3. Obserwacje mikroskopowe organizmów wyizolowanych w

preparatach przyżyciowych.

Cel ćwiczenia

•

Nauka przygotowywania preparatów przyżyciowych;

•

Nauka metody posiewu redukcyjnego.

Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je
wybarwić. Celem barwienia jest ułatwienie:

•

obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt, wielkość, wzajemny
układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych
układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób
rozmnażania się - przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form przetrwalnych),

•

liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).

Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu barwnika
do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą.
W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy barwienia przyżyciowe i barwienie preparatów
utrwalonych.

Przygotowanie preparatów przyżyciowych

Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu rozmnażania, a
czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się obserwacje drożdży i
pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe rozmiary,
ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości. Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku
podstawowym (w kropli spłaszczonej), a w przypadku badania ruchliwości bakterii lub
prowadzenia obserwacji nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty wykonujemy na szkiełku z
wgłębieniem zwanym komorą Lindnera (w kropli wiszącej).

Wykonywanie preparatu w kropli spłaszczonej

•

Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte z alkoholu, dokładnie wytarte i
trzykrotnie przeciągnięte nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej hodowli
drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu
wyeliminowania pęcherzyków powietrza. Nadmiar płynu osusza się bibułą filtracyjną. Przy
sporządzaniu preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów o konsystencji
mazistej należy nanieść na szkiełko najpierw kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie
Dobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej kropli. Całość nakryć szkiełkiem
nakrywkowym.

•

Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po przygotowaniu, żeby nie dopuścić
do przeschnięcia materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach cienkich, blisko
brzegu kropli.

Barwienie preparatów przyżyciowych

Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać barwienie obok kropli
z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem
nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne i muszą się charakteryzować wysoką
kontrastowością. Mimo że używa się ich w bardzo dużym rozcieńczeniu i tak wywołują
zahamowanie rozmnażania.

•

barwienie błękitem metylenowym pozwala ocenić żywotność mikroorganizmów; barwnik
przenika do wnętrza martwej komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko,

•

barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży substancji zapasowych -
glikogenu, który barwi się na brunatno, a cytoplazma komórki jasnożółto,

•

barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć granulozę -
cukier stanowiący substancję zapasową tych bakterii.

Metoda posiewu redukcyjnego