Grzyby keratynolityczne

background image

Prace pogl¹dowe

/

Review articles

Mikol. Lek. 2004, 11 (4): 317-322

ISSN 1232-986X

Dermatofity. Grzyby keratynofilne i ich rola w œrodowisku

– po¿ytki i zagro¿enia

Dermatophytes. Keratophylic fungi and their role in environment – the advantage and menace

Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej SGGW, Katedra Nauk Przedklinicznych, Zak³ad Wirusologii, Mykologii i Immunologii, Pracownia Mykologii w Warszawie

Skóra ssaków mo¿e byæ kolonizowana przez dermatofity. Zdolnoœæ grzybów do adherencji do warstwy zrogowacia³ej naskórka, a tak¿e mo¿liwoœæ

wykorzystywania zawartej w niej keratyny œwiadcz¹ o w³aœciwoœciach inwazyjnych grzybów. Grzyby nale¿¹ce do dermatofitów cechuje aktywnoœæ

proteolityczna, keratynolityczna i lipolityczna. W celu oceny w³aœciwoœci keratynolitycznych dermatofitów stosuje siê ró¿ne modele doœwiadczalne.

Mechanizm rozk³adu keratyny nie jest do koñca zbadany. Keratynoliza, podobnie jak inne biochemiczne aktywnoœci grzybów, nie jest cech¹ gatunkowo

swoist¹. Coraz wiêcej danych przemawia jednak za tym, ¿e zarówno geofilne dermatofity, jak i inne glebowe grzyby keratynolityczne mog¹ byæ uznawane

za patogeny.

S³owa kluczowe: dermatofity, keratyna, keratynazy, dermatomikozy

The dermatophytes may colonize the skin of mammals. The ability of fungi to adhere to keratinised layer of skin and also the possibility of utilization

of keratin are the major invasive properties of these fungi. Fungi that belong to dermatophytes have proteolytic, keratinolytic and lipolytic activity.

To examine their keratinolytic properties different experimental models of infections are employed. The mechanism of degradations of keratin is not

well known still. Keratinolysis, similarly to the other biochemical activity of fungi is not a genus specify properties. Many data have shown lately that

geophylic dermatophytes as well as other keratinophylic fungi may be named skin pathogens.

Key words: dermatophytes, keratine, keratinase, dermatomycoses

Wprowadzenie

Grzyby stanowi¹ jedn¹ z najliczniejszych grup organiz-

mów. Ich niezwyk³a ró¿norodnoœæ morfologiczna jest m.in.

zwi¹zana z funkcjonalnym zró¿nicowaniem i strategi¹, umo¿-

liwiaj¹cymi prze¿ycie w ró¿nych ekosystemach. Polimor-

fizm grzybów jest równie¿ wynikiem ich ró¿norodnego za-

potrzebowania na substancje wzrostowe, bêd¹cego kom-

binacj¹ saprotrofizmu, nekrotrofizmu i biotrofizmu w okre-

œlonych niszach ekologicznych. Obserwuje siê du¿¹ ela-

stycznoϾ w zakresie przystosowania do zmiennych zaso-

bów ich œrodowiska.

Zdolnoœæ grzybów do szybkiej adaptacji do niekorzy-

stnych zmian jest wynikiem ich mo¿liwoœci przekazywania

informacji genetycznej dziêki mechanizmom polegaj¹cym

na fuzji strzêpek, w wyniku czego koegzystuj¹ ze sob¹

dwa ró¿ne typy j¹der komórkowych – heterokarion. Zró¿-

nicowanie ekspresji genów bardziej ni¿ selekcja materia³u

genetycznego j¹drowego wydaj¹ siê odpowiadaæ za me-

chanizmy przystosowawcze grzybów, nazywane inaczej

mechanizmem wyboru. Kierunek ewolucji zapotrzebowa-

nia wzrostowego grzybów wydaje siê wiêc okreœlany

przez œrodowisko i mo¿e prowadziæ nawet do œcis³ej spe-

cjalizacji grzybów w wykorzystywaniu sk³adników od¿yw-

317

Streszczenie

Abstract

background image

318

Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2004, 11 (4)

czych. Grzyby s¹ organizmami, które mog¹ wykorzysty-

waæ tak trudno dostêpne bia³ko, jak keratyna, jako Ÿród³o

substancji pokarmowych (1).

Skóra ssaków mo¿e byæ kolonizowana przez dermatofity

oraz inne grzyby niezaliczane do tej grupy. ZdolnoϾ grzy-

bów do adherencji do warstwy zrogowacia³ej naskórka,

a tak¿e mo¿liwoœæ wykorzystywania zawartej w niej keratyny

œwiadcz¹ o w³aœciwoœciach inwazyjnych grzybów. Najbar-

dziej zewnêtrzna warstwa naskórka – stratum corneum –

„poœredniczy” w kontaktach miêdzy skór¹ a œrodowiskiem

zewnêtrznym. W momencie narodzin skóra jest sterylna, ale

niebawem zostaje zasiedlona przez liczne mikroorganizmy

stanowi¹ce póŸniej jej normaln¹ komensaliczn¹ florê. Der-

matofity nie mog¹ byæ uznawane za jej sk³adnik.

Grzyby nale¿¹ce do dermatofitów cechuje aktywnoœæ

proteolityczna, keratynolityczna i lipolityczna. Proteinaza

serynowa (urokinaza i aktywator plasminogenu typu tkanko-

wego), bior¹ce udzia³ w zewn¹trzkomórkowym kataboliz-

mie bia³ek, produkowane s¹ przez dermatofity, a ich wy-

twarzanie przez te grzyby wydaje siê odgrywaæ g³ówn¹ rolê

w momencie atakowania skóry. Sulfitoliza, nieenzymatycz-

ny proces denaturacji keratyny jest uzupe³nienieniem dzia-

³ania enzymatycznej keratynolizy przez dermatofity. Ke-

ratynazy wytwarzane przez dermatofity wykrywane s¹ za

pomoc¹ ró¿nych technik (FAT, przeciwcia³a monoklonalne)

w bioptatach ze skóry i w³osach w doœwiadczalnych zaka-

¿eniach. Dermatofity dysponuj¹ wiêc szerokim wachlarzem

enzymów umo¿liwiaj¹cych im prze¿ycie na skórze (2-6).

Dodatkowo œrodowisko skóry sprzyja im, poniewa¿:

1. Stratum corneum jest warstw¹ pozbawion¹ naczyñ

krwionoœnych, z³o¿on¹ z wyspecjalizowanych, ale mar-

twych komórek, odleg³¹ od miejsc, gdzie aktywne s¹ me-

chanizmy obronne.

2. Warstwa ta jest dobrze uwodniona – woda wydzie-

lana jest przez gruczo³y ekrynowe w czasie transepider-

malnego odparowywania. Temperatura jest ni¿sza ni¿ we-

wn¹trz cia³a, a pH w zakresie 5,5-6,7. Skóra jest te¿ do-

brze dotleniona.

3. Stratum corneum sprzyja rozwojowi dermatofitów,

poniewa¿ na jej powierzchni wystêpuj¹ bia³ka, t³uszcze,

wêglowodany i mikroelementy, np. jony ¿elaza.

4. Ukszta³towanie anatomiczne niektórych obszarów

tej warstwy pozytywnie wp³ywa na ich wzrost. Okrywa

w³osowa dzia³a jak pu³apka zatrzymuj¹ca rozsiewane dro-

g¹ powietrzn¹ artrospory. Podobnie zreszt¹ zatrzymywa-

ne s¹ zarodniki w hypoonychium pod p³ytk¹ paznokcio-

w¹ czy w przestrzeniach miêdzypalcowych lub fa³dach

skóry, gdzie dodatkowo sprzyja im jeszcze okluzja. Eks-

perymentalnie wywo³ana okluzja powoduje sfa³dowanie

stratum corneum i akumulacjê z³uszczonych korneocy-

tów na jej powierzchni. Ponadto w warunkach patologicz-

nej hiperkeratozy stratum corneum ulega znacznemu

pogrubieniu, co istotnie wp³ywa na ich rozwój (7, 8).

Grzyby keratynofilne i keratynolityczne

Zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowe sk³adniki budulcowe

ró¿nych organizmów ¿ywych w naturze nigdy nie wystê-

puj¹ jako zwi¹zki proste, ale w postaci zwi¹zanej z innymi

cz¹steczkami. W czasie degradacji przez mikroorganizmy

te cz¹steczki s¹ stopniowo uwalniane, a sk³adniki budul-

cowe, aczkolwiek dopiero po pewnym czasie, s¹ poten-

cjalnym Ÿród³em wêgla, siarki i azotu dla wielu patogenów

lub drobnoustrojów kolonizuj¹cych. In vivo cz¹steczki ke-

ratyny zwi¹zane s¹ z innymi bia³kami odgrywaj¹cymi rolê

cementu. Keratyna ta np. w postaci fragmentów w³osów

ludzkich lub zwierzêcych dostaje siê do ziemi, gdzie kolo-

nizowana jest przez wiele mikroorganizmów, w³¹czaj¹c

w to grzyby, które w bardzo zró¿nicowany i progresywny

sposób rozk³adaj¹ j¹ a¿ do zupe³nej mineralizacji (8).

Umieszczaj¹c w ziemi keratynow¹ przynêtê w postaci

ludzkiego lub zwierzêcego w³osa, mo¿na wyizolowaæ z te-

go œrodowiska grzyby nazywane keratynofilami. Zgodnie

z pogl¹dami Griffina i DeVriesa (5, 9) niektóre grzyby ko-

lonizuj¹ce przynêtê nie s¹ w stanie rozk³adaæ keratyny,

lecz wykorzystuj¹ produkty czêœciowo roz³o¿one przez in-

ne grzyby. Griffin wykaza³, ¿e wodny wyci¹g z nienaruszo-

nego w³osa zawiera znacz¹ce iloœci kwasu moczowego,

mocznika, soli amonowych, pentoz, glikogenu, fenoli i ami-

nokwasów, czyli substancji w zupe³noœci wystarczaj¹cych

do wzrostu grzybów. Wed³ug wspomnianych badaczy pierw-

sze kolonizuj¹ w³os Chytridomycetes, a wœród nich g³ów-

nie Fusarium, Penicillium i Mucor, i rozk³adaj¹ mniej

oporne substraty, a nastêpnie Gliocladium i Humicola,

które wydzielaj¹ enzymy rozk³adaj¹ce trudniej dostêpne

substraty. Dopiero ostatni¹ grup¹ s¹ typowe keratynofilne

Hyphomycetes, g³ównie Trichophyton i Microsporum.

W praktyce laboratoryjnej czêsto wykonuje siê test Ajello,

w którym okreœla siê zdolnoœæ wyizolowanego szczepu

grzybów do kolonizacji ludzkich w³osów (4). Widoczny

go³ym okiem wzrost grzybów na powierzchni w³osa

w praktyce nie oznacza jednak w³aœciwoœci keratynoli-

tycznych. Dopiero wykazanie znacznych zmian morfolo-

gicznych we w³osie oraz tworzenie wyspecjalizowanych

organów penetruj¹cych oraz tzw. grzybni dr¹¿¹cej mo¿e

byæ potwierdzeniem takich w³aœciwoœci grzybów. Bada-

nia biochemiczne, w których wykrywa siê wytwarzanie ze-

wn¹trzkomórkowych proteaz, nie s¹ wystarczaj¹cym do-

wodem na zdolnoœæ rozk³adania keratyny. Pierwszym eta-

pem, w którym keratyna jest rozk³adana, jest zniszczenie

mostków dwusiarczkowych, a tego nie s¹ w stanie doko-

naæ same proteazy. Mechanizm rozk³adu keratyny nie

jest do koñca zbadany: wiadomo, ¿e wchodzi tu w grê

sulfitoliza, czy równie¿ nieenzymatyczny rozk³ad keratyny.

Badacze, w tym równie¿ polscy, Dominik i wsp. proponu-

j¹, aby termin „keratynolityczne” by³ zarezerwowany dla

tych grzybów, które s¹ w stanie równie¿ roz³o¿yæ keraty-

nê w odró¿nieniu od keratynofili, które tylko towarzysz¹

grzybom keratynolitycznym i wykorzystuj¹ produkty po-

œrednie (10-14).

Oznacza to, ¿e najbardziej aktywne keratynolityczne

grzyby s¹ dermatofitami lub formami z nimi zwi¹zanymi:

Microsporum, Trichophyton, Aphanoascus, Chrysospo-

rium, Geomyces, Gymnoascus, oraz nale¿¹ do nich tak-

¿e niektóre gatunki Alternaria, Beauveria, Cladosporium,

Mucor, Paecilomyces, Penicillium i Scopulariopsis.

Wydawaæ siê zatem mo¿e, ¿e keratynoliza, podobnie

jak inne biochemiczne aktywnoœci grzybów, nie jest ce-

ch¹ gatunkowo swoist¹. Jednoczeœnie wystêpuj¹ bowiem

szczepy aktywne i pozbawione tej aktywnoœci w tych sa-

mych warunkach œrodowiska. Obserwuje siê równie¿

zró¿nicowanie intensywnoœci, z jak¹ szczepy atakowaæ

mog¹ substrat. Dermatofity w tym wzglêdzie te¿ nie s¹

wyj¹tkiem. Kiedy odnosi siê to do gatunku nie zawsze

udaje siê wykazaæ tak¹ aktywnoœæ w warunkach in vitro,

st¹d bezpieczniej jest mówiæ o gatunku potencjalnie kera-

background image

319

Dermatofity. Grzyby keratynofilne i ich rola w œrodowisku – po¿ytki i zagro¿enia

tynolitycznym. Jest to jeden z aspektów biozró¿nicowania

grzybów, jeœli oceniamy ca³¹ populacjê.

Grzyby keratynolityczne w cyklu przemiany materii

Ju¿ Heraklit, a za nim inni greccy filozofowie, stwierdzili,

¿e nie ma nic niezmiennego w naturze. Eksperymentalnie

potwierdza to biologia – wszystko ulega transformacji.

Mo¿na powiedzieæ, ¿e podstaw¹ ¿ycia s¹ 2 czynniki: sta³e

dostarczanie energii ze Ÿród³a zewnêtrznego i obieg ma-

terii, czyli cykliczne przechodzenie od materii nieorganicz-

nej do form organicznych i na odwrót. Pierwsz¹ faz¹ tego

cyklu jest g³ównie proces fotosyntezy, w którym g³ówn¹ ro-

lê odgrywaj¹ roœliny zielone, za pomoc¹ energii s³onecznej

wytwarzaj¹c materiê organiczn¹, ulegaj¹c¹ transformacji

przez zjadanie jej przez zwierzêta. Druga faza wystêpuje

w czasie oddychania. Bior¹ w niej udzia³ wszystkie organiz-

my, ale szczególnie mikroflora ziemi. Œrodowisko ziemi,

które jest najwa¿niejszym Ÿród³em organizmów saprotroficz-

nych i substancji organicznych pochodz¹cych ze zwierz¹t

i roœlin, przywraca do form nieorganicznych sk³adniki, które

ponownie mog¹ byæ zu¿yte przez roœliny. Wydaje siê wiêc,

¿e z³o¿one substancje nie gromadz¹ siê w ziemi; wczeœniej

czy póŸniej, w zale¿noœci od ich budowy cz¹steczkowej s¹

mineralizowane przez mikroorganizmy w ziemi, nawet kera-

tyna (15). Te nierozpuszczalne w³ókna bia³kowe, pocho-

dz¹ce z ektodermy, s³abo ulegaj¹ biodegradacji. Wyró¿nia-

my 2 rodzaje keratyny:

– a-keratyny, zawieraj¹ce du¿o aminokwasów bogatych

w cystynê i mostki dwusiarczkowe – ich twardsza forma

jest budulcem rogu i paznokci i zawiera ponad 22% cy-

styny – bardziej miêkka, elastyczna forma wystêpuje

w skórze, w³osach i we³nie i zawiera 10-14% cystyny;

– b-keratyny, pozbawione cystyny i cysteiny, ale bogate

w aminokwasy, takie jak glicyny, alanina, seryna. Wy-

stêpuj¹ one w pajêczynie, niciach jedwabników, ³us-

kach, szponach i dziobach ptaków i gadów.

Tylko a-keratyna jest problemem ekologicznym. Jej wy-

soka opornoœæ na biodegradacjê przez mikroorganizmy

jest wynikiem ciasnego upakowania ³añcuchów polipepty-

dów o strukturze a-heliksy i wi¹zañ w postaci mostków

dwusiarczkowych. Tylko niektóre mikroorganizmy s¹ w sta-

nie degradowaæ te mostki. Nale¿¹ do nich promieniowce,

niektóre szczepy Bacillus i termofilne Fervidobacterium

pennavorans, niektóre grzyby, g³ównie dermatofity i inne

wystêpuj¹ce w ziemi nale¿¹ce do Ascomycetes, oraz nie-

które grzyby nale¿¹ce do œrodowiska wodnego, np. Sapro-

legniacea i Leptolegniacae.

Rola ekologiczna grzybów w rozk³adzie keratyny jest

niew¹tpliwa i szczególnie wa¿na. Nawet jeœli trudno udo-

wodniæ ich aktywnoœæ keratynolityczn¹. W œrodowisku

naturalnym grzyby keratynolityczne bior¹ udzia³ w recy-

klingu wêgla, azotu i siarki. Ich wystêpowanie i rozprze-

strzenianie wydaje siê zale¿ne od iloœci dostêpnej keraty-

ny. Inne czynniki ekologiczne lub œrodowiskowe, takie jak

pH, temperatura, wydaj¹ siê mieæ mniejsze znaczenie ze

wzglêdu na du¿¹ tolerancjê grzybów.

a-keratyny: od polipeptydów do tkanki zkeratynizowanej

Podstawow¹ struktur¹ a-keratyn s¹ protofibryle o bu-

dowie cztero³añcuchowej, zwiniête w formê a-heliksy.

Protofibryle tworz¹ wiêksze struktury nazywane mikro-

fibrylami. We w³osach, we³nie, paznokciach mikrofibryle

zwijaj¹ siê do spiralnej formy makrofibryli. Protofibryle

i mikrofibryle s¹ powi¹zane mostkami dwusiarczkowymi,

których liczba okreœla sztywnoœæ i odpornoœæ na degra-

dacjê przez mikroorganizmy.

W³osy i paznokcie stanowi¹ Ÿród³o keratyny i mog¹ byæ

przynêt¹ do wykrywania w³aœciwoœci keratynolitycznych.

W³osy maj¹ zró¿nicowan¹, kompleksow¹ budowê. Rozk³ad

i wysycenie keratyn¹ poszczególnych partii w³osa jest zró¿-

nicowane. Os³onka w³osa ochrania go przed dzia³aniem

œrodowiska. Wszystkie komórki os³onki zawieraj¹ du¿¹

iloœæ amorficznej keratyny, szczególnie w grubszej war-

stwie zewnêtrznej, a tak¿e wewnêtrznej o du¿ej zawartoœci

cystyny. Zewnêtrzna warstwa os³onki jest tak¿e bogata

w cystynê, aczkolwiek keratyna jest tam nierównomiernie

roz³o¿ona. W warstwie wewnêtrznej keratyny jest mniej, ale

wystêpuje w cytoplazmie. Pod t¹ nieregularnie zkeratynizo-

wan¹ pow³oczk¹ le¿y warstwa komórek warstwy korowej,

zawieraj¹ca w³óknist¹ keratynê. W³ókna keratyny s¹ po³o-

¿one równolegle do osi w³osa. Mikro- i makrofibryle s¹ oto-

czone przez amorficzn¹ macierz. Mikrofibryle zawieraj¹ wy-

sokocz¹steczkow¹ keratynê i ma³o cystyny, podczas gdy

macierz zawiera niskocz¹steczkow¹ keratynê i jest bogata

w cystynê. Macierz makrofibryli zawiera ma³o keratyny, a jej

chemiczny sk³ad i w³aœciwoœci s¹ zbli¿one do w³aœciwoœci

wewnêtrznej warstwy os³onki w³osa. Komórki warstwy rdzen-

nej nie wystêpuj¹ na ca³ej d³ugoœci w³osa. Nie zawieraj¹

cystyny, lecz zwykle stosunkowo du¿e iloœci kwasu gluta-

minowego.

Czêœæ grzbietowa p³ytki paznokciowej, warstwa we-

wnêtrzna i czêœæ brzuszna ró¿ni¹ siê gruboœci¹, a tak¿e

gêstoœci¹ i typem wi¹zañ miêdzy komórkami. Generalnie,

paznokcie maj¹ jednak bardziej jednolit¹ budowê ni¿ w³o-

sy i cytologicznie mog¹ byæ porównywalne z warstw¹ ko-

row¹. Analiza keratyny wykazuje, ¿e w³osy i paznokcie

strukturalnie i histochemicznie s¹ podobne w tych war-

stwach (4, 7, 15).

Degradacja keratyny

Ocena zdolnoœci rozk³adania keratyny oparta jest g³ów-

nie na testach biochemicznych i morfologicznych. Testy

biochemiczne do oceny keratynolizy przez grzyby polega-

j¹ na badaniu wydzielanych enzymów i maj¹ istotne zna-

czenie przy okreœlaniu wirulencji grzybów patogennych,

a tak¿e znalaz³y zastosowanie w biotechnologii przy pro-

dukcji ¿ywnoœci. Wielu badaczy wi¹¿e zdolnoœæ degra-

dacji keratyny z wytwarzaniem specyficznych zewn¹trz-

komórkowych enzymów proteolitycznych nazywanych ke-

ratynazami, których wytwarzanie mo¿e byæ indukowane

obecnoœci¹ keratyny w pod³o¿u. Jakkolwiek proteazy wy-

dzielane przez T. rubrum, które s¹ odpowiedzialne za ke-

ratynolizê, równie¿ ulegaj¹ ekspresji nawet w fazie stacjo-

narnej wzrostu. Wszystkie keratynazy chemicznie wyda-

j¹ siê proteinazami serynowymi. Ich masa cz¹steczkowa

kszta³tuje siê w granicach od 30 do 50 kDa. Wiêkszoœæ

jest aktywna w pH miêdzy 7 i 8, niektóre dzia³aj¹ równie¿

w pH kwaœnym. Istnieje olbrzymie powinowactwo antyge-

nowe miêdzy keratynazami dermatofitów. Niektórzy bada-

cze zaobserwowali, ¿e spoœród keratynaz grzybów i bakte-

rii najbardziej aktywne s¹ niespecyficzne proteazy, takie

jak trypsyna i papaina. Jak ju¿ wspominano, destrukcja

mostków siarczkowych, prawdopodobnie na drodze sulfi-

background image

tolizy wydaje siê pocz¹tkowym etapem degradacji i czyni

keratynê bardziej dostêpn¹ na dzia³anie enzymów proteoli-

tycznych (16-18). Obecnie za najbardziej przydatne do wy-

kazania keratynolizy in vitro uznaje siê badania morfologicz-

ne. Pierwsze obserwacje w mikroskopie œwietlnym przepro-

wadzone by³y przez DeVries (5), a tak¿e Richardson M.

Edward (7). W badaniach tych dok³adnie opisano zmiany

zachodz¹ce w grzybni dermatofitów i innych grzybów ke-

ratynolitycznych w czasie rozk³adania keratyny. Ocena

zmian morfologicznych w trakcie keratynolizy we w³osie,

wytworzenia struktur grzybiczych i ich oddzia³ywania na

macierz w³osa mo¿liwe by³y dopiero przy u¿yciu skaningo-

wego mikroskopu elektronowego. Obserwowano 2 g³ów-

ne formy inwazji: powierzchniow¹ erozjê oraz penetracjê

promienist¹, radialn¹.

W czasie erozji powierzchniowej obserwuje siê stop-

niow¹ destrukcjê w³osa przez grzybniê, która penetruje

miêdzy ³uskami os³onki, rozpuszczaj¹c je. Grzybnia wy-

d³u¿a siê i rozga³êzia drzewkowato. W warstwie korowej

grzybnia rozwija siê nadal i mo¿e formowaæ p³askie, roz-

ga³êzione strzêpki. Te palczaste rozga³êzienia grzybni na-

zywane s¹ grzybni¹ erozyjn¹ i powoduj¹ naruszenie struk-

tury powierzchni w³osa oraz powstawanie tuneli powietrz-

nych w warstwie korowej, z regu³y wiêkszych ni¿ rozmiary

strzêpek. Grzybnia mo¿e siê rozwijaæ nadal, dr¹¿¹c przez

warstwê korow¹ przez przestrzenie miêdzykomórkowe.

Penetracja radialna polega na wytworzeniu wyspecjali-

zowanej grzybni, która dr¹¿y w³os prostopadle do jego

powierzchni. Ten fragment grzybni nazywany jest grzyb-

ni¹ dr¹¿¹c¹ lub organem penetruj¹cym. Pole powsta³e po

rozpuszczonej tkance jest równie¿ wiêksze ni¿ œrednica

grzybni penetruj¹cej. W zaka¿eniach grzybami keratynoli-

tycznymi obie te formy inwazji z regu³y wspó³wystêpuj¹.

Kolejnych informacji dostarcza obraz z transmisyjnego

elektronowego mikroskopu. Okazuje siê, ¿e kolejnoœæ

degradacji komponentów w³osa jest zale¿na od stopnia

ich keratynizacji i zawartoœci cystyny. W os³once w³osa

penetracja grzybni miêdzy ³useczkami sprowadza siê do

inwazji na komórki nieskeratynizowane i wewnêtrzn¹ stro-

nê ³usek. W warstwie korowej najpierw rozk³adana jest

b³ona komórkowa i cytoplazma, a dopiero póŸniej miê-

dzymakrofibralna macierz i mikrofibryle. Najbardziej od-

porna jest macierz mikrofibryli. U grzybów keratynofilnych

nienale¿¹cych do dermatofitów nie obserwuje siê pene-

tracji radialnej zale¿nej od stopnia keratynizacji. Wydaje

siê, ¿e grzyby te koncentruj¹ swoj¹ aktywnoœæ na koñ-

cach grzybni, które dzia³aj¹ jak œwider. Organy penetruj¹-

ce dermatofitów nie s¹ jeszcze dok³adnie poznane i nie

wiadomo, w którym momencie grzybnia ulega specjaliza-

cji; czy ju¿ przy penetracji os³onki w³osa, czy dopiero przy

osi¹gniêciu warstwy korowej. U grzybów keratynolitycz-

nych nienale¿¹cych do dermatofitów, izolowanych z ziemi

Chrysosporium tropicum czy Scopulariopsis brevicau-

lis, nie obserwowano tworzenia organów penetruj¹cych,

chocia¿ uszkadzaj¹ w³osy w stopniu podobnym do der-

matofitów (7, 11).

Paznokcie stanowi¹ Ÿród³o substancji wzrostowych

dla grzybów keratynolitycznych znacznie rzadziej ni¿ w³o-

sy. S. brevicaulis obserwuje siê w przypadkach onycho-

mikozy, ale najczêœciej jako wtórne zaka¿enie. Grzyby te

niszcz¹ paznokcie w sposób zbli¿ony do destrukcji war-

stwy korowej w³osa w kolejnoœci okreœlanej stopniem

skeratynizowania œrodowiska i zawartoœci cystyny.

Doœwiadczalny model zaka¿enia dermatofitami

Skóra ssaków mo¿e byæ kolonizowana zarówno przez

dermatofity, jak te¿ i inne grzyby niezaliczane do tej gru-

py. Zdolnoœæ grzybów do adherencji do warstwy zrogo-

wacia³ej naskórka, a tak¿e mo¿liwoœæ wykorzystywania

zawartej w niej keratyny œwiadcz¹ o w³aœciwoœciach inwa-

zyjnych grzybów. W naturze form¹ inwazyjn¹ dermatofi-

tów s¹ artrospory i strzêpki grzybni. W celu oceny pato-

mechanizmu tych zaka¿eñ celowe by³o stworzenie uk³a-

du modelowego naœladuj¹cego naturalne zaka¿enie.

ród³o infekcji

Eksperymentalnie grzybicê skóry mo¿na wywo³aæ ino-

kuluj¹c ró¿ne formy morfologiczne dermatofitów. Zaka¿e-

nie mo¿e byæ indukowane za pomoc¹ makrokonidiów,

mikrokonidiów i artrospor z naturalnie zaka¿onych w³o-

sów, skrawków zaka¿onej skóry lub fragmentów hodowli

agarowej. Wydaje siê wiêc, ¿e wszystkie formy morfolo-

giczne dermatofitów potencjalnie mog¹ byæ form¹ inwa-

zyjn¹, lecz jedynie artrospory formowane in vivo w miej-

scu zmian grzybiczych s¹ form¹ najbardziej przystosowa-

n¹ do rozprzestrzeniania siê infekcji. Równie¿ w zmianach

skórnych dermatofity mog¹ wystêpowaæ w postaci strzê-

pek i za ich pomoc¹ mog¹ rozsiewaæ siê przez kontakt

bezpoœredni. Artrospory obecne w z³uszczonym naskórku

lub bezpoœrednio w powietrzu maj¹ jednak zdecydowanie

bardziej ograniczone zapotrzebowanie na sk³adniki od¿yw-

cze i w zwi¹zku z tym s¹ bardziej odporne na dzia³anie œro-

dowiska. Atrospory produkowane s¹ z regu³y w olbrzymiej

liczbie. Rola strzêpek grzybni w rozprzestrzenianiu zaka¿e-

nia zale¿na jest od tego, jak potrafi¹ one znieœæ nieko-

rzystne oddzia³ywanie œrodowiska (2). Artrokonidia wytwa-

rzane przez fragmentacjê strzêpek wydaj¹ siê najbardziej

przystosowane do wzrostu w stratum corneum z powodu

ich niewielkich rozmiarów; makro- i mikrokonidia, które

z regu³y formowane s¹ bocznie na strzêpce, do swojego

rozwoju potrzebuj¹ wiêcej przestrzeni. Rozprzestrzenianie

za pomoc¹ artrospor pozwala dermatofitom pokonaæ pro-

ces z³uszczania i mechanicznego usuwania naskórka. Ob-

ni¿aj¹ca siê wilgotnoœæ w martwych komórkach sprzyja se-

paracji artrospor (7, 11).

Eksperymentalny model inwazji grzybiczej

Przyleganie do stratum corneum

Pierwszym etapem kolonizacji mikroorganizmów jest

adherencja do komórek gospodarza. Zarodniki dermatofi-

tów zwykle pochodz¹ z egzogennego Ÿród³a, poniewa¿

dermatofity nie wchodz¹ w sk³ad normalnej flory skóry.

Najprostszym modelem do badañ adherencji jest u¿ycie

wyizolowanych korneocytów i zawiesiny zarodników der-

matofitów. Proces adherencji zale¿ny jest oczywiœcie od

obecnoœci swoistych receptorów i ligand w œcianie ko-

mórkowej, zarówno korneocytów, jak i artrospor. Istotna

jest tu te¿ rola sebum – ³oju skórnego. Wykazano, ¿e ist-

niej¹ ró¿nice w adherencji dermatofitów do korneocytów

izolowanych z ró¿nych okolic cia³a. Stosuj¹c taki model,

wykazano, ¿e ju¿ po 6 godz. inkubacji zaczyna siê germi-

nacja artrospor. W mikroskopie elektronowym transmisyj-

nym i skaningowym wykazano, ¿e adherencja polega na

320

Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2004, 11 (4)

background image

321

Dermatofity. Grzyby keratynofilne i ich rola w œrodowisku – po¿ytki i zagro¿enia

stosunkowo luŸnym wi¹zaniu korneocytów i artrospor bez

uszkadzania b³ony komórkowej korneocytu. Fibryle ze-

wnêtrznej warstwy œciany komórkowej artrospor odgrywa-

j¹ tu wa¿n¹ rolê. W przypadku adherencji strzêpek po-

mocne s¹ te¿ jej boczne odga³êzienia (2, 6, 7).

Innym, równie prostym, modelem do badañ adheren-

cji jest wykonanie tzw. powierzchniowej biopsji skórnej za

pomoc¹ cyjanoakrylowej wysokoadhezyjnej taœmy przy-

lepnej. Stratum corneum jest utworzona g³ównie z ko-

mórek obumar³ych w procesie z³uszczania, daje siê wiêc

³atwo odwzorowaæ na taœmie z zachowaniem jej natural-

nej struktury. Na tak przygotowanym modelu naskórka

gruboœci co najmniej 5 korneocytów artrokonidia derma-

tofitów zaczynaj¹ germinowaæ ju¿ po 6 godz. inkubacji

w temp. 37°C. Po d³u¿szej inkubacji filamenty z artrokoni-

diów wyd³u¿aj¹ siê i wrastaj¹ w stratum corneum wzd³u¿

i wszerz. Po 7 dniach inkubacji strzêpki zaczynaj¹ formo-

waæ artrokonidia, zamykaj¹c tym samym wegetatywn¹ fa-

zê cyklu ¿yciowego grzyba. W skaningowym mikroskopie

elektronowym mo¿na zaobserwowaæ uszkodzenie po-

wierzchni korneocytów. Horyzontalne wyd³u¿anie grzybni

obserwowane w tym modelu badawczym odpowiada ob-

serwacjom klinicznym, gdzie zmiany ogniskowe rozprze-

strzeniaj¹ siê od centrum w kierunku peryferyjnym. Der-

matofity mog¹ byæ wyhodowane z tych ognisk z miejsc

odleg³ych nawet o 6 cm od brzegów zmian na skórze.

Eksperymentalnie wykazano, ¿e szczepy zoofilne T. men-

tagrophytes mog¹ penetrowaæ g³êbsze warstwy stratum

corneum ni¿ szczepy antropofilne.

Kolejnym modelem badawczym jest zastosowanie

ekwiwalentu ¿ywej skóry. Model ten wykazuje ogromne

podobieñstwo do normalnej skóry i jest nieoceniony przy

badaniach dotycz¹cych dzia³ania fungistatyków. Artroko-

nidia s¹ inokulowane na ekwiwalent skóry i inkubowane

przez 7 dni w temp. 28°C. Wzrost grzybów jest kontrolo-

wany przez zdjêcia w mikroskopie optycznym i skaningo-

wym. Ju¿ po 4 dniach obserwowano wzrost grzybów na

powierzchni skóry. Po 72 godz. inkubacji w preparatach

histologicznych obserwowano germinacjê i penetracjê

horyzontaln¹ grzybni w stratum corneum. Po 6 dniach

penetracja grzybni dotyczy³a ju¿ te¿ epidermis, docho-

dz¹c a¿ do zewnêtrznej warstwy skóry w³aœciwej, dermis.

W mikroskopie skaningowym obserwowano adherencjê

niegerminuj¹cych artrokonidiów do korneocytów za po-

moc¹ w³ókien kolagenowych. Niektóre artrokonidia by³y

lekko zag³êbione w powierzchni ekwiwalentu skóry i oto-

czone przez w³ókna kolagenowe. Artrokonidia by³y ró¿nej

wielkoœci i kszta³tu ju¿ po 48 godz., a ich wymiary kszta³-

towa³y siê w granicach 8-10 mm, a germinacja dopiero

siê zaczyna³a. Po 6 dniach obserwowano ju¿ dobrze wy-

kszta³cone, rozga³êzione mycelium. Strzêpki szczególnie

dobrze przerasta³y macierz kolagenow¹ ekwiwalentu skóry

i przestrzenie miêdzy w³óknami kolagenowymi. Strzêpki

zaczyna³y segmentowaæ artrospory.

Na tym samym modelu przeœledzono wzrost grzybów

nienale¿¹cych do dermatofitów, ale okazjonalnie zwi¹za-

nych z grzybic¹ p³ytki paznokciowej, tzn. Scopulariopsis,

Fusarium i Acremonium. Wszystkie 3 pleœnie germinowa³y

na powierzchni ekwiwalentu skóry. Grzybnia Scopulario-

psis penetrowa³a stratum corneum i bardzo nieznacznie

epidermis. Dla kontrastu Fusarium i Acremonium by³y

w stanie zaatakowaæ pe³n¹ gruboœæ epidermis i w pewnym

stopniu nawet skórê w³aœciw¹ (1, 2, 7, 10, 15).

Zaka¿enia dermatofitami p³ytki paznokciowej

Paznokcie s¹ predysponowane do inwazji przez wiele

mikroorganizmów, w³¹czaj¹c grzyby, które atakowaæ mo-

g¹ ¿yw¹ tkankê ³o¿yska lub wa³u paznokciowego, inne

atakuj¹c sam¹ p³ytkê (19, 20). Oceniaj¹c zdolnoœæ grzy-

bów do zaka¿ania paznokci, trzeba uwzglêdniæ ró¿ne

anatomiczne w³aœciwoœci budowy paznokcia. Histologicz-

nie mo¿na wyodrêbniæ 3 czêœci ludzkiego paznokcia, je-

go warstwy rogowej: czêœæ grzbietow¹, œrodkow¹ i spo-

dni¹ – brzuszn¹. Keratyna hypoonychium czêœci spo-

dniej zawiera komórki bezj¹drzaste, u³o¿one luŸno i nie-

regularnie. Sytuacja przypomina trochê stratum corneum

naskórka. Podobnie jak w naskórku luŸne utkanie sprzyja

infekcjom grzybiczym, zw³aszcza jeœli paso¿yty maj¹ mo¿-

liwoœæ migracji z otaczaj¹cej paznokieæ skóry. Hypoony-

chium w wielu jednostkach chorobowych mo¿e ulegaæ

hipertrofii. Proces keratynizacji warstwy ziarnistej nazywa-

ny jest w paznokciu onychizacj¹ ze wzglêdu na funkcjo-

nalne ró¿nice keratyny skóry i paznokci. Zdolnoœæ wyko-

rzystywania keratyny paznokci jako substancji niezbêdnej

do wzrostu przez dermatofity jest udowodniona, lecz nie-

jasny jest status jako pierwotnych patogenów pleœni i dro¿-

d¿aków, takich jak Scopulariopsis brevicaulis, Acremo-

nium spp. lub Candida albicans. Niewiele uwagi poœwiê-

cono penetracji p³ytki paznokciowej in vivo i in vitro przez

dermatofity. Istnieje tylko kilka satysfakcjonuj¹cych mode-

li doœwiadczeñ, w których mo¿na oceniæ zdolnoœæ grzy-

bów do kolonizacji i inwazji p³ytki paznokciowej (19, 20).

W hodowli in vitro inokuluje siê artrokonidia dermatofitów

na spodni¹ powierzchniê fragmentów paznokci palców

lub palucha i ju¿ po 6 godz. inkubacji mo¿na obserwowaæ

adherencjê i germinacjê artrokonidiów. Po 16 godz. po-

jawiaj¹ siê ma³e, rozga³êzione strzêpki. Po oko³o 24

godz. mo¿na zaobserwowaæ pojawianie siê mikrokolonii

w p³ytce. Po 48 godz. formowane jest prawdziwe myce-

lium, a po 72 godz. wiêkszoœæ p³ytki paznokciowej jest

pokryta grzybni¹. Penetracja p³ytki rozpoczyna siê od jej

powierzchni brzusznej przez przestrzenie miêdzykomór-

kowe, a po d³u¿szej inkubacji wszystkie 3 warstwy s¹ ju¿

zaatakowane, co objawia siê tunelami wydr¹¿onymi przez

rozrastaj¹c¹ siê grzybniê. In vivo taki obraz spotyka siê

rzadko. Inwazja p³ytki paznokciowej polega na wspó³dzia-

³aniu czynników mechanicznych i chemicznych. Podob-

nie w opisywanym eksperymencie zachowywa³y siê ple-

œnie. Proces inwazji p³ytki paznokciowej mo¿e przebie-

gaæ jednak wolniej i ze s³abszym nasileniem. Zauwa¿ono

pewne analogie miêdzy wzrostem dermatofitów w stra-

tum corneum i p³ytce paznokciowej. Taki model jest rów-

nie¿ bardzo przydatny do oceny efektu terapeutycznego

mikostatyków in vitro.

Zaka¿enie mieszków w³osowych

Zmiany patologiczne zachodz¹ce we w³osie zaatako-

wanym przez dermatofity s¹ nie do koñca zrozumia³e.

Zmiany te sprowadzaj¹ siê do:

1) oddzielenia os³onki w³osa, kutikuli,

2) erozji warstwy korowej w³osa,

3) wytworzenia organów penetruj¹cych w³os,

4) kolonizacji warstwy rdzennej.

Wiadomo, ¿e dermatofity ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ zdol-

noœci¹ do inwazji w³osów w warunkach in vitro (15). Do-

background image

322

Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Mikol. Lek. 2004, 11 (4)

tychczasowe badania modelowe przeprowadzane by³y na

w³osach wycinanych lub depilowanych, a do ekspery-

mentu u¿ywane by³y makro- lub mikrokonidia. Nie prze-

prowadzano te¿ badañ in vitro dotycz¹cych zaka¿eñ miesz-

ków w³osowych. W opisywanym eksperymencie w³osy uzy-

skiwano wypreparowuj¹c je ze skóry razem z mieszkiem

w³osowym i inokulowano artrokonidiami dermatofitów. Ob-

serwowano wzrost grzybów zarówno w mieszku, jak i na

powierzchni w³osa. Wzrost rozpoczyna siê od strony wa-

³u, a grzybnia roœnie dalej wzd³u¿ w³osa i wokó³ bañki.

W mieszkach w³osowych hodowanych w kulturach tkan-

kowych wewnêtrzna powierzchnia wa³u te¿ by³a zaatako-

wana przez dermatofity. Pocz¹tkowo kutikula stanowi³a

dla wzrostu dermatofitów barierê. Po 4-dniowej inkubacji

kie³kuj¹ca grzybnia zaczê³a wnikaæ pod os³onkê i miêdzy

warstwy komórek kutikularnych i penetrowaæ warstwê ko-

row¹. Nie obserwowano wzrostu wewn¹trzkomórkowego

– elementy grzybicze wzrasta³y wy³¹cznie w przestrze-

niach miêdzykomórkowych. Obraz eksperymentalny ³u-

dz¹co przypomina zmiany wystêpuj¹ce w naturalnym za-

ka¿eniu.

Epithelium gospodarza jest g³ówn¹ barier¹ dla pasyw-

nej inwazji grzybiczej. Penetracja naskórka jest mo¿liwa

dziêki enzymatycznej degradacji powierzchniowych ma-

krocz¹steczek, ³¹cznie z keratyn¹. Zdolnoœæ adherencji

i aktywnoœæ keratynolityczna s¹ wiêc g³ównymi czynnika-

mi wirulencji grzybów. Jeœli uznamy, ¿e zdolnoœæ rozk³a-

dania alfakeratyny przez grzyby w warunkach in vitro prze-

k³ada siê na zdolnoœæ wywo³ywania zaka¿enia in vivo, wów-

czas wszystkie wystêpuj¹ce w glebie grzyby keratynofilne

nale¿y uznaæ za potencjalne patogeny. Bior¹c pod uwagê

dermatofity, mo¿na sobie wyobraziæ ewolucjê od prymityw-

nych saprotrofów glebowych do bardziej wyspecjalizowa-

nych gatunków bêd¹cych paso¿ytami wybranego gospo-

darza. Podobnie ka¿dy inny gatunek glebowych grzybów

keratynolitycznych móg³ ewoluowaæ i nabyæ zdolnoœæ de-

gradacji keratyny ludzkiej lub zwierzêcej. Nie zawsze jed-

nak mo¿na udowodniæ, ¿e istnieje zwi¹zek miêdzy izo-

lacj¹ tych grzybów ze zmian skórnych a samymi zmiana-

mi. Czêsto grzyby te traktowane s¹ jako kontaminacja.

Coraz wiêcej danych przemawia jednak za tym, ¿e zarów-

no geofilne dermatofity, jak i inne glebowe grzyby keraty-

nolityczne mog¹ byæ uznawane za patogeny. Wydaje siê

jednak, ¿e do poznania prawdziwych mechanizmów pato-

genezy grzybic skórnych potrzebna jest znajomoœæ tak¿e

innych warunków, ³¹cznie z ekspozycj¹ komórek na spe-

cyficzne produkty uwalniane przez gospodarza w ró¿nych

etapach inwazji i kolonizacji patogenami.

Piœmiennictwo

1. Ulfig K.: The occurrence of keratinolytic fungi in waste and waste

contaminated habitats. In Biology of Dermatophytes and other

keratophilic fungi. Rev. Iberoam. Micol., 2000, 11, 44-49.

2. Kunert J.: Physiology of keratinophilic fungi. Rev. Iberoam. Micol.,

2000, 11, 77-85.

3. Kunert J.: Keratin decomposition by dermatophytes. Z. Algemeine

Mikrobiol., 1976, 16, 97-105.

4. Filipello Marchisio V.: Keratinophilic fungi: Their role in nature and

degradation of keratinic substrates. Rev. Iberoam. Micol., 2000,

11, 86-92.

5. DeVries G.A.: Keratinophylic fungi and their action. Antonie van

Leewenhoek, 1962, 28, 121-133.

6. Marks R., Dawber R.P.R.: In situ microbiology of stratum cor-

neum: an application of skin surface biopsy. Arch. Dermatol., 1972,

105, 216-221.

7. Richardson M., Edward M.: Model system for the study of derma-

thophyte an non–dermathophyte invasion of human keratin. Rev.

Iberoam. Micol., 2000, 11, 15-22.

8. Ali-Shtaych M., Jamous R.: Keratinophylic fungi and related der-

matophytes in polluted soil and water habitas. Rev. Iberoam. Micol.,

2000, 11, 51-59.

9. Griffin D.M.: Fungal colonization of sterile hair in contact with soil.

Trans. Br. Mycol. Soc., 1960, 43, 583-596.

10. Gugnani H.C.: Nondermathopytic filamentous keratinophilic fungi

and their role in human infection. Rev. Iberoam. Micol., 2000, 11,

109-114.

11. Richardson M., Aljabre S.H.M.: Pathogenesis of dermatophytosis.

[w:] Current topics in medical mycology. vol. 5, Prous Science, Bar-

celona, 1993, 49-77.

12. Ruffin P., Andrieu S., Biserte G., Biguet J.: Sulphitolysis in kerati-

nolysis. Biochemical proof. Sabouraudia, 1976, 14, 181-184.

13. Dominik T., Inhatowicz A., Kopylow H., Mietkiewsky R.: Mycoflore

of sand boxes in kindergardens in Szczecin. Ekol. Pol., 1973, 21,

901-923.

14. Majchrowicz I., Dominik T.: Further contribution to the knowledge of

keratinolytic and keratinophilic soil fungi of the region of Szczecin –

Keratinolytic and keratinophilic fungi in the immediate surroun-

dings of cattle. Ekol. Pol., 1969, 17, 87-116.

15. Filipello Marchisio V., Fuscori A., Rigo S.: Keratinolysis and its

morphological expression in hair digestion by airborn fungi. My-

copathologia, 1994, 127, 103-115.

16. Siesenop U., Bohm K.H.: Comparative studies on keratinase pro-

duction of Trichophyton mentagrophytes strains of animal origin.

Mycoses, 1995, 38, 205-209.

17. Oyeka C.A.: Trichophyton mentagrophytes a keratinophilic fungus.

Rev. Iberoam. Micol., 2000, 11, 60-65.

18. Cabanes F.J.: Dermathophytes in domestic animals. Rev. Iberoam.

Micol., 2000, 11, 104-108.

19. Rashid A., Scott E., Richardson M.: Early events in the invasion of

the human nail plate by Trichophyton mentagrophytes. Br. J.

Dermatol., 1995, 133, 932-940.

20. Torres-Rodriguez J.M., Lopez-Jodra O.: Epidemiology of nail

infection due to keratinophilic fungi. Rev. Iberoam. Micol., 2000,

11, 122-135.

Adres do korespondencji:

Dr hab. Bo¿ena Dworecka-Kaszak

Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej SGGW

Katedra Nauk Przedklinicznych,

Zak³ad Wirusologii, Mykologii i Immunologii,

Pracownia Mykologii

ul. Ciszewskiego 8

02-786 Warszawa

e-mail: dworecka@alpha.sggw.waw.pl

Praca wp³ynê³a do Redakcji: 24 maja 2004 r.

Zaakceptowano do druku: 21 wrzeœnia 2004 r.


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Grzyby dimorficzne
Grzyby
Grzyby alergenne 1
Grzyby mikroskopowe stosowane w procesach przemyslowych technologii żywności
Borowiki duszone, różne różnośći, Grzyby na wiele sposobow ═══════════════
Grzyby MECHANIZM ZMIAN CHOROBOWYCH a, EDUKACJA, Dermatologia
Keratynowe prostowanie włosów tak czy nie
Mszaki, paprotniki, rośliny nasienne i grzyby
Grzyby Halucynogenne
Flaczki z boczniaków, różne różnośći, Grzyby na wiele sposobow ═══════════════
Grzyby nadziewane wieprzowiną z grilla
Grzyby trujące, Ratownictwo Medyczne Studia, Giełda, 1. rok, Biologia i parazytologia
grzyby pytaniaaa, Mikrobiologia wet, sem 2
Grzyby kiszone, różne różnośći, Grzyby na wiele sposobow ═══════════════
gielda z koła, IV rok Lekarski CM UMK, Higiena i epidemiologia, Kolokwia, Grzyby, higiena szkolna
Grzyby, Pomoce naukowe, studia, biologia

więcej podobnych podstron