Postępy Biochemii 58 (4) 2012

465

Paweł Pomorski

1,2,

1

Środowiskowe Multimodalne Laboratorium

Adhezji i Ruchu Komórek, Konsorcjum Nano-

BioGeo, projekt NanoFun, Instytut Biologii Do-

świadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Warszawa

2

Pracownia Molekularnych Podstaw Ruchu

Komórek, Zakład Biochemii, Instytut Biologii

Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, War-

szawa



Instytut Biologii Doświadczalnej im. M.

Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093

Warszawa, e-mail: [e-mail]

Artykuł otrzymano 2 października 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 22 października

2012 r.

Słowa kluczowe: wapń, przekazywanie sy-

gnałów, obrazowanie, mikroskopia

Wykaz skrótów: BRET (ang. Bioluminescence

Resonance Energy Transfer) — transfer ener-

gii wzbudzenia bioluminescencyjnego; CFP

(ang. Cyan Fluorescence Protein) — błękitne

białko fluorescencyjne; FRET (ang. Fluorescence

Resonance Energy Transfer, Förster Resonance

Energy Transfer) — transfer energii przez re-

zonans Förstera, tutaj rozwijany jako transfer

energii wzbudzenia fluorescencyjnego dla

odróżnienia od BRET; GFP (ang. Green Fluores-

cence Protein) — zielone białko fluorescencyjne;

YC (ang. Yellow Cameleon) — Cameleon o żółtej

emisji światła; YFP — żółte białko fluorescen-

cyjne (ang. Yellow Fluorescence Protein)

Podziękowania: Artykuł współfinansowany

ze środków Europejskiego Funduszu Rozwo-

ju Regionalnego w ramach Programu Opera-

cyjnego Innowacyjna Gospodarka NanoFun

POIG.02.02.00-00-025/09. Autor wyraża rów-

nież serdeczne podziękowania dr Dorocie Wy-

pych za czas poświęcony na lekturę rękopisu

i liczne uwagi, które czynią tekst bardziej zro-

zumiałym.

Zobaczyć sygnał — metody obrazowania zmian

stężenia jonów wapnia w komórce

StreSzczenie

J

ony wapnia są jednymi z najpopularniejszych wtórnych przekaźników sygnału w świe-

cie ożywionym. Opracowane w ostatnich trzydziestu latach metody wizualizacji stężenia

jonów wapnia w roztworze pozwalają ten sygnał obserwować w żywych komórkach, tkan-

kach czy też całych organizmach. Poniższy artykuł przedstawia dostępne dziś narzędzia do

obrazowania sygnału wapniowego

in vivo, zarówno związki chemiczne używane jako sondy

wapniowe jak też ich metody wizualizacji i kalibracji wyników.

WPrOWadZenie

Koordynacja i synchronizacja licznych procesów chemicznych, składających

się na funkcjonowanie organizmów wymusiła powstanie wyspecjalizowanych

mechanizmów przekazywania sygnałów pomiędzy otoczeniem komórki a jej

wnętrzem, jak również pomiędzy przedziałami komórkowymi. Sygnały te są

siłą rzeczy przejściowe i ich badanie wymaga innych metod niż te, używane

do poznawania struktury, czy też metabolizmu komórki. Jednym z najbardziej

uniwersalnych i powszechnych typów sygnalizacji komórkowej jest uwalnia-

nie jonów wapnia do cytoplazmy [1]. Mimo, że analityczne oznaczanie stężenia

jonów nieorganicznych wydaje się z punktu widzenia chemii zadaniem raczej

nietrudnym, to okazuje się, że metody te kompletnie zawodzą przy próbach ob-

serwacji sygnału wapniowego w komórkach. Dzieje się tak z kilku przyczyn. Po

pierwsze, sygnał wapniowy jest wzrostem stężenia wolnych jonów wapnia w

cytoplazmie a nie wzrostem całkowitej ilości wapnia w komórce. Każda żywa

komórka zawiera znaczną ilość wapnia związaną w kompleksie z buforem biał-

kowym [2] i zamkniętą w tak zwanych wewnątrzkomórkowych magazynach

wapnia [3] (głównie siateczce śródplazmatycznej). Pomiar stężenia jonów wap-

nia w lizatach komórkowych nie jest zatem narzędziem odpowiednim do bada-

nia sygnału wapniowego. Badaczom tego sygnału pozostają zatem metody po-

zwalające na bezpośredni pomiar jonów wapnia w roztworze: elektrofizjologicz-

ne i fluorescencyjne. W bieżącym artykule autor zamierza pokrótce przedstawić

metody pomiaru stężenia jonów wapniowych przy pomocy fluorescencyjnych

sond molekularnych. Nacisk zostanie przy tym położony na metody pomiaru

pozwalające na obrazowanie rozkładu sygnału wewnątrz komórki, choć metody

fluorescencyjne mogą być również używane do pomiarów fluorymetrycznych.

Mówiąc o obrazowaniu sygnału wapniowego trzeba jednak zdawać sobie

sprawę z jednego, podstawowego ograniczenia: wszelkie metody obrazowania

są relatywnie wolne w porównaniu z metodami elektrofizjologicznymi. W przy-

padku pomiarów kalibrowanych, wymagających rejestracji więcej niż jednego

obrazu by określić rozkład stężenia wapnia, częstotliwość obrazowania rzędu

dwudziestu map tego rozkładu na sekundę można uznać za wysoką. Metody te

doskonale nadają się do badania sygnałów wapniowych pochodzących od po-

budzenia receptorów metabotropowych, których czas trwania mierzony jest w

sekundach lub minutach, i do takich pomiarów są najczęściej używane [4]. Trud-

niej natomiast obrazować zmiany stężenia jonów wapnia związane z potencjała-

mi czynnościowymi, których czas trwania mierzony jest w milisekundach. Nie

znaczy to wcale, że takie pomiary są niemożliwe. Smetters i inni pokazali, że

choć wzrost stężenia jonów wapnia obserwowany po pobudzeniu neuronu na-

stępuje bardzo szybko, to sam sygnał wapniowy trwa dłużej niż związany z nim

potencjał co pozwala na obrazowanie odpowiedzi pojedynczych neuronów [5].

Metody obrazowania są użyteczne zwłaszcza tam, gdzie występują ciągi

pobudzeniowe (w postaci szeregu szybko następujących po sobie potencjałów

czynnościowych), prowadzące do całkowania sygnału wapniowego w cytopla-

zmie przez dodawanie do siebie skutków kolejnych pobudzeń [6], a różniczko-

wanie krzywych stężenia jonów wapnia pozwala precyzyjnie określić momenty

466

www.postepybiochemii.pl

występowania poszczególnych potencjałów w ciągu [5].

Wydłużenie sygnału wapniowego w stosunku do depolary-

zacji błony pozwala też wizualizować metodą obrazowania

wapniowych sond molekularnych pobudzenia wapniowe

mięśni [7].

WcZeSne OPtycZne metOdy badania Stężenia

jOnóW WaPnia: Od akWOryny dO Quin-2

Historia obrazowania stężenia jonów wapnia w komór-

kach wiąże się z powstaniem samej koncepcji sondy mole-

kularnej: wprowadzanej do układu cząsteczki pozwalają-

cej na nieinwazyjny pomiar parametru środowiska przez

obserwację zmian jej właściwości fizycznych (takich jak

fluorescencyjne czy chemiluminescencyjne, ale nie tylko).

Pierwszą sondę molekularną, pozwalająca na optyczne mo-

nitorowanie zmian poziomu jonów wapnia stworzyła sama

natura. Na początku lat sześćdziesiątych ubiegłego wieku,

w cieśninie Juan de Fuca w stanie Waszyngton odkryto w

meduzach rodzaju Aequorea białko bioluminescencyjne —

akworynę [8]. Akworyna składa się z dwóch związków che-

micznych: białka apoakworyny i kofaktora zwanego kolen-

trazyną, który jest niezbędny by białko było zdolne do bio-

luminescencji. W sekwencji aminokwasowej apoakworyny

znajduje się domena EF-hand, charakterystyczna dla białek

wiążących wapń. Po związaniu jonu wapnia akworyna utle-

nia kolenterazynę, czemu towarzyszy emisja fotonu błękit-

nego światła (469 nm) [9]. Cechy te szybko wykorzystano w

pomiarach sygnału wapniowego. Kolenterazyna co prawda

ulega zużyciu podczas utleniania koniecznego do emisji fo-

tonu, ale jako że jest związkiem rozpuszczalnym w lipidach,

przenika przez błonę komórkową i łatwo ją uzupełniać pod-

czas trwania pomiaru. Akworyna okazała się doskonałym

narzędziem do pomiarów stężenia jonów wapnia, aczkol-

wiek zdecydowanie gorzej nadaje się do obrazowania roz-

kładu sygnału wapniowego w komórkach. Przyczyną tego

jest słaba wydajność emisji fotonów (jeden foton na tysiąc

utlenionych cząsteczek kolenterazyny). Bezwzględną zaletą

akworyny jest za to sam fakt, że jest ona białkiem. Jej se-

kwencja aminokwasowa może być modyfikowana tak, by

białko trafiało do określonych przedziałów komórkowych.

Ta ostatnia cecha pozwoliła, w trakcie ostatnich trzydzie-

stu lat, na używanie akworyny tam, gdzie chemiczne sondy

wapniowe nie docierają i gdzie stężenie jonów wapnia jest

wysokie, a więc na przykład do jego monitorowania w sia-

teczce śródplazmatycznej [10] lub w mitochondriach [11].

Niska wydajność spowodowała, że dziś z akworyną kon-

kurują sztuczne białka o funkcji sond wapniowych, których

sekwencje aminokwasowe zaprojektowano od podstaw, i

które zostaną omówione w dalszej części rozdziału.

Podczas gdy akworyna powstała w trakcie milionów lat

ewolucji, tak zwane chemiczne sondy wapniowe zostały

skonstruowane przez człowieka. Wywodzący swą struk-

turę od EGTA, Quin-2 (Ryc. 1) był pierwszym prawdziwie

funkcjonalnym, fluorescencyjnym związkiem, zmienia-

jącym wydajność kwantową fluorescencji po związaniu

jonu wapnia [12]. Aby sonda wapniowa była użyteczna

jako narzędzie w biologii komórki należało znaleźć metodę

wprowadzenia jej do cytoplazmy, pokonując barierę błony

plazmatycznej komórki. Taka metoda została opracowana

dwa lata po stworzeniu sondy Quin-2 i polegała na estryfi-

kacji czterech grup COOH barwnika grupą acetylometylo-

wą. Związek stawał się wówczas słabo hydrofobowy, choć

rozpuszczony w DMSO lub metanolu mieszał się z wodą,

pozostając nadal zdolnym do przenikania do komórki. W

cytoplazmie znajdują się niespecyficzne esterazy, które hy-

drolizują wiązanie estrowe. W konsekwencji, sonda znów

staje się hydrofilowa i pozostaje wewnątrz komórki. W ten

sposób wystarczy dodać formy acetylometylowej barwnika

(w tym wypadku zwie się ona Quin-2 AM) do hodowli ko-

mórek i poczekać, a sonda molekularna sama do nich wnik-

nie [13]. Ten genialny pomysł do dziś jest wykorzystywany

z powodzeniem, gdyż wszystkie chemiczne sondy wapnio-

we dziedziczą po EGTA cztery grupy karboksylowe, które

można estryfikować grupą acetylometylową.

Prócz zastosowania estrów acetylometylowych, wciąż

używane są inne metody wprowadzania sond chemicznych

do badanych komórek. W szeregu przypadków jedynym

rozwiązaniem jest mikroiniekcja, zwłaszcza w tych ko-

mórkach, które mają esterazy na zewnętrznej powierzch-

ni błony komórkowej lub płaszcza glikoproteinowego, jak

na przykład wiele z pierwotniaków. W takich komórkach

grupy AM zostają odcięte przed przekroczeniem bariery,

jaką stanowi błona lipidowa i jedynym sposobem na wpro-

wadzenie cząsteczek hydrofilowych do cytoplazmy jest

bezpośrednie ich wstrzyknięcie [14]. Podczas badań elek-

trofizjologicznych stosuje się również wprowadzanie sond

jonowych z wykorzystaniem pipet patch-clamp, co pozwala

na jednoczesny pomiar błonowego równoległy pomiar stę-

żenia jonów wapnia w cytoplazmie i zjawisk elektrofizjo-

logicznych na błonie komórkowej [15]. Pozostałe metody,

EGTA

Quin 2

Fura-2

rycina 1. Struktura chemicznych sond wapniowych i ich pokrewieństwo z che-

latorem wapnia — EGTA. Od góry wzory strukturalne EGTA, Quin 2 i Fura-2.

Widać wspólne cechy, w tym cztery naładowane grupy karboksylanowe i dwa

atomy azotu odpowiedzialne za kompleksowanie jonu wapnia. W sondach wap-

niowych dodano także pierścienie, w celu uzyskania właściwości fluorescencyj-

nych związku.

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

467

takie jak poddawanie komórek szokowi osmotycznemu

[16], znacznym przeciążeniom [17] czy fuzja z pęcherzyka-

mi zawierającymi sondę [18] zostały zarzucone ze względu

na małą skuteczność i inwazyjność.

POmiary ratiOmetrycZne —

barWniki Fura i indO

Opisane w poprzednim rozdziale sondy wapniowe były-

by wystarczającymi narzędziami do badania sygnału wap-

niowego w komórkach, gdyby nie skutki fizjologiczne tego

sygnału. Jak napisano we wstępie, stężenie jonów wapnia

reguluje bardzo wiele procesów zachodzących w organi-

zmach. Do tych procesów należy między innymi regulacja

struktury i kurczliwości cytoszkieletu, czyli białkowej sieci

określającej kształt oraz mechaniczne własności komórki

(zagadnienie szeroko zostało opisane Postępach Biochemii

[19]).

Przez długi czas nie potrafiono odpowiedzieć na pytanie,

czy obserwowana zmiana jasności rejestrowanego obrazu

jest skutkiem wzrostu stężenia jonów wapnia, czy też może

zmiany kształtu komórki powodują zmiany ilości barwni-

ka wrażliwego na obecność jonów wapnia w obserwowanej

objętości cytoplazmy. Problem ten został rozwiązany w po-

łowie lat osiemdziesiątych XX. wieku przez Rogera Tsiena,

który opracował pierwszy barwnik ratiometryczny nazwa-

ny Fura.

1

ZASADA DZIAłANIA BARWNIKóW

RATIOMETRYCZNYCH

Sondę wapniową w roztworze cytoplazmatycznym mo-

żemy traktować jako mieszaninę dwóch barwników flu-

orescencyjnych: cząsteczek sondy niezwiązanej z jonami

wapnia i cząsteczek sondy w kompleksie z jonem wapnia.

Jasność fluorescencji dowolnego barwnika zależy od wydaj-

ności kwantowej fluorochromu (definiowanej jako stosunek

liczby fotonów emitowanych do liczby fotonów absorbo-

wanych) oraz stężenia barwnika. Podczas gdy wydajność

kwantowa jest właściwością barwnika, to lokalne stężenie

sondy wapniowej może się zmieniać w trakcie pomiaru i

jest trudne do kontrolowania. Jeśli sonda zmienia pod

wpływem wiązania jonu wapnia swoją wydajność kwan-

tową, to trudno jest odróżnić sytuację, w której pojawia

się w roztworze więcej jonów wapnia od sytuacji, w której

pojawia się w roztworze więcej cząsteczek barwnika. Aby

taką różnicę dostrzec, trzeba skorzystać z sondy, która pod

wpływem kompleksowania jonu wapnia zmienia inną ce-

chę niż wydajność kwantowa fluorescencji. Pierwszymi

takimi związkami, do dziś z powodzeniem używanymi w

badaniach, były opisane przez grupę Tsiena w roku 1985

Fura-2 i Indo-1, [20]. Na skutek kompleksowania jonu wap-

nia następuje w nich przesunięcie optimum wzbudzenia

(Fura 2) lub emisji (Indo 1).

1

Termin „ratiometria” jest bezpośrednim i niezbyt szczęśliwym zapo-

życzeniem z języka angielskiego. Oznacza technikę pomiaru opartą o

stosunek dwóch mierzonych wartości. Termin ten jest wcześniejszy

niż jego biologiczne wykorzystanie i pochodzi z elektroniki. Rozpo-

wszechnił się w wielu językach (np. w języku niemieckim), gdzie tak

jak w polskim nie ma logicznego uzasadnienia. Autor nie czuje się po-

wołany do toczenia batalii o czystość języka i będzie tego terminu w

bieżącym artykule używał.

Fura-2 w stanie niezwiązanym świeci najjaśniej przy

wzbudzeniu falą światła o długością 362 nm, zaś w stanie

związanym z jonem wapnia przy wzbudzeniu 335 nm. Jed-

nocześnie wydajność kwantowa barwnika wzrasta wraz ze

związaniem jonu wapnia z 0,23 do 0,49 (Ryc. 2). Na rycinie

widać różnicę między wykresem wydajności wzbudzania

niezwiązanego barwnika (linia niebieska) i barwnika zwią-

zanego z wapniem (linia czerwona), a także szereg linii po-

kazujących przebieg wykresu dla mieszaniny tych dwóch

form sondy. Rzucającą się woczy cechą tego wykresu jest

istnienie punktu izobastycznego, w którym wydajność

wzbudzania sondy nie zależy od tego, czy kompleksuje ona

jon wapnia czy nie. Ten punkt znajduje się przy długości

fali 360 nm. Dla wzbudzenia falą krótszą, sonda świeci co-

raz jaśniej wraz ze wzrostem liczby cząsteczek barwnika

kompleksujących wapń, a dla długości fali wzbudzającej

powyżej 360 nm, jasność fluorescencji sondy spada wraz

ze wzrostem odsetka cząsteczek kompleksujących jon wap-

nia. Grynkiewicz i Tsien wykazali w 1985 roku, że stosunek

jasności fluorescencji sondy wzbudzanej przy długości fali

światła 340 nm do jasności fluorescencji wzbudzanej świa-

tłem 380 nm nie zależy od stężenia barwnika, a jedynie stę-

żenia wapnia i przedstawia się wzorem (1):

gdzie: [Ca

2+

] — stężenie wapnia, K

d

— stała dysocjacji kom-

pleksu jon wapnia — Fura-2, R — stosunek fluorescencji

(1)

rycina 2. Wydajność wzbudzenia sondy wapniowej Fura-2. Linia niebieska:

wykres wzbudzania sondy w środowisku niezawierającym jonów wapnia. Linia

czerwona: wykres wzbudzania sondy wysyconej jonami wapnia. Linie jasno-

niebieska, zielona, żółta i pomarańczowa: wykres wzbudzania mieszaniny nie-

związanej sondy i sondy związanej z wapniem, dla stężenia wapnia w roztworze

odpowiednio: 50 nM, 100 nM, 500 nM i 2 µM. Dla światła wzbudzającego 340 nm

jasność fluorescencji rośnie wraz ze wzrostem stężenia wapnia w roztworze, pod-

czas gdy dla światła wzbudzającego 380 nm intensywność fluorescencji sondy

spada wraz ze wzrostem stężenia wapnia w roztworze. Prezentowane wykresy

przedstawiają wartości obliczone dla K

d

sondy dla wapnia jako ~225 nM, takiego

jak obserwujemy w cytoplazmie komórek ze względu na obecność jonów ma-

gnezu w roztworze, w odróżnieniu od większości wykresów dostępnych w sieci,

sporządzonych eksperymentalnie in vitro przy K

d

~150 nM. IB: punkt izobastycz-

ny, 360 nm.

468

www.postepybiochemii.pl

340/380 nm, R

min

— stosu-

nek R rejestrowany w roz-

tworze nie zawierającym

jonów wapnia, R

max

— sto-

sunek R rejestrowany w

roztworze

wysyconym

jonami wapnia, Q — para-

metr określający dynamikę

sprzętu pomiarowego, bę-

dący stosunkiem jasności

fluorescencji rejestrowanej

w roztworze wysyconym

wapniem do fluorescencji

w roztworze pozbawio-

nym wapnia, przy długości

światła wzbudzającego 380 nm. We wzorze tym nie wystę-

puje nigdzie stężenia sondy wapniowej, co zostało wyja-

śnione w krótkim wyprowadzeniu wzoru w ramce.

Oprócz barwnika Fura-2, opracowano całą gamę podob-

nych związków, różniących się powinowactwem do jonów

wapnia. Ich lista przedstawiona jest w tabeli 1.

KALIBRACJA BARWNIKA FuRA-2

Jeśli stosunek jasności dwóch obrazów fluorescencyjnych

ma zostać przeliczony na stężenie jonów wapnia w cytopla-

zmie komórki (Ryc. 3), to wymagane jest określenie para-

metrów, które zostały określone we wzorze Grynkiewicza,

a które opisano i wyjaśniono powyżej. Metody określenia

tych parametrów dzielą się na dwie podstawowe grupy: in

vivo oraz in vitro.

Metoda in vitro polega na sporządzeniu szeregu roztwo-

rów o znanym stężeniu jonów wapnia zawierających son-

dę wapniową Fura-2, a następnie dokonania pomiaru flu-

orescencji tej serii roztworów przy dwóch długościach fali

wzbudzającej 340 nm i 380 nm. Seria rozpoczyna się roz-

tworem EGTA (całkowicie pozbawionym jonów wapnia), a

kończy roztworem nasyconym jonami wapnia (w przypad-

ku barwnika Fura-2, jest to roztwór soli wapnia w stężeniu

milimolowym). Te dwa graniczne roztwory pozwalają okre-

ślić R

min

oraz R

max

występujące we wzorze Grynkiewicza. Se-

ria roztworów o stężeniach pośrednich pozwala natomiast

na dopasowanie nieco zmodyfikowanego wzoru Grynkie-

wicza do otrzymanych wyników. Modyfikacja ta polega na

wprowadzeniu parametru K

eff

, będącego ilorazem K

d

i Q.

Podstawową wadą metody kalibracji in vitro jest możli-

wa różnica między K

d

sondy wapniowej w komórce i roz-

tworze kalibracyjnym. Wiadomo, że K

d

barwnika Fura-2 dla

wapnia zmienia się w zależności od szeregu czynników,

głównie obecności magnezu i siły jonowej roztworu [21].

Aby wyeliminować te dodatkowe czynniki, częściej

stosuje się metodę in vivo. Polega ona na odczytaniu pa-

rametrów równania Grynkiewicza bezpośrednio na pod-

stawie obserwacji badanych komórek. Metoda ta opiera

się na zastosowaniu antybiotyku jonomycyny (lub innego

jonoforu, pozwalającego na swobodny przepływ jonów

wapnia między środowiskiem komórki a cytoplazmą)

w celu kontrolowanej modyfikacji cytoplazmatycznego

stężenia jonów wapnia [22,23]. Podanie jonoforu powo-

duje napływ jonów wapnia ze środowiska zewnątrzko-

mórkowego i wysycenie sondy wapniowej, co pozwala

na określenie wartości R

max

. Następnie do roztworu poda-

wane jest EGTA i po ustaleniu się równowagi chemicznej

można odczytać wartość R

min

. Posiadając dane cząstkowe

(obrazy dla wzbudzenia 340 nm i 380 nm), potrzebne do

obliczenia każdego ze stosunków możemy także poli-

czyć współczynnik Q. Do obliczeń używa się średnich

ze znaczącej liczby komórek, by uniknąć wpływu fluk-

tuacji jasności obrazu. Przy zastosowaniu metody in vivo

nie można niestety określić bezpośrednio wartości K

d

sondy w cytoplazmie. Do tego potrzebny jest trzeci bu-

for kalibracyjny o znanym stężeniu jonów wapnia [24].

Obecność wewnątrzkomórkowych, białkowych buforów

wapnia może jednak powodować, że ustalenie się równo-

wagi chemicznej i idąca za tym stabilizacja poziomu flu-

orescencji sondy będą trwać niepraktycznie długo. Alter-

natywą jest więc założenie a priori wartości K

d

sondy. Jest

to często przyjmowany kompromis między dokładnością

kalibracji a praktycznymi ograniczeniami eksperymentu.

Najczęściej przyjmowaną wartością jest 225 nM, wartość

określona przez Grynkiewicza i Tsiena dla 1 mM stężenia

jonów magnezu w środowisku [20]. Trzeba pamiętać, że

w trakcie kalibracji in vivo następuje nieodwracalne znisz-

czenie badanego materiału, co jest niewątpliwą wadą tej

metody kalibracji.

tabela 1. Sondy wapniowe z rodzi-

ny Fura charakteryzują się różnym

powinowactwem do jonów wapnia

(K

d

podane dla roztworu wodnego w

nieobecności innych jonów). Na pod-

stawie materiałów producenta (Life

Technologies).

Sonda

K

d

(Ca

2+

)

Fura-2

140 nM

Fura-5F

400 nM

Fura-4F

770 nM

Fura-6F

5,30 µM

Fura-FF

5,50 µM

Mag-Fura-2

25 µM

(2)

rycina 3. Zasada ratiometrycznego obrazowania stężenia jonów wapnia w cyto-

plazmie, pokazana na przykładzie działania jonomycyny na komórki glejaka C6.

Lewa kolumna (A, B, C): komórki w środowisku hodowlanym zawierającym 2

mM stężenie jonów wapnia, prawa kolumna (D, E, F): komórki po podaniu jono-

mycyny do środowiska. Górny wiersz (A, D): obraz otrzymany przy wzbudzeniu

sondy światłem 380 nm, jaśniejszy dla niskiego poziomu wapnia związanego z

sondą, widać spadek jasności po podaniu jonomycyny. Wiersz środkowy (B, E):

obraz otrzymany przy wzbudzeniu sondy światłem 384 nm, jaśniejszy dla wyso-

kiego poziomu wapnia związanego z sondą, widać wzrost jasności po podaniu

jonomycyny. Dolny wiersz (C, F): mapa stężenia wapnia w cytoplazmie otrzyma-

na z równania Grynkiewicza. Wszystkie obrazy pokazano w fałszywej skali barw

dla lepszego zobrazowania zmian.

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

469

barWniki nieratiOmetrycZne

W mikrOSkOPii kOnFOkalnej

Równolegle do rozwoju sond ratiometrycznych praco-

wano nad sondami, które podobnie jak Quin-2 zmieniają

jedynie wydajność kwantową. Znalazły one zastosowanie

w mikroskopii konfokalnej relatywnie grubych obiektów

biologicznych, takich jak duże komórki czy skrawki tkanek.

Mikroskop konfokalny jest w stanie nieinwazyjnie wyci-

nać woksele, czyli prostopadłościenne fragmenty objętości

obserwowanego preparatu i dokonywać w nich pomiaru

jasności fluorescencji. Jako, że woksel z definicji zawsze za-

chowuje tę samą objętość, przy pewnej ostrożności można

dokonywać w nim nieratiometrycznego pomiaru stężenia

jonów wapnia. Pierwszym warunkiem poprawnego pomia-

ru nieratiometrycznego jest to, że nie zmieni się charakter

woksela, czyli np. nie znajdzie się na skutek skurczu ko-

mórki w jądrze komórkowym. Drugim warunkiem jest to,

że woksel przez cały czas znajduje się w całości wewnątrz

badanej komórki. Oznacza to, że gdy objętość woksela jest

większa niż objętość badanej struktury, co ma miejsce na

przykład podczas obserwacji brzegu komórki — cienkie-

go lamellipodium, nie można stosować metod nieratiome-

trycznych. Jeśli natomiast powyższe założenia są prawdzi-

we, pomiar nieratiometryczny jest szybki i prosty.

Pierwsza grupa barwników nieratiometrycznych po-

wstała z fluoresceiny i rodaminy, a wywodząca się z nich

rodzina sond Fluo jest do dziś używana [25]. Rozwój barw-

ników Fluo, od Fluo-2 do Fluo-4 polegał na zwiększaniu

wydajności kwantowej sondy oraz zwiększaniu dynamiki

reakcji na wiązanie wapnia. Opracowano również warianty

Skąd się wziął wzór Grynkiewicza

Załóżmy, że w naszym doświadczeniu sonda molekularna znajduje się w cytoplazmie w wystarczająco niskim stężeniu, żeby wydajność jej fluorescencji była pro-

porcjonalna do ilości wzbudzanego barwnika. Biorąc pod uwagę, że mamy w układzie dwa barwniki (sondę związaną z jonem wapnia i sondę bez jonów wapnia),

a każdy z nich wzbudzamy dwoma długościami światła (340 nm i 380 nm w przypadku barwnika Fura-2), w równaniach występować będą cztery współczynniki:

S

340W

dla niezwiązanego barwnika wzbudzanego światłem 340 nm

S

340Ca

dla barwnika kompleksującego jon wapnia wzbudzanego światłem 340 nm

S

380W

dla niezwiązanego barwnika wzbudzanego światłem 380 nm

S

380Ca

dla barwnika kompleksującego jon wapnia wzbudzanego światłem 380 nm

Współczynniki te zależeć będą od wydajności kwantowej każdej z form sondy oraz własności układu optycznego, takich jak intensywność wzbudzania, wydajność

używanego detektora itd. Obserwowana jasność fluorescencji będzie więc wyglądała następująco:

F

340W

= S

340W

C

w

+ S

340Ca

C

Ca

F

380W

= S

380W

C

w

+ S

380Ca

C

Ca

gdzie C

w

i

C

Ca

to odpowiednie stężenia niezwiązanej i związanej z wapniem sondy. Z tych wzorów możemy policzyć R, stosunek jasności fluorescencji przy dwóch

falach wzbudzających:

Stężenia niezwiązanej i związanej formy sondy są ze sobą powiązane wzorem na kompleksowanie ze współczynnikiem stechiometrycznym 1:1:

gdzie [Ca

2+

] to stężenie wapnia w roztworze, a K

d

to stała dysocjacji sondy dla jonów wapnia. Podstawiając wzór (3) do wzoru (2) otrzymujemy:

C

w

można skrócić otrzymując równanie w którym R nie zależy od stężenia sondy!:

Jeśli teraz przekształcimy równanie, tak by mogło ono posłużyć do obliczenia stężenia wapnia w roztworze, dostajemy znane równanie Grynkiewicza:

gdzie łatwo eksperymentalnie możemy zmierzyć

jako R dla roztworu bez jonów wapnia i oznaczyć jako R

min

,

a jako R dla roztworu

wysyconego

jonami wapnia i oznaczyć jako R

max

. Stosunek

określa parametr związany z własnościami używanego systemu do pomiarów optycznych i jest

określony w czasie kalibracji takiego systemu. Zazwyczaj określamy go jako Q. Stąd bierze się najczęściej spotykana forma równania:

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(1a)

(1b)

tabela 2. Sondy wapniowe z rodziny Fluo. Źródła: materiały producentów (Life

Technologies, AAT Bioquest [25,26]).

Sonda

K

d

(Ca

2+

)

Stosunek jasności barwnika

nasyconego do niezwiązanego

Fluo-2

370 nM

31

Fluo-3

390 nM

40

Fluo-4

350 nM

54

Fluo-5F

2,3 µM

–

Fluo-5N

90 µM

–

Fluo-4FF

9,7 µM

–

Fluo-8

390 nM

200

Fluo-8H

230 nM

–

Fluo-8L

1,9 µM

–

470

www.postepybiochemii.pl

sondy Fluo charakteryzujące się różnym powinowactwem

do wapnia, tak by badać różne stężenia jonów (patrz Tab.

2). Ostatnio opracowano barwnik Fluo-8, charakteryzujący

się bezprecedensową jasnością i dynamiką. Niestety jest on

dość wrażliwy na zmiany pH cytoplazmy, co utrudnia jego

użycie jako narzędzia do fizjologicznego pomiaru stężenia

jonów wapnia [26].

Druga grupa nieratiometrycznych sond wapniowych

pochodzi z firmy Molecular Probes i jest oparta na bardzo

jasnym barwniku fluorescencyjnym Oregon Green. Mody-

fikacje tej grupy związków poszły w dwóch kierunkach:

zmiany długości fali światła wzbudzającego (Tab. 3a) oraz,

tak jak w przypadku innych sond wapniowych, zmiany po-

winowactwa do jonów wapnia (Tab. 3b). Pierwszy kierunek

zaowocował barwnikami: Calcium Orange wzbudzanym

falą o długości 530 nm i Calcium Crimson wzbudzanym falą

o długości 570 nm [27]. Barwnik Calcium Green jest bardzo

jasny (wydajność kwantowa 0,75 wobec 0,14 w przypadku

Fluo-3), może więc być używany w mniejszych stężeniach,

co prowadzi do jego mniejszej cytotoksyczności, która sta-

nowi poważny problem przy konfokalnym obrazowaniu

stężenia wapnia. Niestety zarówno Calcium Orange jak i

Calcium Crimson mają niewielką dynamikę, co utrudnia ich

praktyczne zastosowanie.

białkOWe SOndy WaPniOWe

Grupę kodowanych genetycznie sond wapniowych

otwiera oczywiście akworyna, niemniej musiało minąć

dwadzieścia lat, by białka luminescencyjne i fluorescen-

cyjne stały się użytecznym narzędziem obrazowania stę-

żenia jonów wapnia w komórce. Ostatnie dziesięciolecie

jest świadkiem burzliwego rozwoju tej grupy sond wap-

niowych i jej znaczącej dywersyfikacji. Białkowe sondy

wapniowe można podzielić dziś na dwie podstawowe

grupy: fluorescencyjne [28] i bioluminescencyjne (czasem

też określane jako chemiluminescencyjne), do których na-

leży akworyna.

BIAłKA FLuORESCENCYJNE WRAżLIWE

NA STężENIE JONóW WAPNIA

Białka fluorescencyjne wrażliwe na stężenie wapnia po-

chodzą wszystkie od zielonego białka fluorescencyjnego

GFP. Oryginalny Cameleon, skonstruowany w laboratorium

Rogera Tsiena, był białkiem składającym się z chromoforu-

-donora (CFP, niebieskiej pochodnej GFP), kalmoduliny,

łącznika, domeny M13 wiążącej kalmodulinę pochodzącej z

kinazy lekkich łańcuchów miozyny i chromofora akceptoro-

wego (YFP, żółtej pochodnej GFP) [28]. Po związaniu wap-

nia przez kalmodulinę, zwiększało się jej powinowactwo do

domeny pochodzącej z kinazy lekkich łańcuchów miozyny

i cała cząsteczka ulegała zmianie konformacji tak, że białka

fluorescencyjne zbliżały się do siebie pozwalając na niepro-

mienisty transfer energii (FRET, ang. Fluorescence Resonan-

ce Energy Transfer, czasem rozwijany jako Förster Resonance

Energy Transfer) między CFP a YFP (Ryc. 4A).

Od czasu opracowania pierwszej sondy Cameleon nastą-

pił lawinowy wzrost liczby podobnych białek, przebiegają-

cy w dwóch kierunkach: poprawienia właściwości fluore-

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

A

B

C

rycina 4. A: Schemat działania białkowej sondy wapniowej opartej o zjawisko

FRET. Białko niezwiązane z wapniem znajduje się w konformacji rozwiniętej,

grupy chromoforowe CFP i YFP znajdują się z dala od siebie. Wzbudzenie białka

fioletowo-niebieskim światłem o długości fali 435 nm powoduje emisję niebie-

skiego światła o długości fali 480 nm. Po związaniu wapnia białko ulega zmia-

nie konformacyjnej, w której wyniku chromofory CFP i YFP znajdują się bardzo

blisko, co umożliwia zajście zjawiska niepromienistego transferu energii między

nimi. Po wzbudzeniu światłem 435 nm białko zaczyna emitować światło żółte o

długości fali 535 nm. B: schemat działania białkowej sondy wapniowej opartej o

aktywację pojedynczej domeny białka fluorescencyjnego. Domena chromoforo-

wa białka podzielona jest na dwie niezależne części, które pod nieobecność wap-

nia w roztworze znajdują się na dwóch końcach cząsteczki. Dopiero związanie

wapnia powoduje zwinięcie łańcucha peptydowego i utworzenie funkcjonalnej

domeny chromoforowej białka. C: Schemat działania sondy molekularnej opar-

tej o zjawisko BRET. W nieobecności jonów wapnia podzielona na dwie części

domena bioluminescencyjna, jest nieaktywna. Po związaniu wapnia następuje

zmiana konformacji białka i domena zostaje uaktywniona. Znajduje się ona te-

raz w sąsiedztwie domeny z grupy CFP, stanowiącej akceptor niepromienistego

transferu energii z centrum aktywnego domeny bioluminescencyjnej. Domena

CFP jest wydajniejszym od białek bioluminescencyjnych emiterem fotonów i sta-

nowi wzmacniacz sygnału świetlnego.

tabela 3a. Właściwości fluorescencyjne sond z rodziny Calcium Green. Na pod-

stawie materiałów producenta (Life Technologies, [27]).

Sonda

Długość światła

wzbudzającego

Długość światła

emitowanego

Calcium Green

488 nm

530 nm

Calcium Orange

530 nm

575 nm

Calcium Crimson

570 nm

610 nm

tabela 3b. Charakterystyka wiązania wapnia przez sondy z grupy Calcium

Green. Na podstawie materiałów producenta (Life Technologies, [27]).

Sonda

K

d

(Ca

2+

)

Calcium Green-1

190 nM

Calcium Green-5N

14 µM

Calcium Green-2

550 nM

Oregon Green 488 BAPTA-1

170 nM

Oregon Green BAPTA-6F

3 µM

Oregon Green BAPTA-5N

20 µM

Oregon Green BAPTA-2

580 nM

Calcium Orange

320 nM

Calcium Crimson

200 nM

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

471

scencyjnych barwnika oraz stworzenia grupy sond o zróż-

nicowanych wartościach K

d

dla wapnia, co pozwoliłoby na

pomiary stężenia jonów wapnia w różnych przedziałach

komórki [29]. Powstało także wiele sztucznie tworzonych

białek, opartych o tę samą zasadę: FRET pomiędzy dwoma

chromoforami, których pozycja przestrzenna zmienia się w

zależności od obecności jonów wapnia w środowisku.

Aby osiągnąć różne powinowactwo do jonów wapnia,

skonstruowana została rodzina Cameleon’ów oznaczonych

jako YC (od ang. Yellow Cameleon) z odpowiednim numerem.

I tak mamy YC2, z natywną sekwencją aminokwasową kal-

moduliny, charakteryzujący się dwufazowym wiązaniem jo-

nów wapnia i pozwalający na pomiar w zakresie 100 nM–10

µM. YC3 ma zamienioną resztę aminokwasową w pozycji 104

(reszta glutaminy zamiast kwasu glutaminowego), co nieco

zmniejsza powinowactwo i zakres pomiaru wynosi od 1 do

100 µM. YC4 ma taką samą mutację w pozycji 31 sekwencji

aminokwasowej kalmoduliny, co daje znacznie niższe powi-

nowactwo do jonów wapnia i zakres pomiarowy od 10 µM do

1 mM [28]. Wadą tych barwników była wrażliwość na pH za-

stosowanej domeny YFP, która powodowała, że zmiany pH

w środowisku wywoływały podobne zmiany fluorescencji

jak zmiany stężenia jonów wapnia. Aby temu zaradzić wpro-

wadzono zmiany w sekwencji aminokwasowej chromoforu,

tworząc drugą generację sondy, oznaczaną jako YC2.1, YC3.1

lub YC4.1 [30]. Dalsze prace w tym kierunku doprowadzi-

ły do zastąpienia CFP mutacją zwaną „citrine” na poziomie

trzeciej generacji białka (YC3.3) [31] i „venus” na poziomie

aktualnie najpopularniejszej, szóstej generacji białka Came-

leon (YC3.6) [32]. Trwają prace nad udoskonalaniem nowej

grupy sond z tej samej rodziny, oznaczanych odpowiednio

D2cpv, D3cpv i D4cpv. Są one oparte na sztucznie zmody-

fikowanych sekwencjach aminokwasowych, zaprojektowa-

nych w ten sposób, by uniknąć oddziaływań poszczególnych

domen sondy z obecną w komórce kalmoduliną, czy też jej

partnerami [33].

W celu poprawienia siły składania cząsteczki po zwią-

zaniu jonu wapnia, w miejsce domeny z kinazy lekkich

łańcuchów miozyny inne grupy badaczy zastosowały od-

mienne domeny białek pozwalające na osiągnięcie tego

samego efektu, np. w miejsce domeny z kinazy lekkich

łańcuchów miozyny użyto domenę z zależnej od kalmodu-

liny kinazy kinaz białkowych (CaMKK) [34]. Kalmodulina

jako element wiążący wapń, w białkowych wskaźnikach

stężenia tego jonu ma dość zasadniczą wadę: może ulec

fosforylacji, która znosi czułość sondy [35]. W praktyce

okazało się również, że białka oparte o kalmodulinę często

nie wykazują aktywności, jak to ma miejsce na przykład

w organizmach myszy [36]. Aby uniknąć tego problemu,

skonstruowano analogiczne do kameleona białko TN-XL

oparte o troponinę C [37] i charakteryzujące się większą

stabilnością w organizmie gospodarza. Ponadto, jako al-

ternatywę dla sond opartych o zjawisko FRET powstały

barwniki takie jak camgaroo-2 [38], CaMP2 [39] czy Pe-

ricam [40], wykorzystujące pojedynczą cząsteczkę biał-

ka fluorescencyjnego. Sondy te działają przez składanie

dwóch elementów domeny fluorescencyjnej w całość pod

wpływem związania jonów wapnia. Z tej perspektywy

można je uznać na nieratiometryczną wersję białkowych

sond wapniowych (Ryc. 4B).

Białkowe sondy wapniowe podążają zatem za sondami

drobnocząsteczkowymi. ustępują im na razie dynamiką

i wygodą użycia, pozwalają za to na selektywne wprowa-

dzanie do określonych typów komórek jak i nakierowanie

na określone przedziały wewnątrzkomórkowe. Okazują się

także niezastąpione przy badaniach in vivo w całych orga-

nizmach.

BIAłKOWE SONDY WAPNIOWE OPARTE

O ZJAWISKO BIOLuMINESCENCJI

Rozwój optogenetyki spowodował powrót do prac nad

udoskonaleniem sond bioluminescencyjnych, które do

działania nie potrzebują światła wzbudzającego. Burzliwy

rozwój tej metody w neurobiologii wraz z niską wydajno-

ścią akworyny, która dyskwalifikuje ją jako sondę do badań

in vivo, spowodował powstanie nowych sond białkowych

zaprojektowanych tak, by zwiększona była wydajność

kwantowa luminescencji. Taką metodą okazał się BRET

(ang. Bioluminescence Resonance Energy Transfer, czasem

występujący też pod nazwą CRET, ang. Chemiluminescence

Resonance Energy Transfer), czyli metoda niepromienistego

przekazywania energii z luminoforu na znacznie wydaj-

niejszy emisyjnie chromorofor. Samo połączenie akworyny

z białkiem GFP prowadziło do dziesięciokrotnego zwięk-

szenia wydajności świetlnej sondy [41], co pozwoliło na

obrazowanie mózgu muszki owocowej in vivo [42]. Jeszcze

wydajniejszą sondę przedstawiono na Konferencji Europej-

skiego Towarzystwa Wapniowego w 2012 roku (Takeharu

Nagai, plakat) gdzie hybrydowe białko składa się lucyfera-

zy (Rluc) podzielonej, przez nieujawnioną sekwencją ami-

nokwasową wiążącą wapń, na dwie subdomeny i wydajnej

wersji YFP. Podobnie jak w białkach fluorescencyjnych za-

wierających podzieloną sekwencję GFP, związanie wapnia

powoduje powstanie funkcjonalnej lucyferazy, która przez

mechanizm BRET pobudza białko YFP do emisji fotonów.

Autorzy twierdzą, że tak skonstruowana sonda jest od pięć-

dziesięciu do stu razy wydajniejsza od akworyny i pozwala

na obrazowanie aktywności neuronalnej w czasie rzeczywi-

stym (Ryc. 4C).

PerSPektyWy

Trzydzieści lat rozwoju technik optycznego pomiaru po-

ziomu jonów wapnia stworzyło dojrzałą dziedzinę metodo-

logii nauk biologicznych, dysponującą bezprecedensowym

spektrum metod i narzędzi. Mimo, że używane dziś drob-

nocząsteczkowe sondy wapniowe mają szereg wad, takich

jak konieczność użycia podwójnego wzbudzania barwnika

Fura-2, z przyczyn praktycznych nie należy spodziewać

się dalszego, szybkiego rozwoju tych technik. Szerokie wy-

korzystanie posiadanych możliwości i brak zasadniczych

postępów w ostatnim dziesięcioleciu powodują, że trudno

byłoby oczekiwać znaczących inwestycji ze strony produ-

centów czy agencji rządowych finansujących badania, a w

konsekwencji przełom jest mało prawdopodobny.

Szybszy postęp charakteryzuje rozwój genetycznie kodo-

wanych sond białkowych, choć i ta dziedzina zaczyna nabie-

rać znamion dojrzałej. Wydaje się, że w najbliższym czasie

czeka nas raczej doskonalenie istniejących produktów i ich

komercjalizacja, niż przełomy związane z powstawaniem

472

www.postepybiochemii.pl

nowych rozwiązań, fundamentalnie innych od tych białek,

które już znamy. Przewidywać za to można intensywny

rozwój technicznych metod obrazowania, pozwalających

na zastosowanie istniejących rozwiązań w badaniach in

vivo, zwłaszcza w obszarze neurofizjologii i badań nad ko-

mórkami nowotworowymi. Rozwój ten będzie tym szybszy

im prędzej uda się połączyć pomiary stężenia jonów wapnia

z użyciem burzliwie się rozwijających metod optogenetyki.

Drugim, obiecującym kierunkiem rozwoju sond wapnio-

wych będzie rozpowszechnianie się drobnocząsteczkowych

sond kierowanych, takich jak FLAsH calcium green, będą-

cy drobnocząsteczkową sondą z dwunasto aminokwaso-

wą metką tetra cysteinową, przeznaczony do znakowania

białek transgenicznych in vitro. Metodyka ta pozwala na

bardzo lokalne pomiary stężenia jonów wapnia w bezpo-

średnim otoczeniu dowolnego białka, na przykład kanału

jonowego [43]. Podobny cel przyświecał zespołowi, który

opracował metodę przyłączania barwnika Indo-1 do met-

ki SNAP, używanej do kowalencyjnego znakowania białek

fuzyjnych związkami drobnocząsteczkowymi [44]. Oba

sztucznie utworzone peptydy pozwalają na lokalne pomia-

ry in vitro, bezpośrednio na powierzchni interesujących ba-

dacza białek. Kwestią przyszłości jest, czy metodologia ta

sprawdzi się w żywych komórkach.

Już dziś jednak można powiedzieć, że instrumentarium,

którym dysponują badacze mechanizmów fizjologicznych

modulowanych przez zmiany stężenia jonów wapnia w

komórkach jest bezprecedensowe i stawia ich na pozycji

uprzywilejowanej w porównaniu z badaczami innych szla-

ków przekazywania sygnałów. Można domniemywać, że

ta łatwość pomiaru ma wspólne podłoże z uniwersalnością

jonów wapnia jako regulatora funkcji materii ożywionej.

Pozostaje mieć nadzieję, że kreatywność badaczy pozwoli

na rozwój podobnych narzędzi do pomiaru wtórnych prze-

kaźników innych szlaków sygnałowych, aktywnych w ko-

mórkach i tkankach organizmów.

PiśmiennictWO

1. Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD (2000) The versatility and universa-

lity of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 1: 11-21

2. Schwaller B (2010) Cytosolic Ca

2+

buffers. Cold Spring Harb Perspect

Biol 2: a004051

3. Putney JW (2009) Capacitative calcium entry: from concept to molecu-

les. Immunol Rev 231: 10-22

4. Paredes RM, Etzler JC, Watts LT, Zheng W, Lechleiter JD (2008) Che-

mical calcium indicators. Methods 46: 143-151

5. Smetters D, Majewska A, Yuste R (1999) Detecting action potentials in

neuronal populations with calcium imaging. Methods 18: 215-221

6. Yuste R, MacLean J, Vogelstein J, Paninski L (2011) Imaging action po-

tentials with calcium indicators. Cold Spring Harb Protoc 985-989

7. Majkowski M, Wypych D, Pomorski P, Dzugaj (2010) A Regulation

of subcellular localization of muscle FBPase in cardiomyocytes. The

decisive role of calcium ions. Acta Biochim Pol 57: 597-605

8. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and

properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous

hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 223-239

9. Shimomura O, Johnson FH (1975) Regeneration of the photoprotein

aequorin. Nature 256: 236-238

10. Montero M, Brini M, Marsault R, Alvarez J, Sitia R, Pozzan T, Rizzuto

R (1995) Monitoring dynamic changes in free Ca

2+

concentration in the

endoplasmic reticulum of intact cells. EMBO J 14: 5467-5475

11. Rizzuto R, Brini M, Bastianutto C, Marsault R, Pozzan T (1995) Photo-

protein-mediated measurement of calcium ion concentration in mito-

chondria of living cells. Methods Enzymol 260: 417-428

12. Tsien RY (1980) New calcium indicators and buffers with high selec-

tivity against magnesium and protons: design, synthesis, and proper-

ties of prototype structures. Biochemistry 19: 2396-2404

13. Tsien RY, Pozzan T, Rink TJ (1982) Calcium homeostasis in intact lym-

phocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellu-

larly trapped fluorescent indicator. J Cell Biol 94: 325-334

14. Kłopocka W, Pomorski P (1996) Cytoplasmic calcium transients in

Amoeba proteus during induction of pinocytotic and non-pinocytotic

rosettes. Acta Protozool 35: 169-180

15. Barcenas-Ruiz L, Wier WG (1987) Voltage dependence of intracellular

[Ca

2+

]

i

transients in guinea pig ventricular myocytes. Circ Res 61: 148-

154

16. Borle AB, Snowdowne KW (1982) Measurement of intracellular free

calcium in monkey kidney cells with aequorin. Science 217:252-254

17. Borle AB, Freudenrich CC, Snowdowne KW (1986) A simple method

for incorporating aequorin into mammalian cells. Am J Physiol 251:

C323-326

18. Hallett MB, Campbell AK (1980) uptake of liposomes containing the

photoprotein obelin by rat isolated adipocytes. Adhesion, endocytosis

or fusion? Biochem J 192: 587-596

19. Pomorski P (2009) Regulacja migracji komórek przez jony wapnia.

Postepy Biochem 55: 163-170

20. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Ca

2+

indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem

260: 3440-3450

21. uto A, Arai H, Ogawa Y (1991) Reassessment of Fura-2 and the ra-

tio method for determination of intracellular Ca

2+

concentrations. Cell

Calcium 12: 29-37

22. Deber CM, Tom-Kun J, Mack E, Grinstein S (1985) Bromo-A23187: a

nonfluorescent calcium ionophore for use with fluorescent probes.

Anal Biochem 146: 349-352

23. Liu C, Hermann TE (1978) Characterization of ionomycin as a calcium

ionophore. J Biol Chem 253: 5892-5894

24. Almers W, Neher E (1985) The Ca signal from fura-2 loaded mast cells

depends strongly on the method of dye-loading. FEBS Lett 192: 13-18

25. Minta A, Kao JP, Tsien RY (1989) Fluorescent indicators for cytosolic

calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol

Chem 264: 8171-8178

26. Onimaru H, Dutschmann M (2012) Calcium imaging of neuronal ac-

tivity in the most rostral parafacial respiratory group of the newborn

rat. J Physiol Sci 62: 71-77

27. Eberhard M, Erne P (1991) Calcium binding to fluorescent calcium

indicators: calcium green, calcium orange and calcium crimson. Bio-

chem Biophys Res Commun 180: 209-215

28. Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA, Ikura M,

Tsien RY (1997) Fluorescent indicators for Ca

2+

based on green fluores-

cent proteins and calmodulin. Nature 388: 882-887

29. Krebs M, Held K, Binder A, Hashimoto K, Den Herder G, Parniske M,

Kudla J, Schumacher K FRET-based genetically encoded sensors allow

high-resolution live cell imaging of Ca

2+

dynamics. Plant J 69: 181-192

30. Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Dynamic and

quantitative Ca

2+

measurements using improved cameleons. Proc Natl

Acad Sci uSA 96: 2135-2140

31. Griesbeck O, Baird GS, Campbell RE, Zacharias DA, Tsien RY (2001)

Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein.

Mechanism and applications. J Biol Chem 276: 29188-29194

32. Nagai T, Yamada S, Tominaga T, Ichikawa M, Miyawaki A (2004) Ex-

panded dynamic range of fluorescent indicators for Ca

2+

by circularly

permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci uSA 101:

10554-10559

33. Palmer AE, Giacomello M, Kortemme T, Hires SA, Lev-Ram V, Baker

D, Tsien RY (2006) Ca

2+

indicators based on computationally rede-

signed calmodulin-peptide pairs. Chem Biol 13: 521-530

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

473

See the signal — methods for calcium imaging in the cell

Paweł Pomorski

1,2,

1

Multimodal Laboratory for Cell Adhesion and Motility Research, NanoBioGeo Consortium, NanoFun Project, Nencki Institute of Experimental

Biology, 3 Pasteura str., 02-093 Warsaw, Poland

2

Laboratory of Molecular Basis of Cell Motility, Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteura str., 02-093

Warsawa, Poland



e-mail: [e-mail]

key words: calcium, signal transduction, imaging, microscopy

abStract

calcium ions are among the most universal secondary messengers existing in the living world. in the past thirty years the set of methods al-

lowing the calcium signal visualization have been developed. those

in vivo methods allow us to observe the level of the free calcium ions

in cells, tissues and organisms. the following text presents calcium imaging research tools available today as well as the calcium imaging

methods and image calibration procedures.

34. Truong K, Sawano A, Mizuno H, Hama H, Tong KI, Mal TK, Miy-

awaki A, Ikura M (2001) FRET-based in vivo Ca

2+

imaging by a new

calmodulin-GFP fusion molecule. Nat Struct Biol 8:1069-1073

35. Benaim G, Villalobo A (2002) Phosphorylation of calmodulin. Functio-

nal implications. Eur J Biochem 269: 3619-3631

36. Hasan MT, Friedrich RW, Euler T, Larkum ME, Giese G, Both M, Due-

bel J, Waters J, Bujard H, Griesbeck O, Tsien RY, Nagai T, Miyawaki A,

Denk W (2004) Functional fluorescent Ca

2+

indicator proteins in trans-

genic mice under TET control. PLoS Biol 2:e163

37. Heim N, Griesbeck O (2004) Genetically encoded indicators of cellular

calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein.

J Biol Chem 279: 14280-14286

38. Yu D, Baird GS, Tsien RY, Davis RL (2003) Detection of calcium tran-

sients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo report-

ers. J Neurosci 23: 64-72

39. Tallini YN, Ohkura M, Choi BR, Ji G, Imoto K, Doran R, Lee J, Plan P,

Wilson J, Xin HB, Sanbe A, Gulick J, Mathai J, Robbins J, Salama G,

Nakai J, Kotlikoff MI (2006) Imaging cellular signals in the heart in

vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca

2+

indicator GCaMP2.

Proc Natl Acad Sci uSA 103: 4753-4758

40. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted

green fluorescent proteins engineered to sense Ca

2+

. Proc Natl Acad Sci

uSA 98: 3197-3202

41. Baubet V, Le Mouellic H, Campbell AK, Lucas-Meunier E, Fossier P,

Brulet P (2000) Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bio-

luminescent Ca

2+

reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci

uSA 97: 7260-7265

42. Martin JR, Rogers KL, Chagneau C, Brulet P (2007) In vivo biolumines-

cence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One 2:

e275

43. Tour O, Adams SR, Kerr RA, Meijer RM, Sejnowski TJ, Tsien RW,

Tsien RY (2007) Calcium Green FlAsH as a genetically targeted small-

molecule calcium indicator. Nat Chem Biol 3: 423-431

44. Bannwarth M, Correa IR, Sztretye M, Pouvreau S, Fellay C, Aebischer

A, Royer L, Rois E, Johnsson K (2009) Indo-1 derivatives for local cal-

cium sensing. ACS Chem Biol 4: 179-190