1

dr Paweł Golik

dr Ana Stanković

mgr Mateusz Baca

mgr Martyna Molak

Analiza naturalnych populacji – ekologia molekularna. Analiza DNA w

archeologii. Genetyka w Kryminalistyce.

Na ostatnich ćwiczeniach z cyklu „Genetyka z inżynierią genetyczną” chcielibyśmy

przedstawić pojęcie markera genetycznego i opowiedzieć o jego wykorzystywaniu w

różnych dyscyplinach: genetyce populacji (ludzi zwierząt i roślin), genetyce ochronnej,

archeologii i kryminalistyce.

Marker genetyczny

Markerem genetycznym nazywamy każdą sekwencję nukleotydową, której

polimorfizm (zmienność pomiędzy osobnikami lub grupami taksonomicznymi) pozwala

ocenić różnorodność genetyczną.

Rodzaje markerów genetycznych

SNPs (ang. Single Nucleotide Polimorphisms) – mutacje punktowe (substytucje: tranzycje i

transwersje) w sekwencji nukleotydowej. Zaletą ich analizy jest ich ogromna liczba w

genomie - u człowieka kilka milionów. Wykrywanie SNPs opiera się na analizie hybrydyzacji

z oligonukleotydami (krótkie zsyntetyzowane chemicznie jednoniciowe cząsteczki DNA

(poniżej 50 pz), które będą hybrydyzowały jedynie w sytuacji całkowitej komplementarności

z badaną sekwencją DNA).

2

SSLP (ang. simple sequence length polimorphism) są szeregami powtórzeń sekwencji - a

więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. Podstawą

zmienności są indele. [Indel – delecja lub insercja. Aby ustalić homologię dwóch sekwencji

nukleotydowych wykonujemy ich przyrównanie (uliniowanie), czyli tzw. ang. alingment.

Podczas przyrównania sekwencji nie można odróżnić od siebie delecji od insercji. Nadaje im

się zatem wspólną nazwę indele].

Minisatelity-VNTR (ang. variable number of tandem repeats) – złożone są z

jednostek powtarzających się, złożonych z kilkudziesięciu nukleotydów (10-100 pz).

Mikrosatelity – STR, msDNA (ang. simple tandem repeats), czyli proste powtórzenia

tandemowe, w których powtarzalny motyw złożony jest z 2 do 6 pz (np. CAAG, TGA

lub CA). Typowe loci mikrosatelitarne zawierają 10-30 (maksymalnie 50) powtórzeń

motywu i osiągają długość 100 do 400 pz. Zlokalizowane są najczęściej w regionach

niekodujących genomu.

Allele mikrosatelitów (warianty długości jednego locus) są kodominujące i

dziedziczą się w sposób mendlowski.

Ze względu na ich budowę, w mikrosatelitach często zachodzą mutacje.

Powtórzenia tandemowe powodują, że polimeraza DNA „ślizga się” (ang. polimerase

slippage), dodając lub opuszczając najczęściej pojedyncze powtórzenie, wydłużając

lub skracając tym samym sekwencję mikrosatelitarną. Oblicza się, że częstość

występowania mutacji w tych markerach u ssaków wynosi ok. 10

-2

– 10

-4

/na

pokolenie. Jest ona zmienna u różnych grup organizmów i wyższa u zwierząt niż u

Powtarzający się motyw np. ATCG

osobnik1

osobnik2

osobnik3

Rys 1. Budowa loci
mikrosatelitarnych

3

roślin. Im więcej powtórzeń znajduje się w danym allelu mikrosatelitarnym, tym

większe prawdopodobieństwo jego mutacji. Stąd po pewnym czasie dla danego locus

(odcinka DNA) występować będzie wiele alleli. Mikrosatelity, w związku z szybkim

tempem mutacji, są bardzo dobrym markerem do badań populacyjnych.

Zastosowanie badań genetycznych w ekologii

Od około 20 lat techniki genetyczne są wykorzystywane w badaniach ekologicznych,

przede wszystkim do ustalania polimorfizmu genetycznego populacji. Czynniki i procesy

ekologiczne determinują strukturę genetyczną. W latach 70. i 80. XX wieku badano przede

wszystkim polimorfizm allozymów. W latach 90. nastąpił gwałtowny rozwój zastosowania

techniki PCR i sekwencjonowania. Obecnie w badaniach populacyjnych wykorzystuje się

najczęściej niekodujące sekwencje DNA, podlegające minimalnie lub wcale presji selekcyjnej

(doborowi naturalnemu). Sekwencje te są z reguły wysoce polimorficzne. Należą do nich w

jądrze sekwencje mikrosatelitarne (msDNA). Z sekwencji mitochondrialnych w badaniach

głównie filogeograficznych i populacyjnych wykorzystuje się cytochrom b (będący wysoce

polimorficznym genem) oraz pętlę D.

Pętla D – (ang. displacement loop, D-loop) zwana też regionem kontrolnym, (ang.

control region) jest najbardziej zmiennym odcinkiem genomu mitochodrialnego. Ma on

długość około 1000 pz. Cechą tego markera genetycznego jest jego neutralność selekcyjna. W

obrębie pętli D mieszczą się trzy hiperzmienne regiony (ang. hipervariable region) HVR1,

Replikacja

Poślizg

Nowy cykl replikacji

+ 1 motyw

- 1 motyw

Rys 3. Przykład poślizgu polimerazy podczas replikacji

(http://www.scielo.br/img/revistas/gmb/v29n2/a18fig02.gif)

4

HVR2 oraz rzadziej wykorzystywany w analizach HVR3, w których mutacje powstają

znacznie częściej aniżeli w pozostałej części regionu kontrolnego. Funkcją D-loop jest

rozpoczęcie replikacji genomu mitochondrialnego. Tutaj mieści się region ori.

Informacje uzyskane w oparciu o analizę sekwencji mtDNA i msDNA wykorzystuje

się w badaniach nad migracjami gatunków, określaniu efektywnej wielkości populacji, jej

heterozygotyczności, pokrewieństwa osobników, dystansu genetycznego między populacjami,

przejścia populacji przez wąskie gardło itd. Pamiętać należy, że mitochondrialny DNA

dziedziczy się wyłącznie w linii matczynej, w związku z czym jego analiza dostarcza

informacji dotyczących jedynie części populacji (samic lub kobiet). W zależności od

charakteru badań wykorzystuje się jeden lub obydwa wyżej opisane markery molekularne.

Genetyka ochronna (ang. Conservation genetics).

Zgodnie z powszechnie akceptowanymi zasadami ekologii na świecie, restytucję bądź

ochronę gatunków powinna poprzedzać staranna analiza genetyczna, której wyniki pozwalają

ocenić, czy zakres polimorfizmu genetycznego introdukowanych lub zachowywanych

populacji jest wystarczający dla powodzenia projektów ochronnych. Zastosowanie metod

genetycznych pozwala poznać różnorodność (polimorfizm genetyczny) populacji, jak i

określić przepływ genów między populacjami. Możliwe jest także ustalenie stopnia i

obecności hybrydyzacji pomiędzy gatunkami autochtonicznymi a pokrewnymi,

introdukowanymi przez człowieka. Wiedza ta jest niezbędna dla prawidłowej odbudowy

populacji gatunku, który na danym obszarze kiedyś występował lub umożliwienie naturalnego

jej odrodzenia się. Wyżej opisane działania zyskały nazwę conservation genetics – w wolnym

tłumaczeniu „genetyka ochronna” (Hedrik, 2001). Genetyka ochronna to połączenie ekologii,

genetyki populacyjnej, modelowania matematycznego, taksonomii i mikroewolucjonizmu.

Poznanie dokładnie struktury ekologicznej i genetycznej pomaga w aktywnej ochronie

gatunków.

5

Genetyka w kryminalistyce.

Identyfikacja osób i określanie pokrewieństwa.

W ostatnich latach, rozwój technik izolacji DNA oraz namnażania i analizy wielu loci

mikrosatelitarnych jednocześnie, dostarczyły niezawodnego narzędzia do ustalania

identyczności lub stopnia pokrewieństwa osobników. Możliwości te wykorzystywane są

dzisiaj w wielu zagadnieniach medycyny sądowej (ang. forensic science) takich jak określanie

związku pomiędzy śladami biologicznymi, identyfikacja ofiar katastrof, ustalanie ojcostwa

lub pokrewieństwa dla celów spadkowych czy imigracyjnych.

Identyfikacja osób – podstawy teoretyczne:

Aby stwierdzić, że przykładowo, plama krwi znaleziona na miejscu morderstwa

pochodzi od konkretnego podejrzanego, trzeba porównać profile mikrosatelitarne uzyskane z

krwi oraz od podejrzanego. Aby uzyskane wyniki były wiarygodne i porównywalne np.

pomiędzy bazami danych w różnych krajach, na potrzeby takich organizacji jak FBI w USA

czy ISFS (ang. International Society of Forensic Science) w Europie stworzono zestawy

autosomalnych loci mikrosatelitarnych (położonych na chromosomach autosomalnych)

wykorzystywane do celów identyfikacyjnych. W USA zestaw ten nazwano CODIS (ang.

Combined DNA Identification System) i zawiera on 13 loci mikrostaelitarnych (CSF1PO,

FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,

D18S51, D21S11) oraz fragment genu amelogeniny pozwalający na określenie płci. W

Europie funkcjonuje kilka systemów zawierających podobne zestawy, obejmujące tzw. ang.

European Core Loci set (FGA, TH01, VWA, D2S1338, D3S1358, D8S1179, D16S539,

D18S51, D19S433, D21S11 oraz fragment genu amelogeniny)

*

.

Analiza zestawu loci mikrosatelitarnych, w wyniku której otrzymuje się profil

mikrosatelitarny danej osoby nazywa się DNA fingerprinting (genetycznym odciskiem

palca).

Jeżeli obydwa uzyskane profile są jednakowe (tzn. posiadają identyczne allele we

wszystkich loci), mamy podstawy by sądzić, że pochodzą one od jednej osoby. Jednak

możliwe jest, że 2 lub więcej niespokrewnionych osób w populacji posiada taki sam profil

*

znajomość nazw loci wykorzystywanych w opisanych zestawach nie jest wymagana

6

genetyczny zupełnie przypadkowo. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia określane jest

jako random match probability (mp, prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności). Takie

prawdopodobieństwo obliczane jest za każdym razem dla danego profilu genetycznego na

podstawie danych populacyjnych z danego regionu. Prawdopodobieństwo przypadkowego

pojawienia się danego profilu u dwóch niespokrewnionych osób w populacji zależy do ilości

wykorzystanych loci oraz ich zmienności w populacji. Dla zestawu CODIS wynosi ono

średnio 5 x 10

-15

a dla dostępnych komercyjnie zestawów sięga nawet 7,2 x 10

-19

. Innymi

słowy oznacza to, że konkretny profil genetyczny wystąpi raz na miliony miliardów osób, a

jest to liczba znacznie większa niż kiedykolwiek żyło ludzi na Ziemi. Zapewnia to prawie

100% pewność, że zgodne (identyczne) profile należą do jednej osoby. Jednak tak, jak z

całkowitą pewnością można stwierdzić, że profile nie należą do tej samej osoby (nie są

zgodne), tak prawdopodobieństwo, że profile pochodzą od jednej osoby nigdy nie osiąga

100%.

W kryminalistyce często wykorzystuje się mikrosatelity zlokalizowane na

chromosomie Y. Takie analizy wykonuje się szczególnie w przypadku przestępstw na tle

seksualnym, kiedy uzyskana próbka jest mieszaniną materiału pochodzącego od kobiety i od

mężczyzny i nie udaje się uzyskać czystego profilu mikrosatelitów autosomalnych sprawcy.

Specyficzna amplifikacja mikrosatelitów zlokalizowanych na chromosomie Y pozwala na

uzyskanie profilu, który można porównać z profilami podejrzanych. Wadą markerów na

chromosomie Y jest to, że dziedziczą się niezmienione z ojca na syna, przez co nie można

odróżnić krewnych w linii męskiej. Z tego powodu z reguły traktuje się je jako tzw. markery

wykluczające. Oznacza to, że można jedynie wykluczyć podejrzanego, kiedy profile są

niezgodne.

Określanie pokrewieństwa

Jeżeli dwie osoby są ze sobą spokrewnione, to posiadają pewną część jednakowych

alleli. Allele jednakowe u dwóch osób, kiedy ich identyczność wynika z pokrewieństwa (czyli

odziedziczenia tego samego allelu po wspólnym przodku), określa się jako IBD (ang.

Identity-by-descent, identyczne poprzez pochodzenie). Przeciwieństwem takiej sytuacji jest

występowanie identycznych alleli u dwóch osób, kiedy to allele te nie pochodzą od jednego

przodka/chromosomu. O takich allelach mówimy, że są IBS (ang. Identity-by-state).

7

Posiadając profile genetyczne dwóch osób, można określić na podstwie frekwencji

poszczególnych alleli w populacji, jaka część ich alleli jest wspólna ze względu na

pochodzenie (IBD) i na tej podstawie określić stopień pokrewieństwa pomiędzy tymi

osobami.

Określanie pokrewieństwa jest wykorzystywane przy testowaniu ojcostwa, sprawach

imigracyjnych czy identyfikacji zmarłych. Wykorzystuje się je także w badaniach nad

restytucją gatunków. Przykładowo ważne jest określenie stopnia pokrewieństwa narybku,

którym prowadzi się zarybienia. Ponadto zaplanować można dokładny schemat krzyżowań

osobników przeznaczonych do rozrodu, by uniknąć chowu wsobnego.

Przypomnieć sobie:

Jądrowy i mitochondrialny DNA (charakterystyka ogólna, szczególnie człowieka),

prawo Hardy’ego-Weinberga

Literatura:

„Genomy” T.A. Brown,

PWN (2009) str. 598-622 (rozd. 19)

lub

PWN (2001) str. 400-421 (rozd. 15)

„Genetyka molekularna” P. Węgleński i in., PWN (2006) str. 430-474 (rozd. 11) –

szczególnie zwrócić uwagę na koncepcję „Pożegnania z Afryką” (ang. „out of

Africa”, rozd. 11.3.8)

Literatura uzupełniająca – mini i mikrosatelity: „Genomy” T.A. Brown – PWN (2001) –

str. 20-22, 136-137 lub (2009) str. 68-72, 217-218.

8

MATERIAŁ DODATKOWY:

Na podstawie zmian mutacyjnych (substytucji oraz indeli) - przede wszystkim w

obrębie HVR1, utworzono haplogrupy, czyli grupy sekwencji (haplotypów) o pewnym

wspólnym wzorze nukleotydów (np. u ludzi: haplogrupy A,B,C,D itd.). Wewnątrz każdej

haplogrupy istnieją haplotypy, zawierające pewne wspólne podstawienia nukeotydowe,

specyficzne dla danej haplogrupy. Haplotyp jest właściwym określeniem w stosunku do

mtDNA (nie allel!). Wszystkie geny genomu mtDNA są dziedziczone wspólnie, zatem

odmiany sekwencji są haplotypami. Ponadto na podstawie danych tysięcy sekwencji

nukleotydowych ludzi stworzono mapę migracji ludzkości na świecie. Podobne badania

przeprowadza się na innych gatunkach rekonstruując ich historię i ewolucję. Mogą to być

badania filogeograficzne (np. rozprzestrzenianie się populacji po zlodowaceniach) oraz

filogenetyczne (czyli rekonstrukcja pokrewieństwa różnych taksonów).

Wykorzystanie loci mikrosatelitarnych w badaniach populacyjnych

Mikrosatelity znajdują zastosowanie w badaniach mechanizmów ewolucyjnych, które

zachodzą w stosunkowo krótkim czasie. Za ich pomocą analizuje się dystans genetyczny

pomiędzy populacjami. Ponadto bada się procesy demograficzne, takie jak gwałtowne

wahania liczebności.

Mogą one być spowodowane efektem wąskiego gardła (ang. bottleneck) lub efektem

założyciela (ang. founder effect), czyli kolonizacją małą liczbą osobników. Na takie populacje

silnie działa dryf genetyczny (losowe utrwalanie się – fiksacja (ang. fixation) lub eliminacja

części alleli oraz zmiana ich frekwencji) ze względu na odtwarzanie populacji z małej liczby

przypadkowych osobników.

Z kolei czynniki behawioralne, do których należy dobór płciowy, terytorializm,

decydują o tym, które genotypy (określone zestawy alleli danych genów w osobniku) będą

uczestniczyły w rozrodzie, a tym samym zostaną przekazane do kolejnych pokoleń. Na tym

poziomie rozgrywa się tzw. selekcja określonych fenotypów, które jednak mają swoje

odzwierciedlenie w konkretnym genotypie. Poligamia również jest źródłem ograniczenia

polimorfizmu danej populacji, szczególnie mało liczebnej.

Szczególne zastosowanie znajdują badania polimorfizmu mikrosatelitów u gatunków

zagrożonych wymarciem, które często są populacjami izolowanymi o ograniczonym

polimorfizmie i przepływie genów. Poznanie dokładnie ich struktury ekologicznej i

genetycznej pomaga w aktywnej ochronie tych gatunków. Migracyjność osobników

9

przeciwdziała wsobności (ang. inbreeding) i sprzyja wymianie materiału genetycznego (ang.

outbreeding). Wykorzystując sekwencje mikrosatelitarne, możliwe jest wykrycie migrantów

lub ich potomstwa w danej populacji oraz wskazanie, z jakiej populacji prawdopodobnie

pochodziły.

Z czynników środowiskowych, które silnie oddziałują na strukturę genetyczną

wymienić można stopień izolacji, którego wpływ skutkuje ograniczeniem polimorfizmu

populacji, jeśli jest ona mało liczebna, w związku z ograniczonym przepływem genów. Na

taką izolowaną populację będą silniej oddziaływać czynniki losowe, takie jak np. dryf

genetyczny. Nasilone kojarzenie wsobne w tych populacjach może prowadzić do załamania

się populacji (ang. inbreeding depression). Możliwe jest określenie efektywniej wielkości

populacji (N

E

), która jest wyznacznikiem kondycji genetycznej danej populacji. Jej wartość

zwykle drastycznie maleje w wyniku wspomnianych wyżej efektów wąskiego gardła,

założyciela czy występowania wsobności. Czasami jednak kojarzenie wsobne może mieć

działanie korzystne dla populacji (ang. puring selection). Jako że w takiej populacji większość

osobników to homozygoty pod względem wielu genów, w wyniku selekcji pozostaną jedynie

osobniki najlepiej przystosowane do lokalnych warunków środowiska. Większe jest też

prawdopodobieństwo wyeliminowania alleli genów powodujących choroby genetyczne.

Krzyżowanie się w takiej sytuacji osobników z dwóch populacji przystosowanych do

odmiennych warunków środowiska, może mieć skutek w gorszym dostosowaniu potomstwa

poprzez rozrywanie korzystnych kombinacji alleli różnych genów (ang. outbreeding

depression). Z drugiej strony, taka pozbawiona polimorfizmu populacja jest mało odporna na

zmiany warunków środowiska, np. pojawienie się nowego czynnika chorobotwórczego. Poza

tym łatwiej dochodzi do ujawniania się recesywnych chorób genetycznych.

Analiza mikrosatelitów

Obecnie mikrosatelity analizuje się za pomocą elektroforezy kapilarnej (ang. capilary

electrophoresis) w sekwenatorze. W tym celu jeden z 2 starterów znakuje się barwnikiem

fluorescencyjnym. Ustalanie długości produktów PCR polega na rejestrze czasu, jaki upływa

od rozpoczęcia elektroforezy w żelu, do momentu otrzymania sygnału świetlnego,

pochodzącego od fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów. Za pomocą standardu, oblicza

się długość analizowanych fragmentów DNA (czas migracji produktu w żelu jest

proporcjonalny do jego długości). Istnieje wiele programów, dzięki którym można ustalić

długości alleli (np. Peak Scanner). Przed analiza statystyczną, należy wykluczyć obecność:

10

tzw. ang. allelic dropout – ADO, obecność tylko 1 allelu (z 2) mającego źródło w

jego preferencyjnym namnażaniu się, najczęściej krótszego (dotyczy to zwykle

alleli powyżej 300 pz),

fałszywych alleli (ang. false alleles, FA) powstających w wyniku błędów analizy

artefaktów elektroforetycznych (ang. electrophoresis artefacts, EA) powstających

między innymi na skutek błędów sekwenatora,

alleli zerowych (ang. null alleles, NA) – braku odczytu istniejącego allelu

mającego źródło w wyniku zmiany sekwencji w miejscu przyłączania się startera,

na skutek mutacji.

Wykonuje się też analizę ewentualnego sprzężenia loci mikrosatelitarnych ze sobą

(ang. linked loci) czyli nielosowej dystrybucji alleli (ang. linkage disequilibrium). Może być

ona zaburzona, jeśli dwa loci leżą blisko siebie na jednym chromosomie. W przypadku

obliczeń wykonanych na loci sprzężonych ze sobą można otrzymać fałszywe wyniki.

Wykonuje się analizy używając sprzężonych loci, ale wykorzystuje się wówczas inne

algorytmy. Wymienione artefakty (poza FA) oraz sprzężenie doprowadzają do

przeszacowania liczby homozygot (ang. false homozygote, FH).

Równowaga Hardy’ego-Weinberga (HWE) a analizy struktury genetycznej populacji

W populacjach znajdujących się w stanie równowagi zgodnie z prawem

Hardy’ego-Weinberga nie obserwuje się wysokiej częstości mutacji oraz zjawisk selekcji,

migracji i dryfu genetycznego. Warunkiem dochodzenia do stanu tej równowagi jest także

losowość kojarzenia się osobników oraz ich wystarczająco duża liczba. Odstępstwa od HWE

świadczą o obecności procesów demograficznych, które zmieniają (zaburzają) frekwencje i

rozkład alleli.

Polimorfizm loci:

W badaniach zmienności (polimorfizmu) loci mikrosatelitarnych wykorzystuje się

następujące wskaźniki:

Liczba alleli w danym locus (Na)

Bogactwo alleliczne (R) – uwzględnia wielkość próby, przyrównując do populacji o

najmniejszej liczebności

11

Liczba alleli prywatnych (Np) – liczba alleli charakterystyczna tylko dla danej

populacji.

Heterozygotyczność o oczekiwana (H

E

) – dla frekwencji alleli danego locus w populacji

szacuje się, jaki powinien być udział heterozygot w warunkach równowagi

Hardy’ego-Weinberga.

Heterozygotyczność obserwowana (H

O

) – oblicza się rzeczywista frekwencje

heterozygot występujących w populacji.

Statystyka Wrighta

Współczynnik wsobności (ang. inbred, fixation index):

F

IS

= 1 – (H

O

/ H

E

) - wsp. inbredu – określa stopień wsobność, czyli proporcję

heterozygotyczności obserwowanej do oczekiwanej w obrębie populacji, losowość

kojarzenia się osobników (panmiksje). Wartości F

IS

< -1; 1 >:

o Nieistotne wartości F

IS

oraz F

IS

= 0 oznaczają, że populacja jest w

równowadze Hardy’ego Weinberga i brak jest struktury wewnętrznej w tej

populacji.

o Istotne statystycznie wartości F

IS

> 0 mogą wskazywać na: efekty wsobności

(ang. inbreeding), istnienie struktury wewnętrznej w populacji (subpopulacji –

efekt Wahlunda), dryf genetyczny, istnienie doboru płciowego, fizyczne

sprzężenie loci, jako że w populacji występuje nadmiar homozygot.

o

Znaczące wartości F

IS

< 0 oznaczają, iż w populacji występuje nadmiar

heterozygot, który może być wynikiem selekcji na heterozygoty albo efektem

wąskiego gardła.

Współczynnik F

ST

– wsp. utrwalenia - określa spadek heterozygotyczności w

subpopulacji w stosunku do całej populacji, na skutek np. selekcji lub dryfu

genetycznego. Jego wartości wskazują, jak intensywny jest przepływ genów

pomiędzy subpopulacjami. Mówi o dystansie genetycznym pomiędzy

subpopulacjami lub populacjami.

Wartości:

o 0 - 0,05 – małe genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,05 - 0,15 – średnie genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,15 - 0,25 – duże genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,25 – bardzo duże genetyczne zróżnicowanie populacji