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w łańcuch

polinukleotydowy. Nukleotyd,

stanowiący jednostkę monomeryczną DNA i RNA, składa się z cząsteczki cukru,

zasady azotowej (purynowej: adeniny, guaniny lub pirymidynowej: cytozyny, tyminy, uracylu) oraz reszty

fosforanowej (Rys. 1).

Rys. 1. Struktura rybonukleotydu.

Nukleotydy to mono

fosforany nukleozydów; w tabeli 1 zebrano nazwy nukleozydów i nukleotydów. W organizmie

człowieka nukleotydy są składnikami kwasów nukleinowych, jak również występują w postaci wolnej, pełniąc

szereg ważnych funkcji w przemianach metabolicznych.

Tab. 1. Nomenklatura nukleozydów i nukleotydów kwasów nukleinowych.

* tymidyna występuje wyłącznie w DNA, więc zwyczajowo nie dodaje się przedrostka deoksy

zasady azotowe

nazwy nukleozydów

nukleotydy

nazwa

symbol

nazwa

symbol

pu

ry

ny

adenina

A

(deoksy)adenozyna

(deoksy)adenozynomonofosforan

(d)AMP

guanina

G

(deoksy)guanozyna

(deoksy)guanozynomonofosforan

(d)GMP

pi

ry

m

id

yn

y

cytozyna

C

(deoksy)cytydyna

(deoksy)cytydynomonofosforan

(d)CMP

tymina

T

tymidyna *

tymidynomonofosforan *

TMP *

uracyl

U

urydyna

urydynomonofosforan

UMP

zasada

azotowa

ortofosforan

cukier

Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe

2

1.

B

ADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH

1.1.

R

OZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH

Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają się

dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonych kwasach. W roztworach wodnych tworzą

układy koloidalne, z których można je wytrącić za pomocą czynników odwadniających, np. etanolu, izopropanolu.

Wykonanie

: Przygotować dwie szklane, krótkie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.5% roztworu RNA

a następnie 2 – 3 krople 2 M HCl. Wytraca się biały osad RNA. Po dodaniu 200 – 300



l 10% roztworu NaOH

osad ulega rozpuszczeniu. Do drugiej probówki dodać 1 ml 1% RNA, 200



l 3M CH

3

COONa oraz 1 ml 96%

etanolu (temp. -

20°C) – roztwór mętnieje, ponieważ wytrąca się osad RNA.

1.2.

T

WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BARWNIKAMI

W środowisku kwaśnym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe, tworząc połączenia typu soli, co

wykorzystuje się m.in. do wizualizacji jąder komórkowych w metodach histochemicznych.

Wykonanie:

Do szklanej krótkiej probówki dodać 0.5 ml 0.5% RNA a następnie 150 µl 1 M CH

3

COOH oraz 2-3

kropli 0.1% błękitu metylenowego (używając pipety do 100



l). Zawartość szklanej probówki przenieść do

probówki o pojemności 1.5 ml i zwirować. Po wirowaniu widoczny jest niebieski osad kompleksów RNA z błękitem

metylenowym.

1.3.

T

WORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAŁKAMI

Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi połączenia kompleksowe.

Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje się nasycone roztwory NaCl.

Wykonanie:

Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA oraz 300



l 1 M CH

3

COOH a następnie 100



l

3% roztworu BSA. Wytrąca się osad kompleksowego połączenia białka z RNA. W celu rozpuszczenia osadu

dodać 1 ml nasyconego roztworu NaCl.

2.

I

ZOLACJA I HYDROLIZA

KWASÓW NUKLEINOWYCH

Każda ze znanych metod izolacji kwasów nukleinowych wymaga zniszczenia błon lipidowych, prowadzącego do

lizy komórki oraz oddzielania izolowanej cząsteczki kwasu od pozostałych składników komórki. Ważnym

elementem preparatyki jest inaktywacja nukleaz

– enzymów odpowiedzialnych za degradację kwasów

nukleinowych.

W celu rozbicia błon biologicznych oraz jednocześnie denaturacji białek (w tym nukleaz) stosuje

się detergenty, np. silny anionowy detergent siarczan dodecylu sodu (SDS). Działanie inaktywujące nukleazy

mają również wersenian dwusodowy (EDTA), cytrynian sodu oraz fluorek sodu. Pozostałości komórek

i wytrącone białka usuwa się przez wirowanie. W kolejnym etapie uwolniony do roztworu kwas nukleinowy

zagęszcza się przez precypitację schłodzonym etanolem lub izopropanolem. Kolejne wirowanie pozwala na

pozbycie się dużej objętości rozpuszczalnika i zwiększenia jego stężenia przez rozpuszczenie w mniejszej

objętości.

Analiza poszczególnych komponentów cząsteczki kwasu nukleinowego wymaga jego hydrolizy, czyli rozerwania

wszystkich wiązań obecnych w tej makrocząsteczce. W przypadku DNA pierwszym etapem jest zniszczenie

wiązań wodorowych łączących komplementarne zasady. Zniszczeniu podczas hydrolizy ulegają również wiązania

fosfodiestrow

e łączące nukleotydy oraz glikozydowe pomiędzy zasadą azotową a cukrem. Kwasy nukleinowe

podczas gotowania (100ºC) z kwasami mineralnymi (np. 1 M HCl, 10% H

2

SO

4

, 60% HClO

4

) ulegają stopniowej

hydrolizie do

nukleotydów a przy wystarczająco długo prowadzonym ogrzewaniu w hydrolizacie uzyskujemy

wolne zasady azotowe, pentozy i kwas fosforowy.

Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe

3

2.1.

I

ZOLACJA

RNA

Z DROŻDŻY

Opisana poniżej metoda izolowania RNA polega na rozbiciu komórek drożdży, usunięciu z roztworu białek i DNA

za

pomocą anionowego detergentu – siarczanu dodecylu sodu (SDS) a następnie zagęszczeniu RNA przez

wytrącenie za pomocą etanolu.

Wykonanie: W

probówce wirowniczej o poj. 15 ml ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej 5 ml 5% roztworu SDS.

D

odać 1 g dokładnie rozdrobnionych drożdży piekarskich i ogrzewać przez 10 min mieszając bagietką. Probówkę

ochłodzić w zlewce z zimną wodą a następnie zwirować (3000 RCF*, 10 min, 4



C). Nadsącz zebrać do

schłodzonej w lodzie probówki wirowniczej o poj. 15 ml i dodać 96% etanolu (temp. -20ºC) w stosunku 1:1. Po

piętnastominutowej precypitacji w lodzie roztwór zwirować (3000 RCF, 10 min, 4



C).

A następnie usunąć

dokładnie supernatant (do pojemnika do utylizacji), natomiast osad wytraconego RNA rozpuścić w 5 ml 1 M

NaOH

(długa szklana próbówka).

*RCF (ang. relative centrifugal force)

– względna siła odśrodkowa wyrażająca wartość przyśpieszenia stosowaną do wirowania

próbek

2.2.

H

YDROLIZA KWASOWA

RNA

Wykonanie: Do

roztworu RNA wyizolowanego z drożdży dodać 10% H

2

SO

4

w stosunku 1:1. Po wymieszaniu

podzi

elić roztwór do dwóch probówek (tak, by podczas hydrolizy poziom roztworów był na wysokości wody

w łaźni) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min. Po ostudzeniu w zlewce z zimną wodą hydrolizat RNA

przefiltrować a następnie przeprowadzić na nim reakcje pozwalające na identyfikację poszczególnych składników

(pkt. 2.3).

2.3.

W

YKRYWANIE

SKŁADNIKÓW HYDROLIZATU

RNA

2.3.1.

W

YKRYWANIE PENTOZY

–

REAKCJA

T

OLLENSA

W obecności stężonych kwasów mineralnych z pentozy powstaje z furfural (patrz: Ćw.8 Analiza

mon

osacharydów), który kondensując z floroglucyną (fenol) tworzy związek barwy czerwonej. Reakcja Tollensa,

podobnie jak próba Taubera, służy do odróżniania pentoz od heksoz.

Wykonanie:

Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA a do drugiej

1 ml 1% roztworu glukozy. Następnie do obydwu po 1 ml stężonego HCl i kilka kryształków floroglucyny.

Roztwory

ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Hydrolizat RNA zawierający pentozy zabarwia się na czerwono

a

roztwór glukozy na żółtobrunatno.

2.3.2. W

YKRYWANIE RESZTY FOSFORANOWEJ

Obecny w hydrolizacie RNA kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO

3

, co prowadzi do

powstania żółtego osadu fosfomolibdenianu amonu.

Wykonanie:

Przygotować dwie krótkie szklane probówki. 0.5 ml hydrolizatu RNA zobojętnić amoniakiem (150 –

200



l, kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Dodać 0.5 ml stęż. HNO

3

oraz 2 ml 2.5% molibdenianu

amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstający fosfomolibdenian amonowy

wytrąca się przy większym stężeniu w postaci żółtego osadu. Równocześnie wykonać kontrolę z 5% kwasem

ortofosforowym.

2.3.3.

W

YKRYWANIE ZASAD AZOTOWYCH

Zasady obecne w kwasach nukleinowych

są heterocyklicznymi związkami pierścieniowymi zawierającymi atomy

azotu. R

eagują z jonami metali Ag

+

lub Cu

+

tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.

Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe

4

Wykonanie:

Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA oraz

stężonego amoniaku do uzyskania słabo alkalicznego odczynu (kontrolować papierkiem wskaźnikowym). Jeżeli

roztwór nie jest klarowny, należy go przesączyć. Następnie do klarownego przesączu dodać 0.5 ml 1% AgNO

3

.

Wytrąca się delikatny osad nierozpuszczalnych soli srebrowych puryn (oglądać w świetle lampki). Równocześnie

wykonać kontrolę z 0.1% roztworem adeniny (z pominięciem alkalizacji roztworu).

Identyfikację składników hydrolizatu RNA wykonujemy na gotowych hydrolizatach. Po przygotowaniu własnego

hydrolizatu należy wykonać przynajmniej jedną z reakcji weryfikującą skuteczność preparatyki i hydrolizy RNA.

3.

O

DRÓŻNIANIE

RNA

OD

DNA

Opisane poniżej reakcje pozwalające zidentyfikować i odróżnić roztwór RNA od DNA bazują na obecności

różnych cukrów w cząsteczkach tych kwasów nukleinowych. Ryboza obecna w cząsteczce RNA w odróżnieniu

od deoksyrybozy

występującej w DNA zawiera grupę hydroksylową przy węglu C2.

3.1.

M

ETODA ORCYNOWA

–

PRÓBA

B

IALA

Próba Biala jest reakcją kondensacyjną, w której pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach purynowych)

ogrzewane ze stężonym HCl ulegają cyklizacji do furfuralu (patrz: Ćw. 8 Analiza monosacharydów). Furfural

w obecności jonów Fe

3+

kondensuje z orcyną, tworząc związek barwy zielonej. Deoksyryboza również reaguje

z oryną, ale 10-krotnie słabiej, dlatego przyjmuje się, że DNA w próbie Biala daje wynik ujemny.

Wykonanie:

Bezpośrednio przed użyciem zmieszać: 0.4 ml roztworu A (6% orcyna w 96% etanolu) oraz 5.6 ml

roztworu B (10% FeCl

3

w stężonym HCl). Uzyskujemy objętość wystarczającą do przeprowadzenia 6 reakcji (dla

3

podgrup). Następnie przygotować dwie, długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do

drugiej 1 ml 0.1% DNA oraz po 1 ml odczynnika orcynowego

do każdej. Probówki umieścić we wrzącej łaźni

wodnej na 10

min. Roztwór RNA barwi się na oliwkowozielono.

3.2.

M

ETODA Z DIFENYLOA

MINĄ

–

PRÓBA

D

ISCHEGO

Deoksyryboza (wolna i związana w nukleotydach purynowych) w środowisku kwaśnym tworzy z difenyloaminą

związek barwny. RNA zawierający rybozę oraz deoksyryboza związana w nukleotydach pirymidynowych dają

wynik ujemny w tej reakcji.

Wykonanie:

Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej – 1 ml

0.1 % DNA, a następnie do każdej po 1 ml 1% odczynnika difenyloaminowego (1% difenyloamina w roztworze

lodowatego CH

3

COOH zawierającym stężony H

2

SO

4

) i um

ieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

Roztwór DNA barwi się na niebiesko.

4.

W

IDMA ABSORPCYJNE ZASAD AZOTOWYCH

I NUKLEOTYDÓW

Kwasy nukleinowe absorbują światło z zakresu ultrafioletu dzięki obecności w ich cząsteczkach heterocyklicznych

zasad azotowych

zawierających sprzężone wiązania podwójne. Każda z zasad posiada charakterystyczne dla

siebie widmo z maksimum absorbancji

przypadającym przy danej długości fali. Długość fali, przy której dana

zasada absorbuje najmocniej UV zmienia się w zależności od pH roztworu. Maksimum absorbancji dla kwasów

nukleinowych (260 nm)

jest wypadkową absorbancji budujących go zasad azotowych. Zdolność absorpcji

ultrafioletu przez kwasy nukleinowe wykorzystywana jest do wyznaczania ich stężenia oraz czystości metodą

spektrofotometryczną.

Wykonanie:

Dokona

ć pomiarów absorbancji roztworów adeniny, tyminy oraz adenozyno-5'-trifosforanu (ATP)

w 0.1M HCl

względem rozpuszczalnika w zakresie widma 230-290 nm zmieniając długość fali co 5 nm. Następnie

Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe

5

zmierzyć OD roztworu adeniny w 0.1M NaOH względem rozpuszczalnika. Pomiary wykonać w spektrofotometrze

przeznaczonym

do mikroobjętości Thermo Scientific Nano-Drop 2000 umieszczając 2



l roztwor

ów na statywie

pomiarowym pomiędzy dwoma włóknami światłowodowymi. Wyniki wprowadzić do tabeli 2.

Tab. 2

. Dane pomiarowe do wykreślenia widm absorpcyjnych zasad azotowych i nukleotydu.

LP



[nm]

adenina

w

tymina

w

0.1M HCl

ATP

w

0.1M HCl

0.1M HCl

0.1M NaOH

1.

230

2.

235

3.

240

4.

245

5.

250

6.

255

7.

260

8.

265

9.

270

10.

275

11.

280

12.

285

13.

290

Na wspólnym wykresie narysować krzywe absorbancji adeniny (w różnym pH roztworu), tyminy i ATP. Na

podstawie wykre

ślonych widm:

-

porównać ich kształt oraz intensywność pochłaniania UV przez zasadę purynową i pirymidynową a także

zasadę azotową wolną i w postaci nukleotydu,

- wyzn

aczyć długości fali, przy których obserwuje się maksima absorpcji dla badanych związków,

- p

rzeprowadzić dyskusję uzyskanych wyników w kontekście danych literaturowych.

Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN, W-wa 2005;

rozdział pt. "DNA, RNA i przepływ informacji

genetycznej" (lub odpowiedni rozdział we wcześniejszych lub późniejszych wydaniach)

"Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008;

rozdział dot. nukleotydów

oraz struktury i funkcji

kwasów nukleinowych