Biologia i Ekologia

Temat

ć

wiczenia: Metody oznaczania liczebno

ś

ci mikroorganizmów

w

ś

rodowisku naturalnym – cz.1 I 2

Cze

ść

praktyczna

Cz.I. Oznaczanie liczebno

ś

ci mikroorganizmów metod

ą

po

ś

redni

ą

(hodowlan

ą

).

Cz.II. Analiza bakteriologiczna powietrza.

Liczb

ę

mikroorganizmów w badanym materiale mo

ż

na okre

ś

li

ć

stosuj

ą

c metod

ę

bezpo

ś

redniego liczenia komórek i po

ś

redniego liczenia kolonii wyrosłych na odpowiednich

podło

ż

ach.

Okre

ś

lenia ogólnej liczby kolonii na podło

ż

u stałym mo

ż

na wykona

ć

metod

ą

posiewu

powierzchniowego (czyli „płytek tartych”) lub posiewu wgł

ę

bnego (czyli „płytek lanych”).

Liczba wyrosłych kolonii winna mie

ś

ci

ć

si

ę

w granicach od 30 do 300. Podło

ż

e stałe

wykorzystuje si

ę

równie

ż

do oznaczenia liczebno

ś

ci mikroorganizmów w powietrzu, a najcz

ęś

ciej

stosowan

ą

metod

ą

jest metoda sedymentacyjna.

Cz. I

Cel

ć

wiczenia:

Oznaczanie ogólnej liczby kolonii na agarze od

ż

ywczym metod

ą

posiewu powierzchniowego

(płytek „tartych”)

Wyposa

ż

enie stanowiska:

- pipety 1 lub 2 cm

3

,

- probówki,

- płytki Petriego z po

ż

ywk

ą

agarow

ą

,

- podło

ż

e Czapek-Doxa,

- głaszczki,

- naczy

ń

ka wagowe,

- lupy,

- roztwór soli fizjologicznej lub płyn Ringera w probówkach po 9 cm

3

.

Materiały:

- marker do pisania na szkle, zeszyt A4 gładki, ołówek, gumka, długopis,

- woda ze zbiornika,

ś

cieki.

Przebieg

ć

wiczenia

- Wykona

ć

rozcie

ń

czenia badanego materiału: 1:10 (10

-1

), 1:1000 (10

-5

). Rozcie

ń

czanie polega

na przeniesieniu 1 cm

3

badanego materiału do pierwszej probówki z roztworem soli fizjologicznej

(nie zanurzaj

ą

c pipety w roztworze, pipet

ę

nale

ż

y odło

ż

y

ć

do naczynia z płynem dezynfekcyjnym),

nast

ę

pnie wymieszaniu zawarto

ś

ci probówki (przez kilkakrotne wyci

ą

ganie i wypuszczanie)

przy u

ż

yciu innej sterylnej pipety, pobraniu 1 cm

3

i przeniesieniu do drugiej probówki. Tak

post

ę

puj

ą

c dalej otrzymuje si

ę

kolejne rozcie

ń

czenia 1:10 (10

-1

), 1:100 (10

-2

), 1:1000 (10

-3

) itd.

- Wykona

ć

posiew badanego materiału (rozcie

ń

czonego). W tym celu nanie

ść

na powierzchni

ę

po

ż

ywki pipet

ą

0,1 cm

3

materiału. Wyjałowi

ć

głaszczk

ę

przez kilkakrotne zanurzenie jej w alkoholu

i opalenie w płomieniu palnika. Ostudzi

ć

głaszczk

ę

i delikatnie rozprowadzi

ć

naniesiony materiał

po całej powierzchni po

ż

ywki, tak aby jej nie uszkodzi

ć

.

- Odwróci

ć

płytki dnem do góry i umie

ś

ci

ć

w temperaturze ok. 20°C (w miejscu wskazanym przez

prowadz

ą

cego zaj

ę

cia) na okres tygodnia.

Sposób

wy

ż

arzania

ezy

oraz

schemat posiewu na powierzchni
podło

ż

a agarowego: 1 – pocz

ą

tek

posiewu, 2, 3, 4 – kolejne etapy
posiewu.

Opracowanie wyników:

- Policzy

ć

liczb

ę

wyrosłych kolonii.

- Okre

ś

li

ć

liczebno

ść

bakterii (lub grzybów) w 1 cm

3

badanego materiału według wzoru:

Liczebno

ść

mikroorganizmów w 1 cm

3

= a x b,

gdzie: a – liczba kolonii,

b – rozcie

ń

czenie.

Wynik podaje si

ę

w postaci pot

ę

gi dla liczb zawartych mi

ę

dzy 1,0 a 9,9, pomno

ż

onych przez 10

x

– gdzie x jest odpowiedni

ą

pot

ę

g

ą

.

- Przeprowadzi

ć

identyfikacj

ę

morfologiczn

ą

kolonii najliczniej wyst

ę

puj

ą

cych na płytkach.

- W materiale hodowlanym ocenić wzrost drobnoustrojów uwzględniając: pochodzenie kolonii,
liczę kolonii, barwę i przejrzystość, kształt, brzeg, wyniosłość (profil), ilość bakterii.

- Wyniki zanotowa

ć

w karcie pracy.

Metoda rozcie

ń

cze

ń

: zasada przygotowania

rozcie

ń

cze

ń

.

Cz. II

Cel

ć

wiczenia:

Badanie mikrobiologiczne ilo

ś

ciowo-jako

ś

ciowe powietrza w pomieszczeniach zamkni

ę

tych

metod

ą

sedymentacyjn

ą

Wyposa

ż

enie stanowiska:

- agar od

ż

ywczy (MPA),

- podło

ż

e Czapek-Doxa,

- płytki Petriego,

- szkiełka podstawowe,

- lupy.

Materiały:

- marker do pisania na szkle, zeszyt A4 gładki, ołówek, gumka, długopis,

- powietrze z pomieszcze

ń

zamkni

ę

tych (np. korytarz, laboratorium, zmywalnia).

Przebieg

ć

wiczenia

- Scharakteryzowa

ć

badane punkty, uwzgl

ę

dniaj

ą

c czynniki wpływaj

ą

ce na stopie

ń

zanieczyszczenia: miejsce usytuowania, poda

ć

rodzaj pomieszczenia, liczb

ę

osób i czas ich

przebywania w danym pomieszczeniu, rodzaj wentylacji itp.

- Płytki Petriego z odpowiednim podło

ż

em ustawi

ć

w pomieszczeniu przeznaczonym do badania

(w trzech powtórzeniach) zgodnie z norm

ą

(PN-04111, ark. 01 i ark. 02).

- Z płytek zdj

ąć

wieczka i pozostawi

ć

je otwarte na okres 10 min w przypadku oznaczania ogólnej

liczby bakterii i na 30 min w przypadku oznaczania pozostałych grup mikroorganizmów.

- Po okre

ś

lonym czasie ekspozycji płytki zamkn

ąć

i odwrócone pozostawi

ć

w miejscu wskazanym

przez prowadz

ą

cego zaj

ę

cia.

Opracowanie wyników:

- Policzy

ć

liczb

ę

wyrosłych kolonii (z uwzgl

ę

dnieniem bakterii pigmentowych oraz grzybów).

- Poda

ć

licz

ę

poszczególnych grup mikroorganizmów w 1 m

3

powietrza korzystaj

ą

c ze wzoru:

X

= (

a

x

5

x

10

4

) /

π

r

2

x

t

gdzie: a –

ś

rednia liczba kolonii na powierzchni podło

ż

a,

π

r

2

– powierzchnia płytki Petriego [cm

2

],

t – czas ekspozycji [min],

X – liczba organizmów w 1 m

3

powietrza.

- Przeprowadzi

ć

identyfikacj

ę

morfologiczn

ą

kolonii najliczniej wyst

ę

puj

ą

cych na płytkach.

- W materiale hodowlanym oceni

ć

wzrost drobnoustrojów uwzgl

ę

dniaj

ą

c: pochodzenie kolonii,

licz

ę

kolonii, barw

ę

i przejrzysto

ść

, kształt, brzeg, wyniosło

ść

(profil), ilo

ść

bakterii.

- Uzyskane wyniki zinterpretowa

ć

wg kryteriów oceny powietrza pod wzgl

ę

dem mikrobiologicznym

zaproponowanym przez Krzysztofika (patrz tabela).

- Wyniki zanotowa

ć

w karcie pracy.

Literatura do

ć

wicze

ń

:

1. Laboratorium z mikrobiologii ogólnej i

ś

rodowiskowej, pod red. J. Mrozowskiej,

Wydawnictwo Politechniki

Ś

l

ą

skiej, rozdział I, V, rozdział VIII, rozdział X str. 225-229, 265-

269

Karta pomiarowa:

„Metody oznaczania liczebno

ś

ci mikroorganizmów

w

ś

rodowisku naturalnym”.

Data

ć

wiczenia:

Sekcja:

Badane

ś

rodowisko

Woda

Powietrze

Miejsce i data poboru prób

Miejsce i data poboru prób

Charakterystyka zbiornika

Charakterystyka warunków atmosferycznych

Ilo

ść

kolonii

Ilo

ść

kolonii

Bakterie

Grzyby

Bakterie

Pigm.

Wszystkie

Grzyby

R

o

z

c

ie

ń

c

z

e

n

ia

C

z

a

s

e

k

s

p

o

z

y

c

ji

[m

in

]

Liczebno

ść

w 1 cm

3

Liczebno

ść

w 1 m

3

R

o

z

c

ie

ń

c

z

e

n

ia

C

z

a

s

e

k

s

p

o

z

y

c

ji

[m

in

]

Ś

rednia

Ś

rednia

Jednostka

Jednostka

Cechy morfologiczne kolonii

Cechy morfologiczne kolonii

Uwagi

Uwagi