1

dr Paweł Golik

dr Ana Stanković

mgr Mateusz Baca

mgr Hanna Panagiotopoulou

Analiza naturalnych populacji – ekologia molekularna. Analiza DNA w

archeologii. Genetyka w kryminalistyce.

Nawiązując do poprzednich ćwiczeń, na których była mowa o mitochondrialnym

DNA i jego użyciu jako markera przy ustalaniu różnych chorób genetycznych, chcielibyśmy

również przedstawić pojęcie markera genetycznego. Omówimy wykorzystywanie markerów

genetycznych w różnych dyscyplinach: genetyce populacji, genetyce ochronnej, archeologii i

kryminalistyce.

Marker genetyczny

Markerem genetycznym nazywamy każdą sekwencję nukleotydową, której

polimorfizm (występowanie w postaci przynajmniej dwóch łatwo rozróżnialnych alleli)

pozwala na ustalanie różnic genetycznych pomiędzy osobnikami i grupami

taksonomicznymi.

Rodzaje markerów genetycznych

SNPs (ang. single nucleotide polimorphism)– mutacje punktowe (tranzycje i transwersje) w

sekwencji nukleotydowej. Zaletą ich analizy jest ich ogromna liczba w genomie - u człowieka

kilka milionów. Wykrywanie SNPs opiera się na analizie hybrydyzacji z oligonukleotydami

(krótkie zsyntetyzowane chemicznie jednoniciowe cząsteczki DNA (poniżej 50 bp), które

będą hybrydyzowały jedynie przy pełnej komplementarności z badaną sekwencją DNA.

SSLP (ang. simple sequence lenght polimorphism) są szeregami powtórzeń sekwencji - a

więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. Podstawą

zmienności są indele (delecje lub insercje). Aby ustalić homologię dwóch sekwencji

nukleotydowych wykonujemy ich przyrównanie (uliniowanie), czyli tzw. ang. alignment).

2

Podczas przyrównania sekwencji nie można odróżnić od siebie delecji od insercji. Nadaje im

się zatem wspólną nazwę indele].

• Minisatelity-VNTR (ang. variable number of tandem repeats) – jednostka

powtarzająca się, złożona z kilkudziesięciu nukleotydów (10-100 bp).

• Mikrosatelity – STR, msDNA (ang. simple tandem repeats), czyli proste powtórzenia

tandemowe, w których powtarzalny motyw złożony jest z 2 do 6 bp (np. CAAG, TGA

lub CA). Typowe loci mikrosatelitarne zawierają 10-30 (maksymalnie. 50) powtórzeń

motywu i osiąga długość 100 do 400 bp. Zlokalizowane są najczęściej w regionach

niekodujących genomu.

Allele (warianty długości jednego locus) mikrosatelitów są koodominujące i

dziedziczą się w sposób mendlowski. Jeśli mamy do czynienia z 2 identycznymi

allelami w locus, to taki osobnik jest dla tego locus homozygotą. Jeśli allele są różnej

długości – heterozygotą.

Ze względu na ich budowę, w mikrosatelitach często zachodzą mutacje.

Powtórzenia tandemowe powodują, że polimeraza DNA „ślizga się” (ang. polimerase

slippage), dodając lub opuszczając najczęściej pojedyncze powtórzenie, wydłużając

lub skracając tym samym sekwencję mikrosatelitarną. Oblicza się, że częstość

występowania mutacji w tych markerach u ssaków wynosi ok. 10

-2

– 10

-4

na

pokolenie. Jest ona zmienna u różnych grup organizmów i wyższa u zwierząt niż u

roślin. Im więcej powtórzeń znajduje się w danym allelu mikrosatelitarnym, tym

większe prawdopodobieństwo jego mutacji. Stąd po pewnym czasie dla danego locus

Powtarzaj

ący się motyw np. ATCG

osobnik1

osobnik2

osobnik3

Rys 1. Budowa loci
mikrosatelitarnych

3

(odcinka DNA) obecnych będzie wiele alleli. W związku z szybkim tempem mutacji

mikrosatelity są bardzo dobrym markerem do badań populacyjnych.

Zastosowanie badań genetycznych w ekologii

Od około 20 lat techniki genetyczne są wykorzystywane w badaniach ekologicznych,.

przede wszystkim do ustalania polimorfizmu genetycznego populacji. Czynniki i procesy

ekologiczne determinują strukturę genetyczną. W latach 70. i 80. XX wieku badano przede

wszystkim polimorfizm allozymów. W latach 90. nastąpił gwałtowny rozwój zastosowania

techniki PCR i sekwencjonowania. Obecnie w badaniach populacyjnych wykorzystuje się

najczęściej niekodujące sekwencje DNA, podlegające minimalnie lub wcale presji selekcyjnej

(doborowi naturalnemu). Sekwencje te są z reguły wysoce polimorficzne. Należą do nich w

jądrze sekwencje mikrosatelitarne (msDNA). Z sekwencji mitochondrialnych w badaniach

głównie. Filogeograficznych i populacyjnych wykorzystuje się D-loop oraz cytochrom b

(będący wysoce polimorficznym genem).

. Informacje uzyskane w oparciu o analizę sekwencji mtDNA i msDNA wykorzystuje się w

badaniach nad migracjami gatunków, określania efektywnej wielkości populacji, stopnia

przepływu genów, polimorfizmu genetycznego populacji, jej heterozygotyczności,

pokrewieństwa osobników, dystansu genetycznego między populacjami, przejścia populacji

przez wąskie gardło itd. Pamiętać należy, że mitochondrialny DNA dziedziczy się wyłącznie

w linii matczynej, w związku z czym jego analiza dostarcza informacji dotyczących jedynie

części populacji (samic lub kobiet). W zależności od charakteru badań wykorzystuje się

jeden lub obydwa wyżej opisane markery molekularne.

Replikacja

Poślizg

Nowy cykl replikacji

+ 1 motyw

- 1 motyw

Rys 3. Przykład poślizgu polimerazy podczas replikacji
(http://www.scielo.br/img/revistas/gmb/v29n2/a18fig02.gif)

4

Genetyka ochronna (ang. Conservation genetics).

Zgodnie z powszechnie akceptowanymi zasadami ekologii na świecie, restytucję bądź

ochronę gatunków powinna poprzedzać staranna analiza genetyczna, której wyniki pozwalają

ocenić, czy zakres polimorfizmu genetycznego zachowanych lub introdukowanych populacji

jest wystarczający dla powodzenia projektu ochronnych. Zastosowanie metod genetycznych

pozwala poznać różnorodność (polimorfizm genetyczny) populacji, jak i określić przepływ

genów między populacjami. Możliwe jest także ustalenie stopnia i obecności hybrydyzacji

pomiędzy gatunkami autochtonicznymi a pokrewnymi, introdukowanymi przez człowieka.

Wiedza ta jest niezbędna dla prawidłowej odbudowy populacji gatunku, który na danym

obszarze kiedyś występował lub umożliwienie naturalnego jej odrodzenia się. Wyżej opisane

działania zyskały nazwę conservation genetics – w wolnym tłumaczeniu „genetyka ochronna”

(Hedrik, 2001). Genetyka ochronna to połączenie ekologii, genetyki populacyjnej,

modelowania matematycznego, taksonomii i mikroewolucjonizmu. Poznanie dokładnie

struktury ekologicznej i genetycznej pomaga w aktywnej ochronie gatunków.

Genetyka w kryminalistyce.

Identyfikacja osób i określanie pokrewieństwa.

W ostatnich latach, rozwój technik izolacji DNA oraz możliwość analizy wielu loci

mikrosatelitarnych jednocześnie, dostarczyła niezawodnego narzędzia do ustalania

identyczności lub stopień pokrewieństwa osobników. Możliwości te wykorzystywane są

dzisiaj w wielu zagadnieniach medycyny sądowej (ang. forensic science) takich jak określanie

związku pomiędzy śladami biologicznymi, identyfikacja ofiar katastrof, ustalanie ojcostwa

lub pokrewieństwa dla celów spadkowych czy imigracyjnych.

Identyfikacja osób – podstawy teoretyczne:

Aby stwierdzić, że przykładowo, plama krwi znaleziona na miejscu morderstwa

pochodzi od konkretnego podejrzanego, trzeba porównać profile mikrosatelitarne uzyskane z

krwi oraz od podejrzanego. Aby uzyskane wyniki były wiarygodne i porównywalne np.

pomiędzy bazami danych w różnych krajach, organizacje takie jak FBI w USA czy ISFS

(ang. Intrnational Society of Forensic Science) w Europie stworzono zestawy loci

mikrosatelitarnych autosomalnych (położonych na chromosomach autosomalnych)

wykorzystywane do celów identyfikacyjnych. W USA zestaw ten nazwano CODIS (ang.

Combined DNA Identification System) i zawiera on 13 loci:

5

• CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,

D13S317, D16S539, D18S51, D21S11

• Amelogenina – marker pozwalający na określenie płci

W Europie funkcjonuje kilka systemów zawierających podobne zestawy, obejmujące tzw.

ang. European Core Loci set:

• FGA, TH01, VWA, D2S1338, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D19S433,

D21S11

• Amelogenina

Jeżeli obydwa uzyskane profile są jednakowe (tzn. posiadają identyczne allele we

wszystkich loci), mamy podstawy by sądzić, że pochodzą one od jednej osoby. Jednak

możliwe jest, że 2 lub więcej niespokrewnionych osób w populacji posiada taki sam profil

genetyczny zupełnie przypadkowo. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia określane jest

jako prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności (ang. match probability, mp). Takie

prawdopodobieństwo obliczane jest za każdym razem dla danego profilu genetycznego na

podstawie danych populacyjnych z danego regionu. Prawdopodobieństwo przypadkowego

pojawienia się danego profilu u dwóch niespokrewnionych osób w populacji zależy do ilości

wykorzystanych loci oraz ich zmienności w populacji. Dla zestawu CODIS wynosi ono

średnio 5 x 10

-15

a dla dostępnych komercyjnie zestawów sięga nawet 7,2 x 10

-19

. Innymi

słowy oznacza to, że konkretny profil genetyczny wystąpi raz na miliony miliardów osób, a

jest to liczba znacznie większa niż kiedykolwiek żyło ludzi na Ziemi. Zapewnia to prawie

100% pewność, że zgodne (identyczne) profile należą do jednej osoby. Jednak tak, jak z

całkowitą pewnością można stwierdzić, że profile nie należą do tej samej osoby (nie są

zgodne), tak prawdopodobieństwo, że profile pochodzą od jednej osoby nigdy nie osiąga

100%.

W kryminalistyce często wykorzystuje się mikrosatelity zlokalizowane na

chromosomie Y. Takie analizy wykonuje się szczególnie w przypadku przestępstw na tle

seksualnym, kiedy uzyskana próbka jest mieszaniną materiału pochodzącego od kobiety i od

mężczyzny i nie udaje się uzyskać czystego profilu mikrosatelitów autosomalnych.

Specyficzna amplifikacja mikrosatelitów zlokalizowanych na chromosomie Y pozwala

uzyskanie profilu, który można porównać z profilami podejrzanych. Wadą markerów na

chromosomie Y jest to, że dziedziczą się niezmienione z ojca na syna, przez co nie można

odróżnić krewnych w linii męskiej. Z tego powodu z reguły traktuje się je jako tzw. markery

wykluczające. Oznacza to, że można jedynie wykluczyć podejrzanego, kiedy profile są

niezgodne.

6

Określanie pokrewieństwa

Jeżeli dwie osoby są ze sobą spokrewnione, to posiadają pewną część jednakowych

alleli. Allele jednakowe u dwóch osób, kiedy ich identyczność wynika z pokrewieństwa (czyli

odziedziczenia tego samego allelu po wspólnym przodku), określa się jako IBD (ang. identity-

by-descent, identyczne poprzez pochodzenie). Przeciwieństwem takiej sytuacji jest

występowanie identycznych alleli u dwóch osób, kiedy to allele te nie pochodzą od jednego

przodka/chromosomu. O takich allelach mówimy, że są IBS (ang. Identity-by-state).

Posiadając profile genetyczne dwóch osób, można określić, jaka część ich alleli jest

wspólna ze względu na pochodzenie (IBD) i na tej podstawie określić stopień pokrewieństwa

pomiędzy tymi osobami.

Określanie pokrewieństwa jest wykorzystywane przy testowaniu ojcostwa, sprawach

imigracyjnych czy identyfikacji zmarłych. Wykorzystuje się je także w badaniach nad

restytucją gatunków. Przykładowo ważne jest określenie stopnia pokrewieństwa narybku,

którym prowadzi się zarybienia. Ponadto zaplanować można dokładny schemat krzyżowań

osobników przeznaczonych do rozrodu, by uniknąć chowu wsobnego.

Przypomnieć sobie:

Jądrowy i mitochondrialny DNA (charakterystyka ogólna szczególnie człowieka).

Literatura:

Genetyka molekularna PWN (2006) pod red. P. Węgleński rozdział 11 (koniecznie:

koncepcja „out of Africa”)

Literatura mini i mikrosatelity Genomy – strony: 20-22, 136-137, 414-421.

(MATERIAŁ DODATKOWY – nie wymagany!)

Pętla D – (ang. displacement loop, d-loop) zwany też regionem kontrolnym, (ang. control

region). Uznawany jest za najbardziej zmienny odcinek genomu mitochodrialnego. Ma on

długość około 1000 bp. Cechą tego markera genetycznego jest jego neutralność selekcyjna. W

obrębie pętli D mieszczą się trzy hiperzmienne regiony HVR1, HVR2 oraz HVR3 (ang.

hipervariable region), w których mutacje powstają znacznie częściej aniżeli w pozostałej

7

części regionu kontrolnego. Na samym końcu 3’ D-loop mieści region polipirymidynowy,

złożony z ciągu powtórzonej cytozyny lub tyminy. Funkcją D-loop jest rozpoczęcie replikacji

genomu mitochondrialnego. Tutaj mieści się region ori.

Na podstawie zmian mutacyjnych (substytucji, delecji oraz insercji - indeli) - przede

wszystkim w obrębie HVR1 utworzono haplogrupy, czyli grupy sekwencji (haplotypów) o

pewnym wspólnym wzorze nukleotydów (np. u ludzi: haplogrupy A,B,C,D). Wewnątrz

każdej haplogrupy istnieją haplotypy, zawierające pewne wspólne podstawienia

nukeotydowe, specyficzne dla danej haplogrupy. Haplotyp jest właściwym określeniem w

stosunku do mtDNA (nie allel!). Wszystkie geny genomu mtDNA są dziedziczone wspólnie,

zatem odmiany sekwencji są haplotypami. Ponadto na podstawie danych tysięcy sekwencji

nukleotydowych ludzi stworzono mapę migracji ludzkości na świecie. Podobne badaniach

przeprowadza się na innych gatunkach rekonstruując ich historię i ewolucję. Mogą to być

badania filogeograficzne (np. rozprzestrzenianie się populacji) oraz filogenetyczne (czyli

rekonstrukcja pokrewieństwa różnych taksonów).

Wykorzystanie loci mikrosatelitarnych w badaniach populacyjnych

Mikrosatelity znajdują zastosowanie w badaniach mechanizmów ewolucyjnych, które

zachodzą w stosunkowo krótkim czasie. Za ich pomocą analizuje się dystans genetyczny

pomiędzy populacjami. Ponadto bada się procesy demograficzne, takie jak gwałtowne

wahania liczebności.

Mogą one być spowodowane efektem wąskiego gardła (ang. bottleneck) lub efektem

założyciela (ang. founder effect), czyli kolonizacją małą liczbą osobników. Na takie populacje

silnie działa dryf genetyczny (losowe utrwalanie się – fiksacja (ang. fixation)) lub eliminacja

części alleli oraz zmiana ich frekwencji) ze względu na odtwarzanie populacji z małej liczby

przypadkowych osobników.

Z kolei czynniki behawioralne, do których należy dobór płciowy, terytorializm,

decydują o tym, które genotypy (określone zestawy alleli danych genów w osobniku) będą

uczestniczyły w rozrodzie, a tym samym zostaną przekazane do kolejnych pokoleń. Na tym

poziomie rozgrywa się tzw. selekcja określonych fenotypów, które jednak mają swoje

odzwierciedlenie w konkretnym genotypie. Poligamia również jest źródłem ograniczenia

polimorfizmu danej populacji, szczególnie mało liczebnej. Szczególne zastosowanie znajdują

badania polimorfizmu mikrosatelitów u gatunków zagrożonych wymarciem, które często są

populacjami izolowanymi o ograniczonym polimorfizmie i przepływie genów. Poznanie

dokładnie ich struktury ekologicznej i genetycznej pomaga w aktywnej ochronie tych

8

gatunków. Migracyjność osobników przeciwdziała wsobności (ang. ibreeding)i sprzyja

wymianie materiału genetycznego (ang. outbreeding). Wykorzystując sekwencje

mikrosatelitarne, możliwe jest wykrycie migrantów lub ich potomstwa w danej populacji oraz

wskazanie, z jakiej populacji prawdopodobnie pochodziły.

Z czynników środowiskowych, które silnie oddziałują na strukturę genetyczną

wymienić można stopień izolacji, którego wpływ skutkuje ograniczeniem polimorfizmu

populacji, jeśli jest ona mało liczebna, w związku z ograniczonym przepływem genów. Na

taką izolowaną populację będą silniej oddziaływać czynniki losowe, takie jak np. dryf

genetyczny. Nasilone kojarzenie wsobne w tych populacjach może prowadzić do załamania

się populacji (ang. inbreeding depression). Możliwe jest określenie efektywniej wielkości

populacji (N

E

), która jest wyznacznikiem kondycji genetycznej danej populacji. Jej wartość

zwykle drastycznie maleje w wyniku wspomnianych wyżej efektów szyjki od butelki, efektu

założyciela czy występowania wsobności. Czasami jednak kojarzenie wsobne może mieć

działanie korzystne dla populacji (ang. puring selection). Jako, że w takiej populacji

większość osobników to homozygoty pod względem wielu genów, w wyniku selekcji

pozostaną jedynie osobniki najlepiej przystosowane do lokalnych warunków środowiska.

Większe jest też prawdopodobieństwo wyeliminowania alleli genów powodujących choroby

genetyczne. Krzyżowanie się w takiej sytuacji osobników z dwóch populacji

przystosowanych do odmiennych warunków środowiska, może mieć skutek w gorszym

dostosowaniu potomstwa poprzez rozrywanie korzystnych kombinacji alleli różnych genów

(ang. outbreeding depression). Z drugiej strony, taka pozbawiona polimorfizmu populacja jest

mało odporna na zmiany warunków środowiska, np. pojawienie się nowego czynnika

chorobotwórczego. Poza tym łatwiej dochodzi do ujawniania się recesywnych chorób

genetycznych.

Analiza mikrosatelitów

Obecnie mikrosatelity analizuje się za pomocą elektroforezy kapilarnej (ang. capilary

electrophoresis) w sekwenatorze. W tym celu jeden z 2 starterów znakuje się barwnikiem

fluorescencyjnym. Ustalanie długości produktów PCR polega na rejestrze czasu, jaki upływa

od rozpoczęcia elektroforezy w żelu, do momentu otrzymania sygnału świetlnego,

pochodzącego od fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów. Za pomocą standardu, oblicza

się długość analizowanych fragmentów DNA (czas migracji produktu w żelu jest

proporcjonalny do jego długości). Istnieje wiele programów, dzięki którym można ustalić

długości alleli (np. Peak Scanner). Przed analiza statystyczną, należy wykluczyć obecność:

9

• tzw. ang. allelic dropout – ADO, obecność tylko 1 allelu (z 2) mającego źródło w

jego preferencyjnym namnażaniu się, najczęściej krótszego (dotyczy to zwykle

alleli powyżej 300 pz),

• fałszywych alleli (ang. false allels, FA),

• artefaktów elektroforetycznych (ang. electrophoresis artefacts, EA) powstających

między innymi na skutek błędów sekwenatora,

• alleli zerowych (ang. null allels, NA), mających źródło w wyniku zmiany

sekwencji w miejscu przyłączania się startera, na skutek mutacji.

Wykonuje się też analizę ewentualnego sprzężenia loci mikrosatelitarnych ze sobą

(ang. linked loci) czyli nielosowej dystrybucji alleli (ang. linkage disequilibrium). Może być

ona zaburzona, jeśli dwa loci leżą blisko siebie na jednym chromosomie. W przypadku

obliczeń wykonanych na loci sprzężonych ze sobą można otrzymać fałszywe wyniki.

Wykonuje się analizy używając sprzężonych loci, ale wykorzystuje się wówczas inne

algorytmy. Wymienione artefakty (poza FA) oraz sprzężenie doprowadzają do

przeszacowania liczby homozygot (ang. false homozygote, FH).

Równowaga Hardy’ego-Weinberga

Prawo Hardy’ego –Weinberga (ang. Hardy-Weinberg Equillibrium; HWE), mówi, że ddy

populacja znajduje się w stanie równowagi, to przy określonej frekwencji allelu p oraz q

prawdziwe jest równanie, że

p

2

+2pq+q

2

=1; (gdzie p+q=1)

W stanie równowagi populacja znajduje się, gdy nie obserwuje się wysokiej częstości mutacji

oraz zjawisk selekcji, migracji i dryfu genetycznego. Warunkiem dochodzenia do stanu

równowagi populacji jest także losowość kojarzenia się osobników i ich wystarczająco duża l

liczba Odstępstwa od HWE świadczą o obecności procesów demograficznych, które

zmieniają (zaburzają) frekwencje i rozkład alleli.

Polimorfizm loci:

W badaniach zmienności (polimorfizmu) loci mikrosatelitarnych wykorzystuje się

następujące wskaźniki:

•

Liczba alleli w danym locus (Na)

•

Bogactwo alleli (R) – uwzględnią wielkość próby przyrównując do populacji o

najmniejszej liczebności

10

•

Liczba alleli prywatnych (Np) – liczba alleli charakterystyczna tylko dla danej

populacji.

•

Heterozygotyczność o oczekiwana – H

E

dla frekwencji alleli danego locus w populacji

szacuje się, jaki powinien być udział heterozygot w warunkach równowagi

Hardy’ego-Weinberga.

•

Heterozygotyczność obserwowana – H

O

- oblicza się rzeczywista frekwencje

heterozygot występujących w populacji.

Statystyka Wrighta

Współczynnik wsobności (ang. inbred, fixation index):

• F

IS

= 1 – (H

O

/ H

E

) - wsp. inbredu – określa stopień wsobność, czyli proporcję

heterozygotyczności obserwowanej do oczekiwanej w obrębie populacji, losowość

kojarzenia się osobników (panmiksje). Wartości F

IS

< -1; 1 >:

o Nieistotne wartości F

IS

oraz F

IS

= 0 oznaczają, że populacja jest w

równowadze Hardy’ego Weinberga i brak jest struktury wewnętrznej w tej

populacji.

o Istotne statystycznie wartości F

IS

> 0 mogą wskazywać na: efekty wsobności

(ang. inbreeding), istnienie struktury wewnętrznej w populacji (występowanie

subpopulacji), dryf genetyczny, istnienie doboru płciowego, fizyczne

sprzężenie loci, jako że w populacji występuje nadmiar homozygot.

o Znaczące wartości F

IS

< 0 oznaczają, iż w populacji występuje nadmiar

heterozygot, który może być wynikiem selekcji na heterozygoty albo efektem

szyjki od butelki.

• Współczynnik F

ST

– wsp. utrwalenia - określa spadek heterozygotyczności w

subpopulacji w stosunku do całej populacji, na skutek np. selekcji lub dryfu

genetycznego. Jego wartości wskazują, jak intensywny jest przepływ genów pomiędzy

subpopulacjami. Mówi od dystansie genetycznym pomiędzy populacjami. Wartości:

o 0 - 0,05 – małe genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,05 - 0,15 – średnie genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,15 - 0,25 – duże genetyczne zróżnicowanie populacji

o 0,25 – bardzo duże genetyczne zróżnicowanie populacji