1.2. Izolacja i analiza lipidów 21

szkło podstawowe;
kolba do wyparki;
wyparka próżniowa.

Postępowanie:
• 20 g liści lub 25 ml upakowanych chloroplastów umieścić w rozdzielaczu na

500 ml.

• Dodać 100 ml metanolu i wytrząsać przez kilka minut.
• Dodać 200 ml chloroformu i całość wytrząsać przez obracanie przez kilka

minut.

• Dodać 100 ml metanolu i dodatkowo mieszać przez chwilę.
• Dodać 150 ml roztworu chlorku sodowego i mieszać całość przez dodatkowe

kilka minut.

• Pozostawić na co najmniej 30 min dla rozdzielenia faz.
• Zebrać fazę dolną (około 200 ml).
• Do fazy górnej dodać 200 ml chloroformu i całość mieszać przez kilka minut;

pozostawić do rozdzielenia faz.

• Zebrać fazę dolną i połączyć ją z zebraną poprzednio fazą dolną.
• Do połączonych faz dodać 200 ml roztworu NaCl i wytrząsać przez kilka

minut; pozostawić na 60 min dla rozdzielenia faz.

• Zebrać fazę dolną i odparować z niej rozpuszczalnik. Dla ułatwienia odparo-

wania wody dodać do fazy dolnej izopropanolu (około 50 ml). Uzyskane
lipidy przechowywać w -70°C rozpuszczone w małej ilości chloroformu.

1.2. Izolacja i analiza lipidów

Po wyekstrahowaniu lipidów zwykle rozdziela się je na grupy na podstawie
różnic w rodzaju i ilości grup jonowych (fosforanowych, aminowych) i niejono-

wych (hydroksylowych, karbonylowych) obecnych w ich cząsteczkach. Do tego
celu stosuje się najczęściej techniki chromatograficzne. Do całkowitego rozdzie-
lenia mieszaniny lipidów stosuje się różne techniki chromatograficzne.

a) Chromatografia adsorbcyjna
Może być prowadzona na kolumnach w chromatografii cieczowej (LC, HPLC)

2

lub cienkich warstwach (TLC)

3

, najczęściej żelu krzemionkowego, w celu roz-

dzielenia złożonej mieszaniny na poszczególne klasy lipidów. Obserwowana
czasami tendencja do rozdzielania się lipidów w obrębie danych klas nie wpływa
na rozdział samych klas. W odpowiednich warunkach można rozdzielić węglo-

wodory, alkohole, aldehydy i kwasy tłuszczowe, a także frakcjonować poszcze-
gólne typy fosfoglicerydów czy też glikolipidów.

2

LC - Liquid Chromatography, HPLC - High Performance (Pressure) Liquid Chromatography.

3

TLC - Thin Layer Chromatography.

1. Lipidy 22

b) Chromatografia argentacyjna
Chromatografia jest prowadzona na kolumnach lub warstwach żelu krzemionko-
wego impregnowanego solami srebra, najczęściej azotanem srebrowym. Pozwala

ona na rozdzielenie każdej klasy lipidów na grupy związków posiadających tę
samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych. Np. alkohole alifatyczne mogą
być równocześnie rozdzielane na nasycone, jedno-, dwu- i trójnienasycone, a tak-

że na izomery cis i trans nienasycone. Zasada rozdziału polega na niskoenerge-
tycznym kompleksowaniu elektronów π wiązań podwójnych z jonami Ag

+

, które

występuje i jest zrywane podczas normalnego procesu chromatograficznego. Je-
żeli w czasie chromatografii część soli srebra ulega wymywaniu eluentem, nie
powoduje to zaburzeń w samym rozdziale. Sól srebrową obecną we frakcji lipido-
wej po rozdziale można usunąć przez rechromatografię na samym żelu krzemion-

kowym lub przez jej przemycie wodą.

c) Chromatografia faz odwróconych (Reversed Phase, RP)
Jest techniką rozdzielania mieszanin realizowaną przy użyciu różnych nośników,
modyfikowanym parafiną a obecnie najczęściej chemicznie żelu krzemionko-
wym. Modyfikowane chemicznie żele mają przyłączone do reszt silanolowych
(SiOH) alifatyczne łańcuchy węglowodorowe o różnej długości. Wraz z ich zwię-
kszeniem zwiększa się hydrofobowość nośnika. Takie chemicznie modyfikowane
żele mają w nazwie dodatkowe oznaczenie RP od „Reversed Phase". Obecnie
najczęściej stosuje się nośniki typu RP-2, RP-8 oraz RP-18, zwane też ODS (od

„octadecylsilica"). Elucję w tej technice prowadzi się z reguły układami dwu-

składnikowymi, z których jednym jest zawsze woda, np. metanol-woda, acetoni-
tryl-woda, aceton-woda. Technika faz odwróconych umożliwia rozdzielanie

mieszanin związków różniących się długością łańcucha lub też liczbą wiązań
podwójnych. Ponieważ stwierdzono, że w porównaniu do związku nasyconego

jedno wiązanie podwójne wywołuje efekt identyczny, jak skrócenie łańcucha

o dwa atomy węgla, dlatego rozdzielenie mieszanin zawierających homologi róż-

niące się zarówno długością, jak i liczbą wiązań podwójnych jest zwykle niemo-

żliwe. Stosując jednak chromatografię na fazach odwróconych w obecności soli
srebrowych, opisaną powyżej mieszaninę można rozdzielić.

d) Chromatografia jonowymienna

Wykazano, że lipidy niejonowe, obojnacze (zwitterjonowe) i kwaśne mogą być
efektywnie rozdzielane na kolumnach wypełnionych wymieniaczami jonowymi.
Najczęściej stosuje się pochodne celulozy - DEAE-celulozę i CM-celulozę.

e) Chromatografia gazowo-cieczowa
Technika ta umożliwia rozdział składników mieszaniny lipidów po ich przepro-

wadzeniu w lotne pochodne zarówno w zależności od długości łańcucha, jak i od

liczby wiązań podwójnych. Osiąga się również oddzielenie i rozdział związków
o łańcuchach prostych od związków mających łańcuchy rozgałęzione. Często

udaje się nawet rozdział izomerów konformacyjnych.

l 2. Izolacja i analiza lipidów 23

Zasady chromatografii oraz techniki są bardziej szczegółowo opisane np. w książ-

ce Chromatografia i jej zastosowania, A. Berthillier, PWN, Warszawa 1975.

1.2.1. Frakcjonowanie lipidów

metodą chromatografii na CM-celulozie

(wg Comfurius P., Zwaal R. F. A., Biochim. Biophys. Acta 488 (1977) 36-42)

Materiały i odczynniki:
karboksymetyloceluloza drobnoziarnista, forma sodowa (CM-52);

metanol;
chloroform.

Sprzęt:

kolumna szklana np. 2.5 x 30 cm z zaworem teflonowym;
rozdzielacz ze szlifem pasującym do wlotu kolumny;

zlewki do zbierania frakcji;

(azot w butli).

Przygotowanie kolumny:
Zregenerowaną i napęczniałą celulozę zawiesić w metanolu i dekantować kilka-
krotnie dla usunięcia bardzo drobnych włókien. Na dnie kolumny umieścić korek
z waty szklanej i wypełnić kolumnę w 1/3 metanolem. Wymieszać dokładnie
celulozę tak, by uzyskać jednorodną zawiesinę. Część zawiesiny (ok. 1/4) wlać do
kolumny uważając, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Podłączyć do
kolumny azot o zwiększonym ciśnieniu, tak by nadmiar metanolu został dosyć
szybko przepchnięty przez formujące się złoże. Dodać następną porcję zawiesiny

CM-celulozy i powtórzyć operację. Postępując w ten sposób wypełnić kolumnę
do 2/3-3/4 wysokości złożem. Powierzchnię złoża zabezpieczyć korkiem z waty

szklanej oraz warstwą kulek szklanych (ok. 1-2 cm grubości) dla ochrony przed

uszkodzeniem celulozy w czasie nanoszenia próbek oraz zmiany rozpuszczalni-

ków. Kolumnę przechowywać dbając o zachowanie warstwy rozpuszczalnika nad
powierzchnią złoża.

Rozdział mieszaniny lipidów:
Przed naniesieniem próbki metanol z kolumny należy wymyć przez jej przemycie

10 obj. (tu: l obj. kolumny jest równa objętości zajętej przez przygotowane złoże)

chloroformu. Próbkę lipidów w roztworze chloroformowym o stężeniu do 50
mg/ml nanieść na kolumnę pamiętając, by nie przeładować kolumny (maksymal-
na pojemność złoża - 5 mg lipidu na l ml objętości złoża). Po naniesieniu próbki

i przemyciu ścianek kolumny lipidy eluuje się z szybkością do 250 ml/godz,
(można pomagać sobie ciśnieniem azotu) podanymi w Tabeli l roztworami meta-
nolu w chloroformie.

% metanolu w chloroformie

0-2

3
4
5
9

12.5

14-15
19-20

23

30-35

50

100, a następnie 0 (po 10 obj.)

eluowany lipid

wolne kwasy tłuszczowe, cholesterol,

pigmenty, glicerydy

dwufosfatydyloglicerol
fosfatydylocholina
sfingomielina, monogalaktodwuglicerol
fosfatydyloetanolamina

kwas fosfatydowy
dwugalaktodwuglicerol
fosfatydyloglicerol
lizofosfatydylocholina
fosfatydyloseryna
fosfatydyloinozytol
regeneracja

1. Lipidy 24

Tabela 1. Schemat elucji klas lipidowych z CM-celulozy

Po elucji 5 obj. każdej mieszaniny skontrolować eluent na obecność danego

lipidu. Jeżeli będzie jeszcze obecny, to należy kontynuować elucję jeszcze 2 obj.
tego samego układu. Eluent zbierać we frakcjach o wielkości równej l obj. kolumny.
Zatrzymanie elucji na noc nie wpływa na jakość rozdziału. Frakcje analizować na
zawartość lipidów w chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym
w dowolnym układzie, np. chloroform/metanol/kwas octowy/woda (60:50:1:4). Fra-

kcje zawierające czyste lipidy połączyć i odparować w wyparce próżniowej. Lipidy
rozpuścić w określonej ilości chloroformu i przechowywać w -70°C.

Procedurę można przystosować do rozdziału 1g próbek mieszaniny lipidów.

1.2.2. Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej

chromatografii cieczowej (HPLC)

(wg Shefiq-ur-Rehman, J. Chromatogr. 567 (1991) 29-37)

Materiały i odczynniki:
ekstrakt lipidów z materiału biologicznego;
acetonitryl (HPLC-grade);
metanol (HPLC-grade);
kwas o-fosforowy 85%;
n-heksan;

izopropanol;
(standardy fosfolipidów - PC, PE, PS, SM).

Sprzęt:
chromatograf cieczowy wraz z detektorem UV;
kolumna 250 x 4.6 mm wypełniona żelem krzemionkowym;
podstawowe szkło laboratoryjne.

l 2. Izolacja i analiza lipidów 25

Postępowanie:

• Przygotować układ elucyjny - acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:10:1.8)

i odgazować go przy użyciu pompy próżniowej.

• Zrównoważyć kolumnę przez przepompowanie przez nią przez 30 min układu

przy przepływie 1.5 ml/min. Detektor ustawić na 203 nm.

• Znaną ilość ekstraktu przenieść do probówki i odparować rozpuszczalnik

w strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuścić w mieszaninie heksanu

z izopropanolem (3:1), tak by stężenie lipidów było równe ich stężeniu w ory-

ginalnym ekstrakcie.

• Za pomocą mikrostrzykawki wprowadzić 50 μl próbki do systemu nastrzyko-

wego a następnie na kolumnę, zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na papierze

rejestratora.

• Rozdział prowadzić do chwili wymycia wszystkich frakcji (około 15 min).

Orientacyjne czasy retencji wynoszą:

PS - 3 min; PE - 4 min; PC - 6 min; SM - 8 min.

Alternatywnie można użyć innych układów:

a) acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:40:0.8) - rozdział trwa około 30

min,

b) acetonitryl/metanol/kwas siarkowy (100:3:0.05) - rozdział przy przepły-

wie l ml/min trwa około 50 min.

Stosując metodę triangulacyjną obliczyć powierzchnie szczytów, a następnie

procentową zawartość poszczególnych lipidów w analizowanym ekstrakcie.

1.2.3. Analiza fosfolipidów

w chromatografii cienkowarstwowej

(wg Higgins J. A., w: Biological membranes - a practical approach (red. Findlay J. B. C.,

Evans W. H.), IRL Press, Oxford 1987, s. 103-137)

Materiały i odczynniki:

ekstrakt lipidów;

płytki do TLC powleczone żelem krzemionkowym;

chloroform;

metanol;

kwas octowy;

kryształki jodu (w pojemniku).

Sprzęt:

komora chromatograficzna;

mikrokapilary do nanoszenia próbek;

suszarka.

1. Lipidy 26

Postępowanie:

• W odległości 20 mm od jednego z brzegów płytki delikatnie zaznaczyć ołów-

kiem linię startową, na której będą nanoszone próbki.

• Badaną mieszaninę lipidów (150-300 μg) nanieść na linii startowej w postaci

kreski o długości l0 mm (uzyskuje się ją nanosząc małe plamki jedna obok

drugiej); podobnie nanieść standardy lipidów. Plamki wysuszyć strumieniem

powietrza.

• Komorę chromatograficzną wyłożyć po bokach arkuszami bibuły i umieścić

w niej około 150 ml układu rozwijającego - chloroform/metanol/kwas octo-
wy/woda (60:50:1:4). Przykryć komorę i pozostawić na 30 min w celu wysy-

cenia parami rozpuszczalników.

• Włożyć płytkę z naniesionymi próbkami i rozwijać do czasu dojścia frontu

rozpuszczalnika na odległość 10-15 mm od górnej jej krawędzi.

• Wyjąć i wysuszyć płytkę strumieniem powietrza pod digestorium(!).

• Wywołać chromatogram przez jego umieszczenie w pojemniku z jodem lub

przy użyciu wybranych z podanych w dalszej części układów detekcyjnych

(zob. s. 44 i następne).

• Jeśli do wywoływania chromatogramu używano jodu, plamy lipidów obryso-

wać miękkim ołówkiem bezpośrednio po wyjęciu płytki z pojemnika.

1.2.4. Oznaczanie fosforu w rozdzielonych

w TLC frakcjach fosfolipidowych

(wg Rouser G., Siakotos A. N., Fleischer S., Lipids l (1966) 85-86)

Roztwory:

70% kwas nadchlorowy;

2.5% roztwór molibdenianu amonowego;

10% roztwór kwasu askorbinowego (na świeżo!).

Sprzęt:

probówki pyreksowe;

kulki szklane;

pipety;

łaźnia do spalań;

wirówka stołowa;

spektrokolorymetr z kuwetami szklanymi;
mikrowytrząsarka.

Postępowanie:

• Odbarwić chromatogram przez umieszczenie płytki w strumieniu ciepłego

powietrza (pracować pod wyciągiem!).

• Z każdej z obrysowanych na chromatogramie plam fosfolipidowych wydra-

1.2. Izolacja i analiza lipidów 27

pać żel i przenieść do oddzielnych, opisanych probówek.
Wykonanie - warstewkę żelu otaczającą plamę zdrapać za pomocą żyletki
i odrzucić. Następnie żel plamy zdrapać dokładnie i ostrożnie na kawałek
papieru do ważenia i przenieść ilościowo do odpowiedniej probówki. Dla
uzyskania „ślepych" w odpowiednich probówkach umieścić podobne co
w plamie ilości żelu, lecz zdrapane z miejsc nie barwiących się jodem.

• Do każdej probówki dodać (zachować ostrożność! ) po 0.3 ml kwasu nad-

chlorowego, przykryć je kulkami szklanymi, umieścić w bloku grzejnym

i spalić materiał organiczny przez ogrzewanie w 180°C przez 45 min. Po tym
czasie wyjąć probówki i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

• Do każdej probówki dodać po l .4 ml wody destylowanej, wymieszać zawartość.
• Dodać po 0.2 ml roztworu molibdenianu, wymieszać.

• Dodać po 0.2 ml roztworu kwasu askorbinowego i ponownie całość wymie-

szać na mikrowytrząsarce.

• Przykryć probówki kulkami szklanymi i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na

5

min.

• Wyjąć probówki i ochłodzić w strumieniu zimnej wody.
• Oddzielić żel krzemionkowy przez sączenie bądź przez wirowanie (5 min przy

2000 obr. /min).

• Absorbancję supernatantów zmierzyć w mikrokuwetach szklanych przy 797

nm wobec odpowiednich prób ślepych.

Każda z klas fosfolipidów obecnych w ekstraktach zawiera tylko jedną grupę
fosforanową. Zależność pomiędzy ilością fosforanu i absorbancją jest liniowa do
ok. 1.0 A.

1.2.5. Analiza lipidów roślinnych

w chromatografii cienkowarstwowej

(wg Fisher W., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca

Raton, 1984, Vol. I s. 555-587)

Materiały i odczynniki:

ekstrakt lipidów roślinnych;
płytki do TLC powleczone żelem krzemionkowym, HPTLC firmy Merck;
chloroform;
metanol;
aceton;

kwas octowy;

kryształki jodu (w pojemniku).

Sprzęt:
komora chromatograficzna;
mikrokapilary do nanoszenia próbek;
suszarka.

1. Lipidy _28

Postępowanie:
• W odległości 15 mm od jednego z brzegów płytki delikatnie zaznaczyć ołów-

kiem linię startową, na której będą nanoszone próbki.

• Badaną mieszaninę lipidów (150-300 μg) nanieść na linii startowej w postaci

kreski o długości l0 mm (uzyskuje się ją nanosząc małe plamki jedna obok
drugiej); podobnie nanieść standardy lipidów. Plamki wysuszyć strumieniem

powietrza.

• Komorę chromatograficzną wyłożyć po bokach arkuszami bibuły i umieścić

w niej około 50 ml układu rozwijającego - chloroform/aceton/metanol/kwas

octowy/woda (50:20:10:10:5). Przykryć komorę i pozostawić na 30 min w ce-

lu wysycenia parami rozpuszczalników.

• Włożyć płytkę z naniesionymi próbkami i rozwijać do czasu dojścia frontu

rozpuszczalnika na odległość 2-5 mm od górnej jej krawędzi.

• Wyjąć i wysuszyć płytkę strumieniem powietrza pod digestorium(!).

• Wywołać chromatogram przez jego umieszczenie w pojemniku z jodem lub

przy użyciu wybranych z podanych w dalszej części układów detekcyjnych.

• Jeśli do wywoływania plam użyto jodu, plamki zaraz po wyjęciu płytki z poje-

mnika obrysować miękkim ołówkiem.

• Usunąć jod z płytki przez nadmuch ciepłym powietrzem (wyciąg!) i spryskać

odczynnikiem wywołującym na glikolipidy.

• Zidentyfikować poszczególne lipidy posługując się schematem (rys. 1).

FRONT

BARWNIKI

MGDG

PG

DGDG

SQOC

PC

Pl

START

Rys. 1. Schemat rozdziału lipidów roślinnych w chromatografii
cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym

MGDG - monogalaktodwugliceryd, PG - fosfatydyloglicero1.
DGDG - digalaktodwugliceryd, SQDG - sulfolipid,
PC -fosfatydylocholina, PI - fosfatydyloinozytol

1.2.6. Izolacja i oczyszczanie lecytyny jajecznej

(wg Van Deenen L. L. M., de Haas G. H„ Adv. Lipid Res. 2 (1964) 168-229)

Materiały i odczynniki:
20 jajek kurzych;

aceton techniczny l x destylowany;

1.2. Izolacja i analiza lipidów 29

metanol cz.d.a. l x destylowany;

chloroform techniczny 2 x destylowany;
amoniak stężony;

woda destylowana.

Sprzęt:

sączek ze spiekiem G4;
kolba ssawkowa;

mieszadło mechaniczne;

wyparka próżniowa;
kolumna szklana (30 x 500 mm) na szlifach i z zaworem teflonowym wypełniona

żelem krzemionkowym Si60, 40-60 μm, np. firmy Baker.

Postępowanie:

• Oddzielić dokładnie żółtka od białek.

• Wymyć z żółtek lipidy obojętne przez ekstrakcję za pomocą 500 ml acetonu

przy mieszaniu mechanicznym przez kilka minut; przesączyć przez sączek

G4.

• Uzyskany osad przemyć jeszcze co najmniej 6-krotnie porcjami 500 ml aceto-

nu do chwili uzyskania bezbarwnego przesączu.

Uwaga:

1. Ze względu na obecność lecytyn nienasyconych procedura powinna być

prowadzona w atmosferze azotu.

2. Kluczową sprawą jest uzyskanie po przemyciu naprawdę bezbarwnego

przesączu, inaczej można mieć problemy w dalszych etapach oczyszczania.

• Z zebranego z sączka białego osadu ekstrahować trzykrotnie fosfolipidy po-

rcjami 500 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (1: 1).

• Ekstrakty połączyć i jeszcze raz przesączyć.

• Odparować rozpuszczalniki w wyparce próżniowej (maks. 35°C).

• Uzyskaną masę fosfolipidów rozpuścić w małej objętości chloroformu.

• Roztwór fosfolipidów nanieść na zrównoważoną w chloroformie kolumnę

i eluować chloroformem do wymycia całości barwnego materiału. Lecytynę

wymyć za pomocą układu chloroform/metanol/ amoniak/woda (68:28:2:2).

Zbierać frakcje 50 ml.

• Obecność i czystość lecytyny we frakcjach sprawdzić przy użyciu TLC.

• Frakcje zawierające czystą lecytynę połączyć i odparować w wyparce. Lecy-

tynę rozpuścić w małej ilości chloroformu i oznaczyć jej zawartość poprzez
oznaczenie fosforu.

Uwaga:
Jeżeli uzyskana lecytyna nie jest dostatecznie czysta, należy powtórzyć chro-

matografię kolumnową lub zastosować HPLC.

• Kolumnę zregenerować metanolem i ponownie zrównoważyć w chlorofor-

mie. Orientacyjna wydajność - 1g PC o czystości > 95%/l żółtko.

1. Lipidy 30

1.2.7. Izolacja monogalakto-

i dwugalaktodwuglicerydów z całkowitych

lipidów roślinnych

(wg van't Hof R., van Klompenburg W., Pilon M., Kozubek A., de Korte-Kool G., Demel
R. A., Weisbeek P. J., de Kruijff B., J. Biol. Chem. 268 (1993) 4037-4042)

Materiały i odczynniki:

kolumna chromatograficzna wypełniona żelem krzemionkowym firmy Baker za-

wieszonym w mieszaninie chloroformu z acetonem (1:1);

chloroform;

metanol;

aceton.

Sprzęt:

naczynia do zbierania frakcji;

płytki HPTLC do chromatografii cienkowarstwowej;

komora do chromatografii cienkowarstwowej;

kolby do wyparki;

wyparka próżniowa;

pojemnik z jodem.

Postępowanie:

• Kolumnę przemyć 200 ml mieszaniny chloroform/aceton (1:1).

• Lipidy roślinne (około 50 mg) rozpuszczone w l ml chloroformu nanieść na

szczyt złoża i rozpocząć elucję tym samym układem z szybkością 3 ml/min.

Eluować używając rozpuszczalnika w ilości co najmniej 10 obj. kolumny.

• Eluat zbierać do jednego naczynia do chwili wypłynięcia drugiego bladozie-

lonego pasma, następnie zebrać kilka małych (20-30 ml) frakcji, tak by mieć

pewność, że pigmenty są całkowicie oddzielone od interesujących nas lipi-

dów, które (monogalaktodwuglicerydy) eluują się zaraz po pigmentach.

• Następnie elucję prowadzić kolejno: 10 obj. acetonu i 10 obj. mieszaniny

chloroform/metanol (9:1) zbierając frakcje 50-100 ml. Dwugalaktodwugli-

cerydy eluują się obu układami.

• Resztę lipidów eluować z kolumny 4 obj. mieszaniny chloroformu z metano-

lem (1:1).

• Odparować rozpuszczalniki z zebranych frakcji i po ich rozpuszczeniu w ma-

łej ilości chloroformu zanalizować w chromatografii cienkowarstwowej.

• Frakcje zawierające czyste MGDG i DGDG połączyć i umieścić w -70

0

C .

1.2. Izolacja i analiza lipidów 31

1.2.8. Izolacja lipidów fenolowych

(5-n-alk(en)ylorezorcynoli) z ziaren żyta

(wg Kozubek A., Acta Aliment. Polon. 9 (1985) 185-198)

Lipidy rezorcynolowe są grupą związków lipidowych będących długołańcucho-

wymi pochodnymi l,3-dwuhydroksy-5-alk(en)ylo-benzenu, są więc homologami

orcyny. Lipidy rezorcynolowe występują w materiałach roślinnych, w tym

w ziarniakach Gramineae oraz w przetrwalnikach (cystach) bakterii glebowych,
takich jak Azotobacter i Micrococcus. Biologiczna rola tych związków nie jest

jeszcze poznana, chociaż wiele wskazuje na możliwość ich uczestnictwa w regula-

cji biosyntezy innych lipidów oraz w mechanizmach obronnych. Charakterysty-

czną cechą lipidów rezorcynolowych ziaren zbóż jest fakt występowania w nich

szerokiego spektrum homologów. Wykazano homologi nasycone, jednonienasy-

cone, a także dwunienasycone. W każdej z tych grup występują z kolei homologi
posiadające nieparzystą liczbę atomów węgla w łańcuchach alifatycznych -

w ziarnach żyta od Cl3 do C27. Na przykładzie tych związków można prześle-

dzić strategię stosowaną do uzyskania określonego pojedynczego związku lipidowego.

Materiały i odczynniki:

ziarna żyta;

bibuła;

aceton;

heksan;

acetonitryl.

Sprzęt:

dużej objętości butla lub erlenmajerka;

kolba do wyparki;

rozdzielacz;

wyparka próżniowa;
wirówka, np. K-70.

Postępowanie:

• Umieścić ziarna żyta w naczyniu i zalać równą objętością acetonu.
• Zabezpieczyć przed parowaniem rozpuszczalnika i pozostawić na 24 godziny.
• Ekstrakt przesączyć przez sączek fałdowany z bibuły, a pozostałość ekstraho-

wać ponownie równą objętością acetonu.

• Połączyć ekstrakty i odparować z nich aceton w wyparce.

• Otrzymaną po odparowaniu acetonu pozostałość (tzw. olej acetonowy) rozpu-

ścić w heksanie w temperaturze około 50°C. Roztwór umieścić w zamrażarce

na kilka godzin.

• Wytrącony osad oddzielić od supernatantu przez wirowanie na zimno

w szklanych probówkach (około 3000 obr/min przez 20 min).

1. Lipidy 32

Supernatant zachować, a osad ponownie rozpuścić w heksanie, wymrozić

i odwirować.
Uzyskany po tym wirowaniu osad zawiera w większości homologi nasycone,
należy go zebrać i po wysuszeniu zachować.
Supernatanty heksanowe połączyć i odparować z nich heksan - uzyskany tzw.
olej heksanowy zawiera głównie homologi nienasycone.
Dla ich oczyszczenia olej heksanowy rozpuścić w 180 ml heksanu, umieścić
w rozdzielaczu, dodać 150 ml acetonitrylu (trucizna!) i wytrząsać całość

przez 10 min; odstawić do rozdzielenia faz.
Zebrać fazę dolną, a górną wytrząsać ponownie ze 150 ml acetonitrylu; po
rozdzieleniu faz zebrać fazę dolną i połączyć ją z poprzednio uzyskaną.
Z połączonych faz odparować acetonitryl w wyparce próżniowej - uzyska się
kilka mililitrów gęstej cieczy zawierającej mieszaninę nasyconych i nienasy-
conych homologów 5-n-alkilorezorcynolu; przechować ją w -20°C.

1.2.9. Chromatografia cienkowarstwowa

lipidów rezorcynolowych

(wg Mejbaum-Katzenellenbogen W., Tłuścik F., Kozubek A., Acta Soc. Bot. Polon. 47

(1978) 379-389)

Materiały, odczynniki i roztwory:
płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone żelem krzemionkowym
Si 60;
chloroform;
aceton;
0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl.

Sprzęt:
komory do chromatografii cienkowarstwowej;

kuweta do wywoływania chromatogramów;

suszarka;

kapilary do nanoszenia próbek.

Postępowanie:

• Na płytki o wymiarach 10 x 10 cm pokryte żelem krzemionkowym Si 60

nanieść w odległości 15 mm od dolnej krawędzi 10-50 μl ekstraktów zawiera-

jących lipidy rezorcynolowe.

• Po wysuszeniu plamek strumieniem powietrza rozwijać w układzie chloro-

form/aceton 95:5 do chwili osiągnięcia przez front rozpuszczalnika górnej
krawędzi płytki.

• Wysuszyć płytkę i plamy rozdzielonych frakcji wywołać przez spryskanie lub

zanurzenie jej w roztworze Fast Red B lub Fast Blue B.

1.2. Izolacja i analiza lipidów 33

Lipidy rezorcynolowe wykazują swoistą fioletowoczerwoną barwę oraz war-

tości R

f

ok. 0.2.

1.2.10. Oznaczanie składu

nasyconych i nienasyconych homologów

lipidów rezorcynolowych

w cienkowarstwowej chromatografu argentacyjnej

(wg Kaczmarek J., Tłuścik F., Genet. Polon. 25 (1984) 349-358)

Materiały, odczynniki i roztwory:
płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone żelem krzemionkowym

Si 60;

chloroform;

aceton;

0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl;

20% azotan srebrowy w 75% metanolu.

Sprzęt:

komory do chromatografii cienkowarstwowej;
kuweta do wywoływania chromatogramów;
suszarka;

kapilary do nanoszenia próbek.

Postępowanie:

• Płytki impregnować przez zanurzenie na 20-30 min w roztworze azotanu

srebrowego.

• Odsączyć z nadmiaru roztworu i wysuszyć w 105°C przez 15 min.
• Analizowane próbki (10-50 μl) nanieść w odległości 15 mm od dolnej krawę-

dzi płytki i po odparowaniu rozpuszczalnika suszarką chromatogram rozwijać
w układzie chloroform/aceton (95:5) do chwili osiągnięcia przez front układu
górnej krawędzi płytki.

• Po wysuszeniu chromatogramy przemyć 3 x po 15 min w 300 ml wody desty-

lowanej.

• Przemyte płytki zanurzyć na 20 min w roztworze Fast Red B.
• Nadmiar barwnika odmyć przez płukanie płytki 3 x w 200 ml 0.05 M HCl.
• Żel z wybarwionych pasm wydrapać z wilgotnych płytek i umieścić w pro-

bówkach.

• Barwnik ekstrahować 6 ml acetonu (30 min ekstrakcji) i po oddzieleniu

ekstraktów od żelu (sączenie lub wirowanie) określić ich absorbancję przy
470 nm. Próbę odnośnikową przygotować przez ekstrakcję żelu zdrapanego
z miejsc nie wybarwionych.

1. Lipidy 34

Poczynając od frontu rozpuszczalnika kolejność migracji homologów jest

następująca: nasycone, jednonienasycone i dwunienasycone.

Obliczenia: Procentową zawartość nasyconych i nienasyconych homologów

obliczyć w oparciu o sumę absorbancji oznaczanych frakcji.

1.2.11. Oznaczanie składu homologów

lipidów rezorcynolowych pod względem długości

łańcucha alifatycznego w chromatografii

cienkowarstwowej na tlenku glinu

(wg Tłuścik F., Kozubek A., Chem. Anal. 29 (1984) 79-84)

Materiały, odczynniki i roztwory:
płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone tlenkiem glinu (Merck

5581);
metanol;

0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl.

Sprzęt:
komory do chromatografii cienkowarstwowej;
kuweta do wywoływania chromatogramów;
suszarka;

kapilary do nanoszenia próbek.

Postępowanie:

• Próbki nanosić na płytki (5 x 20 cm) w postaci kresek długości l cm w odle-

głości 15-20 mm od dolnej ich krawędzi.

• Po odparowaniu rozpuszczalnika rozwijać na drodze 12-15 cm w układzie

metanol-12% wody. Płytki zanurzać w układzie nie więcej niż na 5 mm.

• Po rozwinięciu płytki wysuszyć i zanurzyć na 30 min w roztworze Fast Red

B.

• Osuszyć wybarwione chromatogramy między bibułą, wydrapać żel z wybar-

wionych pasm i przenieść go do czystych i suchych probówek.

• Barwnik z żelu ekstrahować 6 ml acetonu przez 30 min wstrząsając probówki

od czasu do czasu.

• Żel oddzielić przez sączenie lub wirowanie.
• Określić absorbancje ekstraktów przy 470 nm. Jako próby odnośnikowej użyć

ekstraktu z żelu wydrapanego z miejsc nie wybarwionych.

Dla pewnej identyfikacji homologów wraz z próbą badaną rozdzielać standard
pentadecylorezorcynolu (Cl5-AR). Ruchliwość homologów zmniejsza się wraz
ze wzrostem długości ich łańcucha alifatycznego.

Obliczenia: Procentową zawartość poszczególnych homologów obliczyć na pod-
stawie sumy absorbancji oznaczanych frakcji.

1.2. Izolacja i analiza lipidów 35

1.2.12. Oczyszczanie lipidów rezorcynolowych oraz

izolacja poszczególnych ich homologów

(wg Kozubek A., Acta Aliment. Polon. 9 (1985) 185-198)

Materiały i odczynniki:

żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej;
kolumna do chromatografii argentacyjnej w HPLC;
kolumna do chromatografii na odwróconych fazach (RP-18) w HPLC;
paski folii pokryte żelem krzemionkowym do chromatografii cienkowarstwowej;
nadchloran srebrowy;
Fast Blue B;
chloroform;
metanol;

aceton.

Sprzęt:

kolumna szklana do chromatografii;

chromatograf cieczowy preparatywny z kolumnami;
kolby do wyparki;
wyparka próżniowa.

Postępowanie:

• Kolumnę szklaną wypełnić zawieszonym w mieszaninie chloroformu z aceto-

nem (95:5) żelem krzemionkowym.

• Na szczyt złoża nanieść preparat lipidów rezorcynolowych rozpuszczony

w 2-4 ml chloroformu; eluować kolumnę tym samym układem.

• Początkowo zbierać frakcje do jednego dużego naczynia kontrolując wyciek

z kolumny testem kroplowym na obecność lipidów rezorcynolowych - na
pasek folii pokryty żelem krzemionkowym nanosić po kropli eluatu, wysuszyć
i pokryć kroplą 0.05% wodnego roztworu Fast Blue B; fioletowoniebieskie
zabarwienie wskazuje na ich obecność. Od tej chwili zbierać eluat do oddziel-

nego naczynia. Zakończyć zbieranie, gdy test kroplowy nie wykaże już obe-
cności lipidów rezorcynolowych.

• Frakcję zawierającą lipidy rezorcynolowe odparować na wyparce.
• Zbadać czystość preparatu w chromatografii cienkowarstwowej (zob. poniżej).
• W celu rozdzielenia i uzyskania homologów różniących się stopniem nasyce-

nia łańcuchów bocznych uzyskany preparat należy rozdzielić w chromatogra-
fii argentacyjnej. W tym celu 200 μl roztworu uzyskanych w poprzednich
etapach preparatu

należy wstrzyknąć na kolumnę HPLC impregnowaną nad-

chloranem srebrowym i rozdzielić w układzie chloroform/metanol (95:5) za-
wierającym 20 mmoli/l AgClO

4

. Proces rozdziału śledzić za pomocą detektora

UV przy 280 nm.

• Frakcje wypływające z kolumny zbierać do oddzielnych naczyń.