W1

DNA: izolacja i

analiza

Budowa DNA

DNA jest materiałem

genetycznym komórki

Analiza DNA

• Dzięki

swojej

regularnej

budowie

i

niewielkiej ilości elementów niosących

informację

(4 zasady azotowe) DNA jest wdzięcznym

materiałem do badań.

• Posiadamy szereg narzędzi pozwalających

na izolację i analizę DNA.

• Fragmenty DNA o identycznej sekwencji

mogą być łatwo rozpoznawane.

Izolacja DNA

• Źródło: bakterie, komórki, tkanki
• Liza komórek
• Wytrawienie białek
• Odbiałczenie
• Wytrącenie DNA
• Odwirowanie osadu i rozpuszczenie DNA
• Oznaczenie stężenia

•

Źródło: bakterie, komórki, tkanki

•

Liza komórek [3M NaCl, 0.4 M Tris*HCl pH 7.8,

20 mM EDTA (bufor rozbijający wiązania jonowe)

+ SDS (rozbija wiązania hydrofobowe)]

•

Wytrawienie białek (proteinaza K: 0.1 mg/ml)

•

Odbiałczenie przez wytrząsanie z równą

objętością mieszaniny fenolu i chloroformu (pH

8.0) i wirowanie (tworzą się 2 fazy: DNA pozostaje

w fazie wodnej, wytrącone białka na granicy faz,

po wirowaniu zbiera się fazę wodną i odbiałcza

ponownie)

•

Wytrącenie DNA z odbiałczonego roztworu

(dodanie octanu amonu do stężenia ok.0.3 M i 2

objętości zimnego /-20

0

C/ etanolu)

•

Odwirowanie precypitatu i rozpuszczenie osadu

DNA

•

Oznaczenie stężenia: spektrofotometryczne

przy długości fali 260nm

SDS
Sodium dodecyl sulfate
Siarczan dodecylu sodu
wpływa na rozpad wiązań hydrofobowych

Obecność jonów jednowartościowych (3M

NaCl) wpływa na rozpad wiązań jonowych

Izolacja plazmidowego DNA oparta

jest

przede wszystkim na różnicy w

renaturacji

DNA komórkowego i DNA plazmidu

•Najpowszechniej stosowana jest metoda lizy
w warunkach alkalicznych lub przez gotowanie.
W tych warunkach następuje denaturacja DNA
chromosomowego i większości białek. Koliste
cząsteczki plazmidu mimo denaturacji nie mogą
rozdzielić nici, co ułatwia późniejszą renaturację.

•Uwaga!

Przedłużone

działanie

zasad

lub

wysokiej temperatury powoduje nieodwracalną
denaturację

plazmidu.

Powstający

nieuporządkowany kłębek DNA nie poddaje się
obróbce enzymatycznej.
•Duże plazmidy (powyżej 15 kpz) wymagają
ostrożnego traktowania, co zapobiega ich
rozerwaniu.

Oznaczanie DNA metodą

spektrofotometryczną

Dla kwasów nukleinowych lambda

max

=260 nm

Dla białek (aminokwasy aromatyczne) lambda

max

=280 nm

Stosunek A

260

/A

280

powinien wynosić dla czystego DNA 1.8,

wartości wyższe świadczą o zanieczyszczeniu RNA, niższe o

zanieczyszczeniu białkami lub fenolem.

Wiązania peptydowe absorbują światło o długości fali 220-230 nm

A

b

so

rp

c

j

a

Długość fali (nm)

220

260

300

Inne metody oznaczania DNA

1. Metoda

fluorometryczna

przy

użyciu

barwnika Hoechst 33258. Próbę badaną
porównuje

się

z krzywą wzorcową (w zakresie 10-250
ng/ml) o tym samym składzie zasad.
Stosowane

tylko

do

DNA

wysokocząsteczkowego.

2. Test kroplowy z bromkiem etydyny. Na

płytkę agarozową zawierającą 0.5 g/ml
bromku etydyny nakrapia się wzorzec oraz
badane DNA. Rezultaty można zapisywać w
formie fotografii.

Temperatura topnienia

DNA

Ze względu na różnice w absorbancji

A

260

pomiędzy DNA dwuniciowym,

a jednoniciowym, można określić
temperaturę,

w

której

połowa

cząsteczek DNA występuje w formie
jednoniciowej (zdenaturowanej).

Tę

temperaturę

nazywamy

temperaturą topnienia = Tm

Wyznaczanie temperatury topnienia DNA

Denaturacja różnych

cząsteczek DNA

Oczyszczanie plazmidowego DNA

przez wirowanie w gradiencie

chlorku cezu

Chromosomowe

i plazmidowe DNA

różnią się gęstością
(odpowiednio 1.54 i

1.59 g/cm

3

) i

tworzą dwa

niezależne pasma

w gradiencie CsCl

Wiązanie EtBr do DNA (w
warunkach nasycenia średnio 1
cząsteczka na 2.5 pz) obniża
jego gęstość

Zbieranie plazmidowego DNA z

gradientu CsCl zawierającego bromek

etydyny

Cięcie cząsteczek DNA

na fragmenty

Rozbijanie ultradźwiękami (ultrasonikacja)
Rozrywanie w czasie przepływu cieczy
(nebulizacja)
Trawienie nukleazami

Dezoksyrybonukleazy (DNazy):



Egzonukleazy



Endonukleazy:

•

niespecyficzne względem sekwencji

(nukleaza

mikrokokalna, DNaza I,

egzonukleaza III)

•

specyficzne względem sekwencji (enzymy

restrykcyjne)

Typy enzymów

restrykcyjnych

• Typ I

– złożone, zawierające wiele podjednostek,

przecinają DNA w przypadkowym miejscu z dala

od sekwencji rozpoznawanej. Często zawierają

kombinację enzymów restrykcji-modyfikacji.

• Typ II

– przecinają DNA w określonych miejscach,

blisko lub w samej sekwencji rozpoznawanej.

• Typ IIs

– enzymy, które przecinają DNA w

określonej (kilka, kilkanaście nukleotydów)

odległości od sekwencji rozpoznawanej, zawsze

po jednej stronie.

• Typ III

podobne do typu I, jednak do

rozpoznawania sekwencji wymagają dwóch

takich

sekwencji

o naprzeciwległej orientacji na tej samej

cząsteczce DNA.

Nazewnictwo enzymów

restrykcyjnych

Sekwencje rozpoznawane

przez enzymy restrykcyjne

Enzymy

restrykcyjne

często

rozpoznają

sekwencje

palindromiczne,

o

różnych

długościach,

od

czterech

do ośmiu i więcej zasad.

W genomie człowieka i wyższych eukariontów:

•enzymy „czwórkowe” generują fragmenty o
średniej długości 260 pz.

•enzymy „szóstkowe”

trawią DNA na

fragmenty
o średniej długości 4100 pz.

•enzym „szóstkowy” swoisty dla sekwencji
zawierającej GC daje fragmenty o średniej
długości 65000 pz.

Specyficzność enzymów

restrykcyjnych

• Specyficzne rozpoznawanie

sekwencji

• Specyficzne cięcie sekwencji DNA

Specyficzność cięcia DNA dotyczy

wyłącznie enzymów restrykcyjnych

typu II

Tylko endonukleazy restrykcyjne, które

przecinają DNA specyficznie względem

sekwencji, zapewniają powtarzalność

cięcia DNA na fragmenty

Rozpoznawanie
sekwencji
nukleotydowych
przez białka -

A

du

ży

ro

we

k

mały

row

ek

DNA

Białko

Specyficzne

rozpoznawanie

sekwencji

Rozpoznawanie sekwencji

nukleotydowych przez

białka -

G

BamHI przecina rozpoznawaną

sekwencję: G ' GATCC

Struktura dimeru BamHI

w sąsiedztwie sekwencji

niespecyficznej

Struktura dimeru BamHI

w miejscu

specyficznie

rozpoznawanej

sekwencji

Cięcie DNA na fragmenty -

końce

Enzymy restrykcyjne zawsze

zostawiają końce DNA:

• 3’ - OH
• 5’ – grupa fosforanowa

Takie końce są odpowiednie do

łączenia fragmentów przez ligazę

DNA

Rozdział cząsteczek różniących

się masą molekularną

Wytrącanie różnicowe
Elektroforeza w żelach

w stałym polu elektrycznym
w zmiennym polu elektrycznym

Wirowanie i ultrawirowanie
Chromatografia

Agaroza

Polisacharyd otrzymany z glonów.
Rozpuszczona w wodzie tworzy żel.
Używana w stężeniu 0.5 – 4%

standard – temperatura topnienia około 90

o

C

niskotopliwa – temperatura topnienia 40-85

o

C

Akrylamid - struktura

Żele agarozowe

i poliakrylamidowe

Agaroza

1. Duża rozpiętość rozdziału,

przy stosunkowo małej
rozdzielczości.

2. Żele 4 - 0.5% pozwalają

na rozdział cząsteczek
o długościach 100-60 tys.
pz.

3. Technika Puls-Field zwiększa

zasięg rozdziału w granicach
50 tys. do 6-7 mln pz.

4. Nietoksyczna.
5. Łatwe przygotowanie żelu.
6. Żele horyzontalne

.

Poliakrylamid

1. Mała rozpiętość rozdziału,

ale wysoka rozdzielczość
rozdziału (do 1 pz).

2. Żele 3.5 - 20% pozwalają

na rozdział DNA o
długościach 10 pz do 2
tys pz.

3. Akrylamid jest związkiem

silnie toksycznym,
poliakrylamid może
zawierać niewielkie ilości
niespolimeryzowanego
akrylamidu.

4. Bardziej skomplikowane

przygotowanie żelu.

5. Żele wertykalne

(pomiędzy szybami).

Typy agarozy i ich

zastosowanie

1. Agaroza standard – temp. topnienia

90

-95

0

C;

temp.

krzepnięcia

35-45

0

C. Rozdziały fragmentów 100

- 25 tys. pz.

2. Agaroza

niskotopliwa

-

temp.

topnienia

40

-

85

0

C;

temp.

krzepnięcia 8 - 35

0

C. Rozdziały

fragmentów 10 - 10 tys. pz
(np. po reakcji PCR). Zatapianie
żywych komórek do elektroforezy w
zmiennym polu elektrycznym.

3. Elektroendoosmoza (EEO) pogarsza

możliwości

rozdziału

w

żelach

agarozowych.

Wylewanie żelu

agarozowego

Nanoszenie próby, elektroforeza, obraz po

elektroforezie

Elektroforeza w żelu agarozowym;

zależność szybkości migracji od

masy (długości) cząsteczek DNA i od

stężenia agarozy

Elektroforeza w zmiennym

polu elektrycznym (PFGE)

Markery masy

cząsteczkowej

Fag lambda – 48502 pz, 40 genów

Hind III przecina go na 8 fragmentów
Eco RI na 6 fragmentów
Eco RV na 22 fragmenty

Lambda DNA/HindIII (pz)

plazmid pBR322 (4 361

pz) trawiony MspI

(fragmenty 67-622 pz)

23 130

9 416

6 557

4 361

2 322

2 027

564

125

Markery masy cząsteczkowej

2-log ladder

(0.1-10 kb)

1 kb ladder

(0,3-5 kb)

Chromosomy drożdży

(225-1 900 kb)

Identyfikacja DNA po

elektroforezie

•Użycie radioaktywnego DNA do
elektroforezy

•Hybrydyzacja z sondą radioaktywną

Interkalujący barwnik -

bromek etydyny (EtBr)

1. dodawanie do żelu –
obecny w trakcie
elektroforezy
2. płukanie żelu w
roztworze EtBr po
elektroforezie

Izolacja DNA z żelu

agarozowego

1. Elektroforeza do skrawków DEAE celulozy.
2. Elektroelucja do worka dializacyjnego
3. Odzyskiwanie DNA z niskotopliwej agarozy
4. Odzyskiwanie DNA z żelu przez adsorpcję na kulkach szklanych