Transformacja, koniugacja trójrodzicielska,

elektroporacja



1.

Koniugacja

2.

Transformacja-

pobieranie wolnego DNA ze środowiska

a)

Naturalna- kom. Naturalnie kompetentne

b)

Sztuczna (indukowana)

3.

Transdukcja-

przenoszenie DNA z udziałem bakteriofagów

a)

Ogólna-

przenoszenie dowolnej cechy

b)

Specyficzna-

przenoszenie określonych cech

4.

Transfekcja-

Transformacja komórek eukariotycznych

5.

Stabilna- połączona z integracją DNA do genomu

6.

Przejściowa- jeśli cząsteczka DNA nie ulegnie integracji, ekspresja

wprowadzonego genu zostanie zgubiona w miarę podziałów

komórkowych.

Mechanizmy horyzontalnego

transferu genów (HTG):





Przekazywanie fragmentów DNA z dawcy do biorcy



Nie wymaga kontaktu fizycznego



komórki biorcy pobierają aktywnie fragmenty chromosomu

dawcy, które ulegają następnie rekombinacji z homologicznymi

odcinkami DNA w chromosomie biorcy.



Transformacje można przeprowadzić w obu kierunkach – ten sam

szczep może być użyty jako dawca i jako biorca



Zjawisko odkryte przez Griffitha w 1928r, wyjaśnione przez

Avery’ego w 1944



Bakterie osiągające stan kompetencji spontanicznie: Bacillus,

Streptococcus, Azotobacter, Helicobacter



Bakterie będące w stanie konstytutywnej kompetencji np.

Neisseria gonorrhoeae

TRANSFORMACJA





Jest to stan w którym bakterie mogą być transformowanen



Wydajność transformacji - % otrzymywanych trwałych

transformantów, zależy przede wszystkim od stanu

komórek biorców, a więc ich zdolności do aktywnego

pobierania DNA z pożywki – określamy to mianem

kompetencji



W procesie pobierania DNA bierze udział szereg białek

enzymatycznych występujących w błonie i ścianie

komórkowej



Zdolność kompetencji jest cechą dziedziczną określonego

szczepu



Tylko bakterie wytwarzające białkowy czynnik kompetencji

są zdolne do transformacji

Stan kompetencji



1.

Luźna adsorpcja cząsteczek DNA do miejsc receptorowych

na powierzchni komórki

2.

Transport DNA przez ściany i błony komórkowe do wnętrza

komórki. U niektórych gatunków proces ten jest związany z

degradacją jednego łańcucha podwójnego heliksu

3.

Transport DNA do nukleoidu, dopasowanie do

homologicznego fragmentu

4.

W procesie rekombinacji między DNA biorcy i pobranym

fragmentem DNA dawcy powstaje heterodupleks.

Heterodupleks jest replikowany z chromosomu bakteryjnego

i po podziale połowa komórek potomnych będzie zawierała

allele znajdujące się we włączonym fragmencie DNA

Proces transformacji-

etapy





Występuje gdy dochodzi do transformacji dwóch

sprzężonych, blisko siebie leżących genów



Powstają podwójne transformanty

Kotransformacja





Pseudomonas stutzeri- przekazuję marker oporności
na ryfampicynę



Pseudomonas sp. – plazmidy



Acinetobacter calcoaceticus- zdolność do syntezy
histydyny

Przykłady transformacji w

środowisku naturalnym



1.

indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne

zabiegi, np.u Escherichia coli można wymusić stan kompetencji

poprzez traktowanie komórek CaCl

2

(jony Ca2+ zwiększają

przepuszczalność ściany komórkowej) w niskiej temperaturze.

2.

elektroporacja – polega na zadziałaniu prądem o wysokim

napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów w błonie

komórkowej co ułatwia wnikanie DNA. Można używać do

transformacji komórek gramdodatnich i gramujemnych.

3.

protoplastyzacja komórek – stosuje się głównie w bakteriach

gramdodatnich np. Bacillus, Streptomyces. Protoplasty (komórki

pozbawione ściany komórkowej) uzyskuje się poprzez

potraktowanie np. polietylenoglikolem.

4.

balistyka (metoda tzw. „armatki genowej”) – stosuje się głownie do

transformacji roślin. Polega na wstrzeliwaniu drobnych kuleczek

wolframowych lub złotych opłaszczonych DNA.

Transformacja indukowana





Mierzy się ją w przeliczeniu na ilość transformantów

np. ilość wyrośniętych kolonii w przeliczeniu na

mikrogram DNA



Zależy od:



Stopnia pokrewieństwa



Liczby kompetentnych komórek



Stężenia DNA



Odpowiedniej temperatury

Wydajność transformacji



a)

Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji (jego ilość

zmienia się w czasie wzrostu bakterii), wchodzi on w reakcję z

receptorem błonowym, który po aktywacji wysyła sygnał do

chromosowego DNA i umożliwia ekspresję genów

kompetencji, których produktami są różne białka np.

autolizyny, które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek

wiążących DNA na powierzchni komórki.

b)

Dwuniciowe fragmenty DNA są adsorbowane na powierzchni

komórki za pomocą białek wiążących. Nukleazy degradują

jedną nić DNA, druga łączy się z białkami stanu kompetencji i

zostaje wprowadzona do wnętrza komórki. Obce genomowe

DNA odszukuje homologiczny odcinek w genomie

gospodarza i w procesie rekombinacji (podwójny c-o)

dochodzi do wymiany pojedynczych nici DNA.

Mechanizm transformacji





Quorum sensing (QS), sygnalizator zagęszczenia

jest systemem komunikacji między komórkami

bakterii uczestniczącym w regulacji ekspresji genów

w odpowiedzi na gęstość populacji drobnoustrojów



ma szczególne znaczenie w opanowywaniu przez

bakterie nowych terytoriów i precyzuje do jakich

warunków mogą zaadoptować się poszczególne

drobnoustroje



stwierdzono u bakterii Gram-dodatnich i Gram-

ujemnych

Quorum sensing





W systemie międzykomórkowej komunikacji pośredniczą małe

cząsteczki sygnalizacyjne (autoinduktory). Po przekroczeniu

progowego stężenia tych związków (co świadczy o osiągnięciu

przez populację mikroorganizmów odpowiedniej liczebności, czyli

kworum) dochodzi do skoordynowanej zmiany ekspresji genów,

niezbędnej do efektywnego współdziałania całej populacji



Procesy, w których wykorzystywane jest przez bakterie zjawisko

quorum sensing:



bioluminescencja



wzrost



biosynteza antybiotyków



transfer plazmidów



wytwarzanie biofilmu



wirulencja

Quorum sensing





Proces polegający na traktowaniu komórek

czynnikiem fizycznym jakim jest prąd o

dużym napięciu, rzędu kilowoltów, przez

kilka milisekund.



W błonie komórek powstają wpuklenia, które

przekształcają się w małe hydrofobowe pory,

które

następnie

przechodzą

w

duże

hydrofilowe pory zdolne do przepuszczania

cząsteczek DNA. Zamykają się one gdy

skończy się działanie impulsu



Jest to skuteczny sposób na wprowadzenie

DNA do różnych typów komórek

Elektroporacja

(elektrotransformacja)







Metoda pozwala transformować komórki bakteryjne,

które trudno wprowadzić w stan kompetencji,

stosowana również w przypadku komórek

drożdżowych, roślinnych i zwierzęcych



pozwala wprowadzić duże cząsteczki DNA, rzędu

setek kpz i charakteryzuje się bardzo dużą

wydajnością.



Wadą jest to że komórki traktujemy wysokim

napięciem i w ten sposób możemy bardzo łatwo je

uśmiercić

Elektroporacja





Jest to wymiana DNA między bakteriami za

pośrednictwem wirusów bakteryjnych



Wyróżniamy dwa rodzaje transdukcji:

1.

Niespecyficzną (ogólną)- fagi P1, P22

2.

Specyficzną np. fag λ

Bakteriofag, fag - wirus atakujący bakterie. Przeważnie

dany bakteriofag zdolny jest do infekcji tylko jednego

gatunku (a czasem tylko szczepu) bakterii.

Transdukcja



Transdukcja



Przebieg transdukcji

bakteriofagiem

1.

bakteriofag zakaża komórkę

2.

kwasy nukleinowe, zarówno bakteryjne, jak i bakteriofagowe

zostają pocięte na mniejsze części pod wpływem enzymów

wirusowych

3.

kompletne wiriony opuszczają komórkę bakteryjną; niektóre

kapsydy zostały błędnie "załadowane" bakteryjnym DNA

(kolor zielony)

4.

bakteriofag niosący bakteryjny DNA zakaża kolejną bakterię

5.

DNA z komórki bakterii-dawcy zostało wstrzyknięte do

komórki bakterii-biorcy (krzywa koloru zielonego zakończona

kuleczkami)

6.

DNA z komórki donora zastąpiło fragment DNA akceptora





Przeprowadzana przez fagi przenoszące odcinki

DNA o ściśle określonej długości, mające na obu

końcach sekwencje cos rozpoznawane przez fagowe
terminazy



Przenoszony fragment DNA jest połączony

wiązaniami kowalencyjnymi z DNA bakteriofaga



Replikacja w cyklu lizogennym oraz litycznym

Transdukcja specyficzna





Przenoszenie odcinków DNA o wielkości

niezdeterminowanej (ważne aby odcinek mieścił się

w główce fagowej)



Długość fragmentu DNA komórkowego, jaki zostaje

zapakowany do główki fagowej, odpowiada długośi

pakowanego DNA fagowego, co w przypadku faga

P22 wynosi ok. 40 kpz, zaś faga P1- 100 kpz.



Proces rozpoczyna się w miejscu sekwencji pac

rozpoznawanej przez endonukleaze

Transdukcja ogólna





Cykl lizogenny- odmiana replikacji wirusów,

polegająca na wnikaniu materiału genetycznego

wirusa do komórki gospodarza i jego replikacji wraz

z DNA gospodarza, która nie prowadzi do lizy

komórki.



Cykl lityczny – cykl życiowy bakteriofaga polegający

na zakażeniu bakterii, produkcji nowych cząstek

fagowych, rozpadzie bakterii i uwolnieniu nowych

bakteriofagów.

Cykl lizogenny a lityczny







Transformacja komórek eukariotycznych DNA plazmidowym lub

bakteriofagowym



Wyróżniamy różne metody transfekcji:

1.

chemiczna

a)

transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia

b)

lipofekcja − transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA

2.

elektroporacja − transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku

elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok

elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej

mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.

3.

pocisk genowy − transfekcja balistyczna − wstrzeliwanie do wnętrza

komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA

4.

mikroiniekcja – roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra

komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą

specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.

Transfekcja kom. euk.