ANALIZA DNA

ANALIZA DNA

ANALIZA DNA

ANALIZA DNA

W ŻELACH

W ŻELACH

W ŻELACH

W ŻELACH AGAROZOWYCH

AGAROZOWYCH

AGAROZOWYCH

AGAROZOWYCH

I POLIAKRYLAMIDOWYCH

I POLIAKRYLAMIDOWYCH

I POLIAKRYLAMIDOWYCH

I POLIAKRYLAMIDOWYCH

Katedra Genetyki Molekularnej

Metoda rozdzielania molekuł w polu elektrycznym na podstawie ich wielko

ś

ci,

kształtu i ładunku.

Elektroforeza kwasów

nukleinowych

jedna z głównych metod identyfikacji,

rozdzielania i oczyszczania kwasów

nukleinowych

stosowana zarówno w celach

analitycznych, jak i preparatywnych

Elektroforeza analityczna

Zastosowanie:

a) Ustalenie wielkości fragmentu DNA lub RNA na podstawie porównania tempa

migracji badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych

b) Ustalenie ilości preparatu na podstawie porównania intensywności

fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego

fluorescencji badanego prążka do preparatu DNA wzorcowego

c) Identyfikację ewentualnej degradacji preparatu. Degradacja widoczna jest na

żelu w postaci smugi, która jest wynikiem rozpadu DNA lub RNA na mniejsze

fragmenty

d) Identyfikację zanieczyszczeń obecnych w preparacie.

Elektroforeza preparatywna

Umożliwia izolację z żelu tej części

preparatu, którą zamierzamy użyć

do dalszych etapów badań –

do dalszych etapów badań –

stosujemy wówczas elucję z żelu.

Migracja w żelach

elektroforetycznych

W polu elektrycznym przy lekko

zasadowym pH ujemnie naładowane

cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku

cząsteczki DNA lub RNA migrują w kierunku

elektrody (+) anody i przeciskając się przez

pory żelu rozdzielają się pod względem

wielkości.

duże cząsteczki wędrują wolniej niż małe

Rodzaje żeli

elektroforetycznych

żele poliakrylamidowe – stosuje się do rozdziałów mniejszych fragmentów

DNA (5-2000 pz).

Elektroforeza przeprowadzona we własciwych warunkach umożliwia

rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego

rozdział cząsteczek kwasów nukleinowych z dokłądnością do jednego

nukleotydu

żele agarozowe – można w nich rozdzielać znacznie większe cząsteczki

kwasów nukleinowych (50 – 30000 pz)

Nie umożliwiają uzyskania tak wysokiej rozdzielczości jak żele

poliakrylamidowe

Elektroforeza w żelach

poliakrylamidowych

ś

el poliakrylamidowy powstaje w wyniku

polimeryzacji N,N metylenobisakrylamidu z

monomerami akrylamidu w obecno

ś

ci wolnych

rodników dostarczanych przez nadsiarczan

amonu (APS) i stabilizowanych przez TEMED

(N, N, N , N - tetrametylenodiamina).

Rozdzielczość żeli zależy od
stężenia poliakrylamidu

St

ęż

enie poliakrylamidu [%]

Zakres długo

ś

ci rozdzielanego

liniowego DNA (kpz)

3,5

1000-2000

5,5

80-500

8,0

60-400

12,0

40-200

15,0

25-150

20,0

6-100

Elektroforeza w żelach

poliakrylamidowych

Elektroforeza w żelach

agarozowych

Agaroza – frakcja agaru oczyszczona z
krasnorostów, polisacharyd zbudowany z
około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy

Wielość porów żelu agarozowego zależy od
stężenia agarozy i określa zakres wielkości

stężenia agarozy i określa zakres wielkości
rozdzielanego DNA lub RNA

Wadą elektroforezy agarozowej jest słaba
rozdzielczość frakcji DNA różniącego się
poniżej 5% wielkości.

Stężenie agarozy i zakres

rozdzielanych fragmentów DNA

St

ęż

enie agarozy [%]

Zakres długo

ś

ci rozdzielanego

liniowego DNA (kpz)

0,3

5-60

0,6

1-20

0,6

1-20

0,7

0,8-10

0,9

0,5-7

1,2

0,4-6

1,5

0,2-3

2,0

0,1-2

Elektroforeza w żelach

agarozowych

Bufory elektroforetyczne

Bufory elektroforetyczne

Lp.

Nazwa buforu

Stężenie robocze

Stężenie roztworu wyjściowego (składniki na 1
litr)

1

Tris - octan (TAE)

1x: 0.04M Tris - octan,
0.001M EDTA

50x: 242g Tris base,
57.1 ml lodowatego kwasu octowego,
100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0

2

Tris - fosforan (TPE)

1x: 0.09M Tris - fosforan,
0.002M EDTA

10x: 108g Tris - base,
15.5 ml 85% kwasu fosforowego

3

Tris - boran (TBE)

0.5x: 0.045M Tris - boran,
0.001M EDTA

5x: 54gTris - base,
27.5g kwasu bornego,
20 ml 0.5M EDTA pH 8.0

4

Alkaliczny

1x: 50mM NaOH,
1mM EDTA

10x: 5ml 10N NaOH,
2ml 0.5M EDTA pH 8.0

Markery wielkości

Wzorce o znanej wielko

ś

ci mas

cz

ą

steczkowych słu

żą

ce do okre

ś

lenia

wielko

ś

ci analizowanych fragmentów DNA

b

ą

d

ź

RNA

odpowiednio przygotowane fragmenty DNA

odpowiednio przygotowane fragmenty DNA

powstaj

ą

ce w wyniku hydrolizy DNA faga

lambda lub plazmidów enzymami

restrykcyjnymi EcoRI i HindIII

syntetyczne DNA o okre

ś

lonych wielko

ś

ciach

fragmentów

Barwienie żeli

Metody wizualizacji kwasów

nukleinowych:

barwienie bromkiem etydyny

barwienie srebrem

SYBR Green

radioaktywnymi izotopami (siarki lub

fosforu)

Bromek etydyny

Bromek etydyny interkaluje pomiędzy
sąsiednie pary zasad dwuniciowego DNA.

Stwierdzono także większe powinowactwo
bromku do dwuniciowego DNA (dsDNA)
niż do jednoniciowego (ssDNA), przez co
barwienie struktur jednoniciowych w

barwienie struktur jednoniciowych w
niektórych sytuacjach może okazać się
niewystarczające.

Kompleks bromek etydyny /DNA może być
łatwo uwidoczniony fluorescencyjnie w
świetle UV.

Stężenie bromku etydyny 5µg/ml

Bromek etydyny jest silnym

mutagenem!

Wykonanie ćwiczeń

Elektroforeza w

ż

elu agarozowym

1)

Przygotowa

ć

2%

ż

el agarozowy w buforze TAE . Nawa

ż

k

ę

agarozy rozpu

ś

ci

ć

w TAEx1, podgrza

ć

do temperatury 100

°

C, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów. Ostudzi

ć

przygotowany roztwór.

2)

Wla

ć

roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z

umocowanym grzebieniem formuj

ą

cym studzienki do nanoszenia próbek.

3)

Po zastygni

ę

ciu agarozy zala

ć

ż

el buforem elektroforetycznym TAEx1, powierzchnia buforu

powinna znajdowa

ć

si

ę

około 1 cm ponad górn

ą

powierzchni

ą

ż

elu. Powoli wyj

ąć

grzebie

ń

, tak

aby nie uszkodzi

ć

studzienek

ż

elu.

4)

Wymiesza

ć

w probówce eppendorfa 10 µl wcze

ś

niej przygotowanego roztworu DNA i 2µl buforu

obci

ąż

aj

ą

cego, dokładnie wymiesza

ć

, cało

ść

nanie

ść

na

ż

el.

5)

Podł

ą

czy

ć

elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.

6)

Elektroforez

ę

prowadzi

ć

przez 1 godz. przy napi

ę

ciu 80 V.

7)

Po zako

ń

czeniu elektroforezy

ż

el wybarwi

ć

w bromku etydyny (5µg/ml) około 5 min

8)

ś

el obejrze

ć

w

ś

wietle UV

λ

= 320 nm.

Elektroforeza w

ż

elu poliakrylamidowym

1)

Przygotowa

ć

8% roztwór akrylamidu (st

ęż

enie wyj

ś

ciowe 30%) w buforze TBEx1

2)

Umyte i odtłuszczone płyty szklane zło

ż

y

ć

(wkładaj

ą

c pomi

ę

dzy nie uszczelk

ę

), cało

ść

przymocowa

ć

klipsami do podstawki do wylewania

ż

elu.

3)

Wla

ć

roztwór akrylamidu do momentu wypełnienia całej powierzchni pomi

ę

dzy płytami.

4)

Wło

ż

y

ć

grzebie

ń

. Polimeryzacja

ż

elu trwa 30 min, po spolimeryzowaniu wyj

ąć

uszczelk

ę

, umie

ś

ci

ć

płyty w aparacie do elektroforezy.

5)

Napełni

ć

aparat buforem TBEx1. Wyj

ąć

grzebie

ń

, przepłuka

ć

studzienki buforem

elektroforetycznym.

6)

Przygotowane wcze

ś

niej próbki DNA zmiesza

ć

z buforem obci

ąż

aj

ą

cym (15 µl DNA + 3 µl buforu

obci

ąż

aj

ą

cego) i nanie

ść

do studzienek.

7)

Do jednej studzienki nanie

ść

3 µl markera (100 bp).

8)

Podł

ą

czy

ć

elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.

9)

Elektroforez

ę

prowadzi

ć

przez 1,5 godz. przy napi

ę

ciu 80 V/120 mA

10) Po zako

ń

czeniu elektroforezy

ż

el wybarwi

ć

w bromku etydyny (5µg/ml) przez około 5 min

11)

ś

el obejrze

ć

w

ś

wietle UV

λ

= 320 nm

.