1
Spektrofotometryczna metoda oznaczania aktywności peroksydazy
Cel ćwiczenia:
Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z metodą oznaczania aktywności peroksydazy
chrzanowej jako jednego z enzymów z klasy oksydoredukataz.
Wprowadzenie:
Peroksydazy (EC 1.11.1.1-14) to grupa enzymów należących do klasy oksydoreduktaz
katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów organicznych i
nieorganicznych (Verma i Dubey, 20003). Grupą prostetyczną peroksydaz może być kofaktor
hemowy, a także reszty selenocysteiny lub cysteiny luźno związane z apoenzymem.
W reakcji katalizowanej przez peroksydazę, nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem
różnych związków np. kwasu askorbinowego, hydrohinonów i zredukowanego cytochromu.
Sumarycznie równanie reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco:
H
2
O
2
+ AH
2
2 H
2
O + A
gdzie: AH
2
i A to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym.
Peroksydazy roślinne należą do kluczowych enzymów kontrolujących różnicowanie się i
rozwój komórek roślinnych. Biorą one udział w takich procesach, jak: wczesny rozwój roślin,
kiełkowanie, dojrzewanie owoców, starzenie oraz opadanie liści. Dodatkowo pełnią funkcję
enzymów o charakterze antyoksydantów, uczestnicząc w unieczynnianiu reaktywnych form
tlenu (RFT). RFT powstają w każdej żywej komórce jako nieuchronny produkt metabolizmu
tlenowego. Nadmierne ich generowanie prowadzi do stresu „oksydacyjnego” oddziałując
negatywnie na funkcje wszystkich organelli komórkowych, uszkadzając białka, lipidy oraz
kwasy nukleinowe (Zacchini i in., 2003). Organizmy roślinne i zwierzęce wykształciły system
antyoksydacyjny, który składa się zarówno z enzymów (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza,
peroksydaza oraz alternatywna oksydaza) jak i związków niskocząsteczkowych (askorbinian,
cysteina, glutation). Do peroksydaz biorących udział w usuwaniu RFT należą: peroksydaza
glutationowa, gwajakolowa czy askorbinowa (Mehlhorn, i in., 1996). Enzymy te
zlokalizowane są m.in. w cytozolu, wakuoli, chloroplastach, ścianie komórkowej i przestrzeni
międzykomórkowej. Uczestniczą nie tylko w obronie antyoksydacyjnej, ale również biorą
udział w procesach lignifikacji, biosyntezie etylenu i obronie przed patogenami.
Peroksydazy są wysoce specyficzne w stosunku do donora wodoru (np. peroksydaza
cytochromowa, peroksydaza NADH, peroksydaza NADPH) lub niespecyficzne przenosząc
atom wodoru z organicznego substratu na nadtlenek wodoru (np. peroksydaza chrzanowa).
Prawie wszystkie peroksydazy niespecyficzne są hemoproteinami. Dzięki występowaniu
ugrupowania hemowego połączonego ze specyficznym białkiem wykazują one
charakterystyczne widmo absorpcyjne. Utworzenie przejściowego kompleksu enzymu z
H
2
O
2
, powoduje aktywacje nadtlenku wodoru, w wyniku, czego działa jako akceptor wodoru.
Peroksydazy mogą również katalizować reakcję bezpośredniego utlenienia substratów z
udziałem tlenu cząsteczkowego.
Do peroksydaz o charakterze niespecyficznym należy m.in. peroksydaza chrzanowa. Jest
ona glikoproteiną o masie cząsteczkowej 44 kDa, zawierającą cztery reszty lizynowe.
2
Substratem, a więc donorem wodoru mogą być m.in. fenole oraz aminy tj. e-toluidyna,
gwajakol czy pirogalol.
Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej
Aktywność peroksydazy może być oznaczana na podstawie: spadku stężenia nadtlenku
wodoru, spadku stężenia donoru wodoru lub pomiarze poziomu utworzonych produktów
utlenienia. Na dzisiejszych ćwiczeniach pomiar aktywności peroksydazy chrzanowej będzie
się opierał na trzeciej metodzie, czyli na pomiarze poziomu utworzonych produktów
utlenienia. Przy oznaczaniu aktywności peroksydazy nadtlenek wodoru stosuje się w
niewielkim nadmiarze ze względu na jego inaktywujące działanie na enzymy. Reakcję
przeprowadza się przez 5-10 minut ze względu na szybkie wyczerpywanie się nadtlenku
wodoru.
Zasada fotometrycznej metody oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej
Metoda opiera się na reakcji utleniania pirogalolu do purpurogaliny przy udziale nadtlenku
wodoru. Ilość powstającej purpurogaliny mierzona jest fotometrycznie przy długości fali 430
nm i temperaturze 25°C. Próbę materiałową wykonuje się bez dodatku H
2
O
2
w celu
wyeliminowania aktywności oksydazy polifenolowej, która również wykazuje właściwości
utleniające. Aktywność peroksydazy uzyskujemy poprzez odjęcie od absorbancji dla prób
pełnych wartość absorbancji dla prób materiałowych (Próba pełna – Próba materiałowa).
Rys. 1. Utlenienie pirogalolu do purpurogaliny.
Odczynniki
1. 0.2 M bufor fosforanowy pH 7.0:
2. 0.2 M roztwór pirogallolu
3. 0.01 M H
2
O
2
4. 10% Kwas siarkowy
5. 10% Siarczyn sodowy
6. 2.5 g Chrzanu/1000ml
Wykonanie
Wyciąg enzymowy (zadanie kontrolne) uzupełnić wodą destylowaną w kolbie miarowej na
25 ml.
Procedura
Wykonywane są następujące próby:
3 H
2
0
2
+
2
C0
2
+
5 H
2
0
2
+
pirogalol
purpurogalina
3
1) kontrolna zawiera wszystkie składniki, ale bez wyciągu enzymowego. Służy do
wyzerowania
spektrofotometru
i
kompensuje
absorbancję pochodzącą od
odczynników.
2) materiałowa bez dodatku H
2
O
2
w celu wyeliminowania aktywnej w roślinach
oksydazy polifenolowej wykazującej właściwości utleniające pirogalol.
3) pełna zawierająca wszystkie odczynniki oraz enzym i H
2
O
2
.
Aktywność peroksydazy chrzanowej wykonuje się w buforze fosforanowym pH 7.0,
temperaturze 25
o
C, inkubację prowadzi się przez 10 minut.
Do probówek należy odpipetować następujące ilości odczynników:
Próba kontrolna
Próba materiałowa
(w 2 powtórzeniach)
Próba pełna
(w 2 powtórzeniach)
0.15 ml
Bufor fosforanowy
0.15 ml
Bufor fosforanowy
0.15 ml
Bufor fosforanowy
------
0.5 ml
Enzym
0.5 ml
Enzym
0.7 ml
Woda destylowana
0.7 ml
Woda destylowana
0.2 ml
Woda destylowana
Wstawić do łaźni wodnej na 5 minut o temperaturze 25 ° C
0.5 ml
Nadtlenek wodoru
------
0.5 ml
Nadtlenek wodoru
0.15 ml
Pirogalol
0.15 ml
Pirogalol
0.15 ml
Pirogalol
Inkubować w łaźni wodnej przez 10 minut o temperaturze 25 ° C
0.5 ml
Kwas siarkowy
0.5 ml
Kwas siarkowy
0.5 ml
Kwas siarkowy*
0.5 ml
Siarczyn sodowy
0.5 ml
Siarczyn sodowy
0.5 ml
Siarczyn sodowy**
2.5 ml
Woda destylowana
2.5 ml
Woda destylowana
2.5 ml
Woda destylowana
*zahamowanie reakcji przez dodanie 10 % kwasu siarkowego
** rozłożenie pozostałego nadtlenku wodoru
Absorbancję uzyskanych roztworów (2 próby pełne, 2 próby materiałowe) należy odczytać w
fotometrze wobec próby kontrolnej przy długości fali 430 nm.
Opracowanie wyników
Od średniej wartości absorbancji prób pełnych odjąć średnią wartość absorbancji prób
materiałowych. Dla otrzymanej absorbancji odczytać z krzywej wzorcowej stężenie
purpurogaliny. Obliczyć aktywność peroksydazy wyrażona w μmol purpurogaliny utworzonej
w ciągu 1 minuty w przeliczeniu na 1 g korzenia.
4
Przykładowe obliczenie
Absorbancja
prób
pełnych
1
Absorbancja
prób
pełnych
2
Średnia
absorbancja
prób
pełnych
Absorbancja
prób
materiałowych
1
Absorbancja
prób
materiałowych
2
Średnia
absorbancja
prób
materiałowych
Różnica
Stężenie
purpurogaliny
(μg)
0.175
0.164
0.170
0.020
0.030
0.025
0.145
900
Różnica absorbancji 0.145
W 0.5 ml próby znajduje się 900 μg purpurogaliny
W 25 ml (w kolbce)- 45 000 μg purpurogaliny (900 μg x 50)
Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 25 ml wlano np. 3 ml analizowanego
ekstraktu z korzenia chrzanu (wartość tę poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu różnic
absorbancji P pełna – P materiałowa).
W 3 ml roztworu było 45 000 μg purpurogaliny, zatem w 1000 ml:
45 000 μg purpurogaliny x 1000/3 = 15 000 000 μg purpurogaliny
Masa molowa purpurogaliny 220 μg/μmol, zatem 15 000 000 μg/220 μg/μmol = 68 181 μmol
Do doświadczenia użyto 2.5 g korzenia chrzanu a aktywność musimy przeliczyć na 1 g i na 1
minutę:
68 181 μmol x 1 g/2.5 g = 27 272 μmol
27 272 μmol x 1 minuta/10 minut = 2727 μmol
Schemat rozcieńczeń
Pytania:
1) Do jakiej klasy enzymów należą peroksydazy i jakie reakcje katalizują?
2) Wyjaśnij, dlaczego w metodach oznaczania aktywności peroksydaz reakcję prowadzi
się tylko przez krótki czas?
3) W jaki sposób przerywa się na ćwiczeniu reakcję katalizowaną przez peroksydazę
chrzanową? W jakim celu po zakończeniu reakcji enzymatycznej dodaje się siarczynu
sodowego?
2.5g
1000 ml
X ml
Zadanie
kontrolne
25 ml
0.5 ml
5
4) Czym różnią się próby kontrolne od prób pełnych w fotometrycznej metodzie
oznaczania aktywności peroksydazy? Do czego służy próba kontrolna, materiałowa
oraz pełna?
Literatura:
1) Becana M, Dalton DA, Moran JF, Iturbe-Ormaetxe I, Matamoros MA, Rubio
MC. 2000. Reactive oxygen species and antioxidants in legume nodules. Physiologia
Plantarum 109: 372–381.
2) Mehlhorn H, Lelandais M, Korth HG, Foyer CH. 1996. Ascorbate is the natural
substrate for plant peroxidases? FEBS Lett: 378:203–206
3) Małecka A., Tomaszewska B. 2005. Reaktywne formy tlenu w komórkach
roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 32:311-325
4) Verma, S. and R.S. Dubey, 2003. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters
the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Sci: 164: 645-655.
5) Zacchini M., Rea E., Tullio M., de Agazio M. 2003. Increased antioxidative capacity
in maize calli during and after oxidative stress induced by a long lead treatment. Plant
Physiology and Biochemistry: 41: 49-54.