ANALIZA DNA

DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) - jest to spolimeryzowana cząsteczka złożona z czterech różnych jednostek zwanych
deoksyrybonukleotydami (skróty: A, T, G i C) i niosąca informację genetyczną (geny) zakodowaną w ich kolejności.

Rys. - "Alec Jeffreys"

Najpewniejszą metodą identyfikacji człowieka jest obecnie przebadanie próbek DNA, który
tworzy genetyczny materiał wszystkich naszych komórek. Palmę pierwszeństwa w odkryciu
faktu, iż każdy człowiek ma unikalny kod DNA przyznaje się brytyjskiemu uczonemu o
nazwisku Alec Jeffreys. Był to rok 1985. Już rok później test DNA pozwolił skazać pierwszych
przestępców (była to sprawa o morderstwo). Niewątpliwą zaletą tej metody jest to, że użyty do
badań materiał biologiczny może być bardzo zniszczony i bardzo stary oraz wystarczają jego
śladowe ilości, nawet pojedyncze komórki.

Jak wygląda cząsteczka DNA przypominamy sobie z lekcji chemii lub biologii – jest to skręcona helisa
zbudowana m.in. z zasad purytowych (adeiny, tyminy, guaniny i cytozyny). Wzór jaki tworzą jest unikalny
dla każdego człowieka. Wystarczy zatem porównać próbkę uzyskaną z miejsca przestępstwa z pobraną od
oskarżonego. DNA jest spiralną, dwuniciową cząsteczką, w której nici są względem siebie
komplementarne. Czyli skierowane do wnętrza spirali zasady sąsiednich nici łączą się według bardzo
prostej reguły:
- adenina nukleotydu jednej nici tworzy parę z tyminą nukleotydu drugiej nici (A=T)
- guanina nukleotydu drugiej nici tworzy parę z cytozyną nukleotydu drugiej nici (C=G).

Autorami modelu podwójnej helisy DNA są James Watson i Francis Crick.

RFLP (Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych)

Analizę RFLP można podzielić na następujące etapy:

Pobranie i izolacja DNA

DNA może być uzyskane niemal z każdej ludzkiej tkanki.
Źródła DNA z miejsca przestępstwa mogą obejmować krew, nasienie, tkanki, włosy, a także ślinę.
Uzyskane z materiałów dowodowych DNA jest porównywane z próbkami odniesienia.

Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Niektóre krótkie sekwencje DNA występują w specyficznych miejscach na chromosomie i powtarzają się w ludzkim genomie. Ilość takich
powtórzeń waha się pomiędzy osobnikami.
Enzymy restrykcyjne przecinają DNA w obszarach gdzie występują specyficzne sekwencje zasad. Dzięki temu możliwe jest wycięcie
fragmentów chromosomu o powtarzających się sekwencjach (variable number of tandem repeats, VNTR's).
Odkrycie specyficznych enzymów bakteryjnych, zwanych enzymami restrykcyjnymi, stanowiło ogromny przełom w rozwoju technologii
sztucznej rekombinacji DNA. Bakterie używają tych enzymów do obrony przed infekcją przez bakteriofagi. Otrzymanie z bakterii
oczyszczonych enzymów restrykcyjnych umożliwiło uczonym przecinanie chromosomowego DNA na mniejsze fragmenty w sposób
kontrolowany.
Najpowszechniej używany enzym w sprawach kryminalnych to HaeIII, który rozcina DNA na sekwencje 5’-GGCC-3’.

Rozdzielenie elektroforetyczne

Następnie fragmenty DNA są sortowane według wielkości przez elektroforezę w żelu.

Żel poliakrylamidowy lub agarozowy po wylaniu i zastygnięciu w formie tworzy cienki blok ze studzienkami, w których umieszcza się
badane próbki DNA różnej wielkości. Naładowane ujemnie cząsteczki w polu elektrycznym wędrują do bieguna dodatniego. Szybkość, z
jaką cząsteczka przesuwa się w żelu, jest odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej.

Przygotowanie hybrydyzacji Southerna

Żel zawierający rozdzielone fragmenty DNA zostaje wybarwiony bromkiem etydyny, który po związaniu się z DNA fluoryzuje w świetle UV.
Po wybarwieniu na żelu widoczne są prążki, z których każdy zawiera fragmenty DNA o określonej długości. Rozdzielone fragmenty zostają
następnie związane z przyłożonym do żelu filtrem z nitrocelulozy lub błony nylonowej, w który wsiąkają jak atrament w bibułę. Tego
rodzaju procedura, obejmująca etap kapilarnego przenoszenia (wsiąkania) DNA z żelu na filtr zwana jest hybrydyzacją Southerna (od
nazwiska jej odkrywcy E.M. Southerna).
Zachowuje ona przestrzenny układ fragmentów DNA po elektroforezie.

Hybrydyzacja DNA z radioaktywną sondą.

Fragmenty DNA, po wyznakowaniu radioaktywnymi atomami jako sondy do wykrywania pokrewnych sekwencji w DNA innych komórek.
Inkubacja filtru, na którym jest DNA z radioaktywną sondą, umożliwia związanie się sondy z fragmentami zawierającymi sekwencje do niej
komplementarne i uwidocznienie ich położenia.

Wykrywanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych.

Na tak przygotowany filtr nakłada się film rentgenowski. Film utrwala lokalizację radioaktywnego rozpadu. Dostaje się w ten sposób
„genetyczne odciski palców” – obraz fragmentu DNA przypominający swoim wyglądem kod paskowy.
W typowej analizie DNA dla celów sądowych zostaje scharakteryzowany polimorfizm DNA dla paru różnych chromosomów. Po uzyskaniu
zdjęcia rentgenowskiego dla pojedynczej sondy, radioaktywność na filtrze Southerna może być usunięta za pomocą roztworu o wysokiej
temperaturze. Filtr może być hybrydyzowany wiele razy z innymi sondami radioaktywnymi. Komplet tak uzyskanych zdjęć jest profilem
DNA.

PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy)

Łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (z angielskiego Polymerase Chain Reaction), technika umożliwiająca amplifikacje (namnażanie)
fragmentów DNA in vitro przy użyciu polimerazy DNA. Została opracowana przez Kary B. Mullis i M. Smitha, którzy za to otrzymali w 1993
Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Łańcuchowa reakcja polimerazy zrewolucjonizowała współczesną biologię molekularną, umożliwiając
wyprodukowanie milionów kopii fragmentu DNA w zaledwie kilka godzin.

Za pomocą polimerazy DNA, czyli enzymu katalizującego reakcję
łączenia nukleotydów w łańcuch polinukleotydowy, konkretną
sekwencję DNA można zreplikować w specjalnej probówce.
Uzyskuje się wtedy dwie cząsteczki DNA. Dwie nici każdej z nich
rozdziela się podgrzewając roztwór, a następnie znów
przeprowadza się replikację. Tym razem powstają cztery
cząsteczki DNA.

Każdy cykl powoduje podwojenie liczby cząsteczek DNA. Ten przebiegający wykładniczo proces powoduje, że po 20 cyklach mamy do
dyspozycji 2

20

, czyli ponad milion cząsteczek o sekwencji identycznej z sekwencją cząsteczki wyjściowej.

W reakcji PCR stosuje się specjalną, odporną na wysoką temperaturą polimerazę DNA (pochodzi ona z bakterii, których naturalnym
środowiskiem są gorące źródła), która pozostaje aktywna w ciągu wielu cykli podgrzewania i ochładzania.
Metoda PCR umożliwia namnażanie i analizę mikroskopijnych próbek DNA pochodzących z najrozmaitszych źródeł, od kopalnych szczątków
liści i znalezisk archeologicznych, po przedmioty znalezione na miejscu przestępstwa.

Słowniczek

Rekombinacja DNA -
naturalny proces powstawania nowych zestawień odcinków chromosomów (a więc i odcinków DNA).

Replikacja DNA -

proces powielania DNA lub RNA

Genom - całość informacji genetycznej komórki; obejmuje geny i inne sekwencje DNA.

Gen – podstawowa jednostka dziedziczności. Gen jest odcinkiem DNA zawierającym w sobie informacje o kolejności reszt
aminokwasowych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym albo nukleotydów w rRNA lub tRNA.

Nukleotyd - podstawowy składnik budulcowy kwasów nukleinowych (DNA i RNA), jest on zbudowany z cukru, fosforanu i zasad
purynowych lub zasad pirymidynowych.

RNA (kwas rybonukleinowy) -
spolimeryzowana cząsteczka zbudowana z czterech różnych jednostek zwanych rybonukleotydami (A, U, G, i C) zawierających cukier
rybozę.

Podstawowe metody badania DNA:

RFLP - restriction fragment lenght polymorphism - w ogromnym skrócie metoda opiera się na założeniu, iż molekuły (czyli fragmenty
drabinki DNA) różnych ludzi mają rożne rozmiary. Dlatego też metoda polega na umieszczeniu DNA na ujemnym biegunie płytki
pokrytej żelem i przepuszczenie przez nią prądu. Molekuły migrują do dodatniego bieguna. Następnie poddaje je się działaniu tzw. sond
- czyli krótkich fragmentów łańcucha DNA oznaczonego radioizotopem. Na filtr nakłada się film rentgenowski i uzyskuje w wyniku
znane większości paski przypominające kod kreskowy. Potem wystarczy porównać ich długość.

VNTR - variable number tandem repeats - polega na znajdowaniu liczby identycznych sekwencji typu T-T-A-A-T-T itp.

Technika PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy- metoda pozwalająca na kopiowanie pojedynczych łańcuchów DNA.