Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii

Ć

wiczenie 10

Enzymologia 2010

1

Ćwiczenie 10. Oznaczanie stężenia fosforanów.

1. Wstęp

Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawę ilościowego

oznaczania substancji w roztworze stanowi prosta zależność między intensywnością

zabarwienia roztworu, a stężeniem zawartej w nim substancji (prawo Lamberta-Beera).

A =

εεεε

××××

C

××××

l

lub

gdzie:
A – absorbancja,

ε

– molowy współczynnik absorpcji

1

,

C – stężenie molowe substancji absorbującej w roztworze,
l – droga optyczna (grubość warstwy roztworu),
I

1

– natężenie światła padającego,

I

2

– natężenie światła, które przeszło przez roztwór.

Metodami kolorymetrycznymi można oznaczać zarówno stężenia substancji barwnych, jak

i substancji bezbarwnych, które na drodze stechiometrycznej reakcji chemicznej

przeprowadza się w związki barwne. Reakcja barwna musi szybko przebiegać do końca,

a powstałe zabarwienie winno być dostatecznie trwałe, czyli niewrażliwe na działanie światła

i mało zależne od zmian pH, temperatury, nadmiaru odczynnika itp. Ważne jest również, aby

odczynnik reagował jedynie z substancją badaną i nie dawał barwy z żadną inną substancją

obecną w roztworze (tj. aby reakcja była specyficzna). W niektórych przypadkach, w celu

oznaczenia stężenia próbki metodą kolorymetryczną potrzebny jest standard, który służy do

przygotowania tzw. krzywej standardowej (wzorcowej).

Krzywa kalibracyjna (wzorcowa)

Krzywa kalibracyjna podaje zależność między absorbancją a stężeniem lub licznością

substancji w próbce (jeśli roztwór podlega prawu Lamberta-Beera, krzywa kalibracyjna jest

linią prostą przechodzącą przez punkt przecięcia się osi układu współrzędnych).

Przygotowuje się ją przez wykonanie pomiarów absorbancji dla kilku lub kilkunastu stężeń

wzorca i wykreśla się krzywą odkładając na osi odciętych stężenia lub ilość substancji,

1

Jeżeli stężenie wyrażamy w gramach na litr roztworu, a grubość warstwy absorbującej w centymetrach,

to współczynnik ten nosi nazwę właściwego współczynnika absorpcji (E).

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii

Ć

wiczenie 10

Enzymologia 2010

2

a na osi rzędnych – odpowiednie wartości absorbancji (Rys.1.). Stężenie substancji w próbie

badanej odczytuje się z krzywej kalibracyjnej przez interpolację, biorąc pod uwagę wartość

absorbancji tej próby.

Rys.1. Krzywa kalibracyjna

Należy pamiętać, aby standard przygotowywać zawsze „na świeżo” i w identycznym buforze

jak oznaczana próbka [1].

Fosfor (gr. phosphoros – "niosący światło")

Fosfor należy do grupy makroelementów. W organizmie człowieka znajduje się około 700 g

fosforu, z czego 75 % występuje w kościach, a pozostała cześć rozmieszczona jest w

mięśniach, układzie nerwowym, we krwi i innych płynach ustrojowych. Związki fosforu

odgrywają podstawową rolę w przemianach energetycznych ustroju, w utrzymaniu

równowagi

kwasowo-zasadowej

(działają

jako

bufory),

wzmagają

pobudliwość

nerwowo-mięśniową i są składnikami tak ważnych fizjologicznie związków jak: kwasy

nukleinowe, białka, koenzymy czy lipidy złożone [4, 5, 6, 7].

Oznaczanie grup fosforanowych

Grupy fosforanowe oznacza się wyłącznie metodami kolorymetrycznymi i tylko w formie

ortofosforanowej (V). Ogólna zasada oznaczania polega na wytwarzaniu się w środowisku

kwasowym w reakcji z molibdenianem (VI) amonu cztero(trójmolibdeniano)fosforanu

amonowego (NH

4

)

3

P(Mo

3

O

10

)

4

, który może być redukowany do błękitu molibdenowego

(mieszanina niższych tlenków molibdenu) o niebieskim zabarwieniu. Poszczególne metody

różnią się od siebie tylko warunkami redukcji. Jako reduktory stosowane są najczęściej:

eikonogen (kwas 1-amino-2-naftalo-4-sulfonowy), chlorek cyny(II), amidol, hydrochinon

i kwas askorbinowy [2, 3].

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii

Ć

wiczenie 10

Enzymologia 2010

3

2. Cel ćwiczenia:

Zapoznanie się z metodą oraz określenie stężenia grup fosforanowych w próbce otrzymanej

do analizy.

3. Odczynniki, szkło, aparatura:

1 M HCl,

1 M KH

2

PO

4

(roztwór wzorcowy),

10 % roztwór wodny kwasu askorbinowego,

0,42 % roztwór molibdenianu amonu w 0,5 M H

2

SO

4

(1:6 v/v),

próbka do analizy,

łaźnia wodna,

spektrofotometr,

kuwety pomiarowe,

parafilm,

zlewki,

probówki.

4. Sposób wykonania ćwiczenia

Uwagi:

Zanotować numer próbki otrzymanej.

Przed wykonaniem ćwiczenia umyć probówki dobrze wypłukując detergent

(niektóre detergenty mogą zawierać fosforany!).

Wykonać wszelkie obliczenia potrzebne do wykonania ćwiczenia (wyjaśnia

prowadzący).

Próbki potrzebne do przygotowania krzywej standardowej oraz próbkę analizowaną

należy przygotowywać równolegle.

Oprócz próbek wzorca i do analizy należy przygotować dwa odnośniki potrzebne przy

zerowaniu aparatu („próbka 0”).

Krzywa standardowa:

Roztworem wzorcowym jest 1M roztwór KH

2

PO

4

.

W celu sporządzenia krzywej standardowej należy przygotować szereg rozcieńczeń
(6-10) roztworu wzorcowego (0,1 – 1 mM; 5-50 nmola) w objętości końcowej 50

µ

l.

Wykonać test według podanego poniżej przepisu.

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z Enzymologii

Ć

wiczenie 10

Enzymologia 2010

4

Przygotowanie próbki analizowanej:

Zaplanować cztery rozcieńczenia próby badanej, tak aby znaleźć się w przedziale

krzywej standardowej .

Wykonanie testu:

Przygotować zaplanowane rozcieńczenia wzorca i próby badanej w wysokich

probówkach (proszę pamiętać o przygotowaniu 2 probówek na odnośnik potrzebny do
zerowania aparatu).

Do wszystkich probówek dodać po 300

µ

l 1M HCl.

Umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez 15 minut.

Po ostudzeniu, dodać po 700

µ

l mieszaniny: 10 % wodnego roztworu kwasu

askorbinowego i 0,42 % roztworu molibdenianu amonu w 0,5 M H

2

SO

4

(1:6 v/v).

Próbki przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 45

°

C i inkubować przez 20 minut.

Do każdej probówki dodać 1 ml wody destylowanej.

Odczytać absorbancję przy długości fali 820 nm wobec „próbki 0”.

Aby oznaczyć stężenie jonów fosforanowych w próbce, należy wykreślić krzywą
standardową i na jej podstawie określić stężenie roztworu wyjściowego próby badanej.

5. Opracowanie wyników

Wyniki należy opracować w postaci sprawozdania, które powinno składać się z pięciu części:
protokołu, przykładowych obliczeń, wyników z ich opracowaniem, obserwacji i wniosków.
W sprawozdaniu, proszę koniecznie wpisać imię i nazwisko wszystkich osób z trzyosobowej
grupy, dzień tygodnia i godzinę zajęć, datę wykonania ćwiczenia oraz nazwisko osoby, do
której są Państwo zapisani na zajęcia.

6. Literatura

1.

„Ćwiczenia z biochemii” pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN W-wa 2003

2.

Chen, P.S., Toribara, T.Y. i Warner, H., (1956) „Microdetermination of phosphorus.”
Analyt.Chemistry 28:1756-58

3.

Ames, B.N. i Dubin, D.T., (1960) „The Role of Polyamines in the Neutralization
of Bacteriophage Deoxyribonucleic Acid.” J Biol Chem 235(3), 769-775

4.

Yu, G.C. i Lee, D.B. (1987) „Clinical disorders of phosphorus metabolism.”
West J Med. 147(5):569-76

5.

Cashman, K.D. i Flynn, A. (1999) „Optimal nutrition: calcium, magnesium and
phosphorus.” Proc Nutr Soc. 58(2):477-87

6.

Berndt, T.J., Schiavi, S. i Kumar, R. (2005) „"Phosphatonins" and the regulation
of phosphorus homeostasis.” Am J Physiol Renal Physiol. 289(6):F1170-82

7.

Shaikh, A., Berndt, T. i Kumar, R. (2008) „Regulation of phosphate homeostasis
by the phosphatonins and other novel mediators.” Pediatr Nephrol. 23(8):1203-10.