Postępy Biochemii 58 (4) 2012

393

Elżbieta Rębas



Tomasz Boczek
Antoni Kowalski
Kinga Kuśmirowska
Malwina Lisek
Ludmiła Żylińska

Zakład Neurochemii Molekularnej, Katedra

Biochemii Medycznej, Uniwersytet Medyczny

w Łodzi, Łódź



Zakład Neurochemii Molekularnej, Katedra

Biochemii Medycznej, Uniwersytet Medyczny

w Łodzi, ul. Mazowiecka 6/8 92-215 Łódź; tel.:

(42) 272 56 84, e-mail: elzbieta.rebas@umed.

lodz.pl

Artykuł otrzymano 20 października 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 22 października

2012 r.

Słowa kluczowe: kalmodulina, kanały VGCC,

NMDA, TRP, IP

3

R, RyR

Wykaz skrótów: AMPAR (ang. α-amino-3-

hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid recep-

tor) — receptor kwasu α-amino-3-hydroksy-

5-metylo-4-izoksazolopropionowego;

CaM

— kalmodulina; CaMK (ang. Ca

2+

/calmodulin-

-dependent protein kinases) — kinazy zależne od

kompleksu wapń-kalmodulina; CREB (ang.

cAMP response element-binding protein) — białko

wiążące element odpowiedzi na cAMP; GAP-

43 (ang. growth associated protein 43) — neuro-

modulina; IP

3

(ang. inositol-1,4,5-trisphosphate)

— inozytolotrisfosforan; IP

3

R — receptor ak-

tywowany IP

3

; LTP (ang. long-term potentiation)

— długoterminowy potencjał pobudzający;

nCaBP (ang. neuronal calcium-binding proteins)

— neuronalne białka wiążące wapń; NCS (ang.

neuronal calcium sensors) — neuronalne sensory

wapnia; NGF (ang. nerve growth factor) — czyn-

nik wzrostu nerwu; NMDAR (ang. N-methyl-

-D-aspartate receptor) — receptor N-metylo-D-

-asparaginianowy; PKA (ang. protein kinase A)

— kinaza białkowa A; PKC (ang. protein kinase

C) — kinaza białkowa C; PLC (ang. phospholi-

pase C) — fosfolipaza C; PMCA (ang. plasma

membrane calcium ATPase) — Ca

2+

-ATPaza bło-

ny plazmatycznej; RyR — receptor rianodyno-

wy (ang. ryanodine receptor); SERCA (ang. sarco/

endoplasmic reticulum Ca

2+

-ATPase) — Ca

2+

-

ATPaza siateczki endo/sarkoplazmatycznej;

TRP — ang. transient receptor potential; VGCC

(ang. voltage-gated calcium channel) — kanał

wapniowy zależny od napięcia

Udział kalmoduliny w zależnej od Ca

2+

sygnalizacji w komórkach pobudliwych

Podziękowanie: Praca powstała w trakcie realizacji projektu badawczego nr 502-03/6-086-

02/502-64-036, 503/6-086-02/503-01 Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

STRESZCZENIE

J

ednym z białek sensorowych uczestniczących w sygnalizacji komórkowej zależnej od

wapnia jest kalmodulina (CaM). Kalmodulina jest małym białkiem, które po związaniu

jonów wapnia indukuje szereg dróg sygnalizacyjnych w komórce i jest zaangażowane w

podstawowe procesy życiowe włączając wzrost, różnicowanie, proliferację, przeżywalność

oraz ruchliwość. CaM uczestniczy także w wygaszaniu sygnału wapniowego bezpośrednio

poprzez aktywację plazmatycznej Ca

2+

-ATPazy (PMCA) oraz pośrednio endo/sarkoplazma-

tycznej Ca

2+

-ATPazy (SERCA). CaM moduluje również aktywność kanałów wapniowych

m.in. kanałów wapniowych zależnych od napięcia (VGCCs), kanałów wapniowych zależ-

nych od cyklicznych nukleotydów, receptorów NMDA, receptorów z rodziny TRP (ang.

transient receptor potential channel) oraz receptorów zlokalizowanych w siateczce śródpla-

zmatycznej: rianodynowego i wszystkich izoform receptora zależnego od IP

3

.

WPROWADZENIE

Wapń jest jednym z przekaźników sygnału w komórce działającym dzięki

wrażliwości komórki na niewielkie nawet, miejscowe zmiany jego stężenia. Re-

gulacja zmian stężenia Ca

2+

oraz precyzyjne odczytywanie sygnału wapniowe-

go przez wewnątrzkomórkowe sensory są czynnikami regulatorowymi szlaków

sygnalizacyjnych i ostatecznie determinującymi również fizjologiczną odpo-

wiedź komórki na zewnątrzpochodne substancje aktywujące. Homeostaza wap-

niowa utrzymywana jest w komórce dzięki zrównoważonej regulacji napływu

jonów wapnia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej i uwalniania z magazynów

wewnątrzkomórkowych oraz usuwaniu jego nadmiaru z cytosolu. Za wzrost

cytoplazmatycznego stężenia Ca

2+

odpowiedzialny jest system kanałów obec-

nych w błonie plazmatycznej (kanały wapniowe zależne od napięcia (VDCC,

ang. voltage-dependent calcium channel), kanały wapniowe zależne od ligandu

(NMDAR, ang. N-methyl-D-aspartate receptor; AMPAR, ang. α-amino-3-hydroxy-

5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor) oraz w błonie siateczki śródplazma-

tycznej (kanały zależne od IP

3

, kanały rianodynowe). Zmniejszanie zaś stężenia

Ca

2+

w cytosolu zachodzi przy udziale pomp wapniowych i wymienników so-

dowo-wapniowych. Niezaprzeczalną rolę w regulacji homeostazy wapniowej

odgrywają także białka wiążące Ca

2+

.

Obecnie sklasyfikowano wiele rodzin białek wiążących wapń, z wysoce spe-

cyficzną lokalizacją tkankową. W komórkach pobudliwych elektrycznie takich,

jak neurony i siatkówka oka, większość tych białek tworzy grupę określaną jako

nCaBP (ang. neuronal calcium-binding protein) lub NCS (ang. neural calcium sen-

sors). Uczestniczą one w takich procesach jak: fototransdukcja, uwalnianie neu-

roprzekaźników, metabolizm cyklicznych nukleotydów i fosfatydyloizozytoli,

kontrola ekspresji genów czy regulacja aktywności kanałów jonowych [1].

Wyróżniamy kilka klas białek wiążących wapń w różnych rejonach mózgu.

Do białek NCS zaliczana jest frequenina (NCS-1), białka VILIPs (ang. visinin-

-like proteins): hippokalcyna, neurokalcyna δ, VILIP 1-3; rekoweryna, trzy białka

GCAP (ang. guanylate cyclase activating proteins) i 4 rodzaje kanałów potasowych

zależnych od potencjału błonowego. Do białek nCaBP należą m.in. kaldendryna,

białka CaBPs 1–5, kalneurony 1 i 2 (CaBP7 i 8). Wszystkie te białka wykazują

mniejsze (NCS <20%) lub większe (nCaBP > 20%) podobieństwo w budowie do

kalmoduliny, która w przeciwieństwie do pozostałych jest białkiem obecnym

we wszystkich komórkach eukariotycznych. Dlatego też przypisuje jej się naj-

większe znaczenie i udział w sygnalizacji komórkowej zależnej od wapnia. Ina-

czej niż większość NCS i nCaBP, które zlokalizowane są w specyficznych prze-

działach komórkowych, kalmodulina jest rozpuszczalna i rozprzestrzeniona w

394

www.postepybiochemii.pl

cytosolu. W wielu przypadkach kalmodulina, białka NCS i

nCaBP wiążą się z tymi samymi białkami docelowymi jed-

nak z różnym funkcjonalnym skutkiem [1-3].

KALMODULINA — STRUKTURA

Kalmodulina jest małym białkiem o masie cząsteczkowej

16 kDa, którego funkcją jest wiązanie jonów wapnia podczas

indukowania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i jest zaan-

gażowana w podstawowe procesy komórkowe włączając

wzrost, różnicowanie, proliferację, przeżywalność oraz ru-

chliwość [4]. CaM jest białkiem o strukturze zachowanej w

ewolucji, składającym się z dwóch globularnych domen po-

łączonych centralną α-helisą. Charakterystyczny jest układ

dwóch domen zawierających dwa motywy helisa-pętla-he-

lisa (dłonie EF), każdy wiążący dwa jony wapnia [5]. Dzięki

temu cząsteczka kalmoduliny kooperatywnie przyłącza 4

Ca

2+

. Wiązanie Ca

2+

powoduje zmiany w strukturze każdej

z domen, prowadząc do ekspozycji miejsc hydrofobowych,

które odpowiadają za oddziaływanie z białkami zależnymi

od CaM. Rejon C-końcowy CaM wiąże Ca

2+

z wysokim po-

winowactwem (K

d

=10

–7

M) podczas gdy N-końcowy z niż-

szym (K

d

=10

–6

M). Z uwagi na fakt, iż wartości stałej dysocja-

cji mieszczą się w zakresie wewnątrzkomórkowych stężeń

Ca

2+

(10

–7

–10

–6

M), pozwala to CaM szybko reagować na

zmiany stężenia tego jonu. Wyższe powinowactwo regionu

C-końcowego powoduje, że CaM może oddziaływać z nie-

którymi białkami nawet w niskim stężeniu Ca

2+

w komórce

w stanie spoczynku [6,7].

ORGANIZACjA GENóW KODUjąCyCh

KALMODULINę

Prace nad organizacją genomu szczura wykazały, iż

CaM kodowana jest przez trzy niealleliczne geny (calmI, cal-

mII, calmIII), których transkrypcja prowadzi do powstania

ośmiu głównych cząsteczek mRNA, z których każda koduje

identyczne białko (Ryc. 1). Zarówno rejony kodujące, jak i

niekodujące genów wykazują wysoką homologię między-

gatunkową (80–85%), chociaż w przypadku obszarów nie-

kodujących nie występuje znaczące podobieństwo w obrę-

bie gatunku [8]. Sekwencja nukleotydowa rejonu promoto-

rowego sugeruje, iż gen calmIII ma funkcję konstytutywną,

podlegając silnej oraz ciągłej ekspresji, lecz niewykluczona

jest również jego specyficzna regulacja. Z kolei, analiza re-

jonów 5’ oskrzydlających genów calmI oraz calmII wskazuje

na obecność kilku domniemanych elementów regulatoro-

wych, co przypuszczalnie świadczy o kluczowej roli, jaką

odgrywają one w regulacji ekspresji genu kodującego CaM

[9].

Różnorodność powstających mRNA kodujących CaM

związana jest z występowaniem alternatywnych miejsc

poliadenylacji w pierwotnym transkrypcie. Najbardziej

powszechnym sygnałem poliadenylacji na końcu 3’ jest se-

kwencja AAUAAA. Geny calmI oraz calmIII zawierają wiele

takich sekwencji, np. calmI charakteryzuje się obecnością

dwóch sekwencji AAUAAA oraz dwóch AUUAAA. Inte-

resującym jest fakt, iż najmniejszy transkrypt genu calmIII

podlega poliadenylacji za rzadko występującą sekwencją

GAUAAA, co ma miejsce tylko w 1.3% genów człowieka

[9]. Dodatkowy sygnał (AACAAA) zlokalizowany za tym

elementem jest oddzielony od niego dwoma nukleotydami.

Zarówno w przypadku szczura, jak i człowieka geny ko-

dujące CaM wykorzystują te same miejsca poliadenylacji,

co wskazuje na ich ewolucyjnie niezmienną funkcję. Od-

mienna regulacja tych genów ma unikatowe znaczenie w

odpowiedzi na sygnały wymagające zarówno wolnej (np.

podczas wzrostu i różnicowania), jak i szybkiej (np. pod-

czas cyklu komórkowego i przekazywania sygnału) reakcji

komórki [10].

Poszczególne transkrypty wykazują różną lokaliza-

cję tkankową i subkomórkową. U szczura, szczególnie

dużą liczbę transkryptów CaM stwierdza się w neuronach

ośrodkowego układu nerwowego. Warto jednak zaznaczyć,

że udział produktów poszczególnych genów zmienia się

znacznie podczas rozwoju mózgu. We wczesnych fazach

dendrytyczne zasoby mRNA są najbardziej bogate w trans-

krypt 1.4 kpz, jednak z czasem ulegają one znacznemu obni-

żeniu na rzecz produktów genów calmI oraz calmIII [11]. Na

tym etapie przejściowo zwiększa się również poziom trans-

kryptu 4.2 kpz w rejonach apikalnych neuronów. Wykaza-

no też jego specyficzną lokalizację w dendrytach warstwy

zwojowej móżdżku [11]. U osobników dorosłych transkryp-

ty CaM występują znacznie obficiej w rejonach dendrytycz-

nych mózgu, niż w istocie białej, zawierającej głównie ob-

szary aksonalne [12].

W pseudoneuronalnych komórkach PC12 zaobserwowa-

no odmienną ekspresję genów CaM podczas różnicowania.

Traktowanie NGF powodowało ponad 3-krotny wzrost po-

ziomu transkryptu 1.4 kpz w porównaniu do pozostałych

Rycina 1. Transkrypty genów calmI, calmII, calmIII. Wg [9] zmodyfikowany.

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

395

mRNA kodujących CaM [12]. W komórkach tych trans-

krypty calmI oraz calmII zlokalizowane są głównie wzdłuż

wypustek neuronalnych, podczas gdy transkrypty calmIII

pozostają bliżej jądra [13]. Zróżnicowana ekspresja genów

oraz miejsce występowania transkryptów wskazują na ich

zależne od genów kierowanie do poszczególnych obszarów

komórki oraz sugerują, iż kontrola genów CaM zachodzi

w unikalny, zależny również od czynników zewnętrznych

sposób. Ta wielopoziomowa regulacja komórkowych zaso-

bów CaM pozwala na szybką odpowiedź komórki na bo-

dziec fizjologiczny poprzez modulowanie oddziaływania

CaM-białko oraz odwracalne wiązanie CaM do białek ma-

gazynowych, z których istotną rolę pełni GAP-43 (Ryc. 2).

REGULACjA DOSTęPNOśCI CaM

Lokalizacja i stężenie CaM są ważnymi czynnikami re-

gulującymi jej biologiczną aktywność. Obecność w komórce

wielu aktywności katalitycznych, często o przeciwstawnym

kierunku działania, wymaga dokładnej kontroli, jak rów-

nież wzajemnego rozdziału aktywnych efektorów CaM. W

celu utrzymania prawidłowych oddziaływań typu CaM–

białko, komórka może gromadzić CaM w mikrodomenach.

Struktury te powstają w efekcie działania wielu czynników

regulatorowych, wliczając w to sygnały wapniowe, odwra-

calne wiązanie CaM do błon lub innych białek, jej masko-

wanie poprzez np. fosforylację, redystrybucję zasobów po-

między przedziałami komórkowymi oraz syntezę de novo.

Wszystkie te poziomy kontroli umożliwiają regulowanie lo-

kalnej dostępności CaM. Wydaje się to mieć istotne znacze-

nie fizjologiczne, zważywszy na fakt, iż białka wiążące CaM

regulowane są w szerokim zakresie stężeń wolnej CaM.

CaM stanowi około 0,1% wszystkich białek komórko-

wych, a jej stężenie może wahać się w granicach 2–25 µM

w zależności od tkanki i może być nawet większe w komór-

kach przechodzących podziały i różnicujących [10,14]. Tak

więc jej subkomórkowa dystrybucja nie jest równomierna, a

ilość białka może zmieniać się nawet w obrębie tkanki lub

narządu [10]. Fakt ten wynika z istnienia odrębnych frakcji

kalmodulinowych. W komórce CaM może znajdować się we

frakcji rozpuszczalnej, wrażliwej na zmiany stężenia Ca

2+

,

bądź też pozostawać we frakcji nierozpuszczalnej, z której

zostaje uwolniona w wyniku zaburzenia struktury błon ko-

mórkowych. Obecność wrażliwych bądź niewrażliwych na

jony wapnia zasobów sprawia, iż CaM może pozostawać

częściowo związana bądź zamaskowana, co zapobiega nie-

specyficznym oddziaływaniom z innymi białkami, dopóki

odpowiedni sygnał np. zmiana stężenia Ca

2+

nie zainicjuje

jej uwolnienia [10]. Istotnym elementem regulacji jest także

okres półtrwania kalmoduliny, wynoszący 18 ± 2 godz., co

lokuje CaM w grupie krótko żyjących białek [15].

Lokalna dostępność CaM może być regulowana poprzez

jej redystrybucję pomiędzy przedziałami komórkowymi.

Białko to ma zdolność przemieszczania się z frakcji cytopla-

zmatycznej do błonowej lub jądrowej, jak również w kie-

runku odwrotnym. Według modelu McGinnis’a dysocjacja

CaM z błony plazmatycznej do cytosolu zachodzi w odpo-

wiedzi na uwolnienie Ca

2+

z magazynów wewnątrzkomór-

kowych [16]. Ponadto, stosunek ilości CaM związanej z bło-

nami do jej puli cytoplazmatycznej zmienia się w wyniku

stymulacji receptorów przez hormony wzrostu i neuroprze-

kaźniki, co wywołuje uwolnienie CaM do cytoplazmy [17-

20]. Z drugiej strony, zwiększenie asocjacji CaM z błoną pla-

zmatyczną zmniejsza efektywność sygnalizacji zachodzącej

poprzez białka G [21,22]. CaM związana z błoną może dzia-

łać bezpośrednio jako przekaźnik drugiego rzędu, uwal-

niany po aktywacji specyficznych receptorów błonowych.

Redystrybucję CaM do jądra i jej asocjację z białkami ma-

cierzy jądrowej obserwuje się podczas proliferacji komórek

[23,24]. Transport jądrowy zachodzi przypuszczalnie na

drodze dyfuzji ułatwionej, gdyż CaM jest dość małym biał-

kiem i może swobodnie przechodzić przez pory jądrowe,

a dodatkowo nie zawiera sekwencji kierującej ją do specy-

ficznych organelli komórkowych. Tak więc rozmieszczenie

CaM w jądrze i cytoplazmie determinowane jest przez po-

winowactwo, stężenie jak i lokalizację zależnych od CaM

efektorów w obu tych przedziałach komórkowych. Wyka-

zano, iż gwałtowna translokacja CaM do jądra może być

indukowana poprzez zmiany stężenia Ca

2+

, a towarzyszy jej

zwiększona fosforylacja czynnika transkrypcyjnego CREB

[25]. Dyfuzja może być zatem użytecznym i korzystnym

energetycznie sposobem transportu CaM po jej uwolnieniu

z zasobów błonowych, choć służy raczej redystrybucji w

skali bardzo lokalnej.

Odmiennym mechanizmem pozwalającym na prze-

mieszczanie się CaM jest transport kodujących ją mRNA,

Rycina 2. Zależne od Ca

2+

oddziaływanie CaM i GAP-43. W niepobudzonych

neuronach, w których stwierdzono wysoką zawartość GAP-43, większość czą-

steczek CaM występuje w formie niezwiązanej z wapniem i znajduje się przy-

puszczalnie we frakcji błonowej. Nieufosforylowany GAP-43 wiąże CaM przy

niskim stężeniu Ca

2+

w komórce, a oddziaływanie to hamuje fosforylację reszty

Ser

41

przez PKC. Jednakże, gdy PKC zostanie zaktywowana w wystarczającym

stopniu, GAP-43 podlega fosforylacji, co prowadzi do uwolnienia CaM i blokuje

możliwość ponownego związania białka z błoną. Mechanizm ten pozwala białku

GAP-43 pozostawać w stanie aktywnym nawet w przypadku malejącego stężenia

wtórnych przekaźników w komórce.

396

www.postepybiochemii.pl

które podlegają translacji w odległych miejscach komórki.

Jednakże, do chwili obecnej nie ma przekonywującego do-

wodu na to, że poszczególne zasoby CaM uzupełniane są

w wyniku transkrypcji któregoś z genów czy są też raczej

wypadkową ekspresji wszystkich trzech genów kodujących

CaM.

Fosforylacja jest kolejnym mechanizmem maskowania

biologicznej aktywności CaM, bowiem redukuje jej oddzia-

ływania z białkami enzymatycznymi. Wykazano, iż CaM

ulega fosforylacji zarówno przez kinazy serynowo-treoni-

nowe, jak i receptory posiadające aktywność kinaz tyrozy-

nowych. Fosforylacja przez kinazy serynowo-treoninowe

powoduje zwykle spadek powinowactwa wiązania CaM

oraz obniżenie aktywności CaM-zależnych efektorów, na-

tomiast fosforylacja specyficznych reszt tyrozyny wywołuje

efekt przeciwny [26].

DZIAłANIE KALMODULINy

W większości przypadków działanie kalmoduliny zwią-

zane jest z napływem jonów wapnia do cytosolu i rozpoczę-

ciem kaskady sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Kalmo-

dulina jest aktywatorem wielu białek nieenzymatycznych, a

także enzymów o różnorodnych, czasem przeciwstawnych,

aktywnościach, co stanowi wyraz bardzo zorganizowanego

systemu regulującego komórkową homeostazę wapniową

(Tab. 1) [27-30].

Wśród białek ulegających fosforylacji indukowanej przez

CaM znajdują się m. in. czynniki transkrypcyjne, których

zwiększoną aktywność obserwuje się podczas rozwoju

komórek nerwowych. Poprzez oddziaływanie CaM z biał-

kiem p21

cip1

, kluczowym inhibitorem kinaz zależnych od

cyklin, modulowany jest cykl komórkowy, a w odpowiedzi

na niektóre czynniki zewnątrzkomórkowe następuje jego

zatrzymanie w fazie G1 [31]. Ponadto, CaM uczestniczy

w przebudowie cytoszkieletu, wiążąc się z α-spektryną,

kaldesmonem oraz białkami stabilizującymi mikrotubule:

MAP 2 oraz Tau. Białka związane z błoną plazmatyczną:

neuromodulina i neurogranina, istotne dla prawidłowego

przebiegu funkcji neuronalnych, oddziałują z CaM przy ni-

skim stężeniu Ca

2+

, a oddziaływanie to wydaje się hamo-

wać ich fosforylację [32]. Warto podkreślić udział CaM w

wygaszaniu sygnału wapniowego, bezpośrednio poprzez

aktywację Ca

2+

-ATPazy oraz pośrednio endo/sarkopla-

zmatycznych pomp SERCA. Odrębną grupą białek regulo-

wanych przez CaM są kanały wapniowe oraz kilka rodzin

receptorów [1,33]

WPłyW KALMODULINy NA DZIAłANIE

POMP WAPNIOWyCh

Jednym z najlepiej poznanych mechanizmów autoregu-

lacji sygnału wapniowego jest oddziaływanie kompleksu

Ca

2+

/CaM z PMCA. W stanie spoczynku, CaM wykazuje

obniżone powinowactwo do PMCA, lecz gdy stężenie Ca

2+

wzrasta powyżej 100 nM, kompleks Ca

2+

/CaM wiąże się do

C-końcowej domeny autoinhibitorowej intensyfikując szyb-

kość pracy pompy [34]. PMCA jest ponadto jedyną ATPazą

typu P bezpośrednio stymulowaną przez ten kompleks [34].

Poszczególne izoformy enzymu wykazują odmienne powi-

nowactwo do CaM. Występujące powszechnie PMCA1 i

PMCA4 charakteryzują się niskim powinowactwem, nato-

miast PMCA2 i PMCA3 obecne w komórkach pobudliwych

cechują się wysoką wrażliwością na stymulację CaM [34].

Dodatkowe różnice w oddziaływaniu Ca

2+

/CaM z PMCA

występują w obrębie poszczególnych wariantów enzymu

powstających w wyniku alternatywnego składania. Dla

przykładu PMCA2b wykazuje najwyższe powinowactwo

(K

D

~

2 nM), następnie PMCA2a oraz PMCA4b (K

D

~

5–10

nM), natomiast najniższe PMCA4a (K

D

~

50 nM) [35]. Z uwa-

gi na fakt, że wartości powinowactwa izoform i wariantów

PMCA mieszczą się w obszarze stężeń znacznie poniżej za-

wartości białka kalmoduliny w komórce przypuszcza się, że

może ona zachowywać się jak pseudopodjednostka PMCA

[36].

W mięśniu sercowym oraz mięśniach gładkich aktyw-

ność pompy SERCA może być regulowana w wyniku bez-

pośredniej fosforylacji przez kinazy zależne od CaM [37].

Bardziej powszechnym mechanizmem jest jednak fosfory-

lacja pomocniczego białka, fosfolambanu, unikalnego akty-

watora pompy sarko/endoplazmatycznej [38]. Fosforylacja

tego białka, znosi jego efekt inhibitorowy względem SER-

CA, co pozwala na intensyfikację transportu jonów wapnia

do wnętrza siateczki śród-

plazmatycznej.

UDZIAł

KALMODULINy

W REGULACjI

KANAłóW VGCC

Kanały wapniowe za-

leżne od potencjału błony

znane są od roku 1953. Ze

względu na swoje farma-

kologiczne i biofizyczne

właściwości zostały przy-

porządkowane do po-

szczególnych typów. W

zależności od wartości po-

tencjału wymaganego do

aktywacji, przewodnic-

Tabela 1. Białka regulowane przez Ca

2+

/CaM.

Enzymy

Białka nieenzymatyczne

fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów (np. rodzina PDE1) tubulina

cyklazy adenylanowe (AC1 i AC8)

troponina I

ATPazy wapniowe (pompy wapniowe)

spektryna, fodryna, kaldesmon, cytosynalina

kinaza lekkich łańcuchów miozyny

Neuromodulina i neurogranina

kinaza fosforylazy glikogenowej

Tau

kalcyneuryna

białko związane z mikrotubulami (MAP2)

syntaza tlenku azotu

białko regulujące sygnalizację CaM (RCS)

kinazy białkowe zależne od Ca

2+

i CaM (I, II, IV)

kanały wapniowe

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

397

twa i czasu pobudzenia wyróżniamy kanały typu T, L, N,

P/Q oraz R [39]. Udział kalmoduliny w regulacji zależnych

od potencjału kanałów wapniowych najlepiej poznano na

przykładzie kanałów typu L, P/Q oraz T.

Kanały typu L charakteryzują się długim czasem aktywa-

cji. Występują w mięśniach szkieletowych, mięśniu serco-

wym, neuronach oraz komórkach wydzielania dokrewnego

[39]. Kalmodulina bierze udział w wielu szlakach regulacji

aktywności tych kanałów. Jednym z nich jest szlak aktywa-

cji kanałów przez kinazę białkową A (PKA). PKA, aktywo-

wana przez wtórny przekaźnik cAMP, katalizuje fosforyla-

cję białka kanału, co w efekcie zwiększa czas jego otwarcia.

Interesującą zależnością jest fakt, że synteza cAMP zachodzi

przy udziale cyklaz adenylanowych, których co najmniej

trzy, z dziewięciu zidentyfikowanych izoform, są zależne

od Ca

2+

/CaM. Działanie cAMP ulega zatrzymaniu przez

fosfodiesterazy (PDE), enzymy degradujące ten nukleotyd;

również ten proces podlega regulacji przez kalmoduli-

nę. Fosfodiesterazy z rodziny PDE1 są aktywowane przez

kompleks Ca

2+

/CaM, czego skutkiem jest blokowanie zależ-

nej od PKA aktywacji kanałów [38]. Jest to jeden z bardziej

precyzyjnych mechanizmów zapewniających kontrolę nad

napływem jonów wapniowych do komórki i ochronę przed

przekroczeniem ich wewnątrzkomórkowego stężenia po-

nad wartości fizjologiczne.

Inny sposób hamowania aktywności kanałów typu L po-

znano na przykładzie kanału Ca

v

1.2. Jego główne miejsce

regulatorowe jest zlokalizowane w regionie C-końcowym

podjednostki α (tworzącej por kanału), z którym wiąże się

kompleks wapń-kalmodulina. Przyłączenie wolnej kalmo-

duliny do miejsca w regionie N-końcowym powoduje do-

datkowe, nieznaczne zahamowanie jego aktywności [40].

Rola końca N w regulacji kanału Ca

v

1.2 pozostaje jednak

niejasna. Wykazano, że jego mutacja może nieznacznie osła-

biać zależne od wapnia zahamowanie aktywności kanału,

lecz jednocześnie wzmacniać efekt hamowania zależny od

napięcia [41]. W przypadku kanału Ca

v

1.2 występuje po-

nadto możliwość jego nieznacznej aktywacji, w której bierze

udział kalmodulina. Efekt ten jest trudny do wykrycia, ze

względu na maskowanie przez zahamowanie aktywności

zależne od wapnia. W kardiomiocytach i w komórkach mię-

śni gładkich słaba, zależna od CaM aktywacja Ca

v

1.2 może

być zmniejszana przez specyficzne inhibitory CaM-kinazy

II, jak np. KN39, co wskazuje na jej udział w tym mechani-

zmie [40].

W regulacji kanału Ca

v

1.2 przy udziale CaMKII fosfo-

rylowana jest podjednostka α. Ustalono, że fosforylacja

Ser

1512

i Ser

1570

podjednostki α ma zasadnicze znaczenie dla

tej drogi aktywacyjnej. Proces może być odwrócony za po-

średnictwem kalcyneuryny, a ponadto jest trwale zablo-

kowany w przypadku mutacji Ser

1512

. Obie wspomniane

reszty serynowe oskrzydlają sekwencję EF-hand, znajdują-

cą się pomiędzy ostatnią domeną transbłonową a domeną

wiążącą kalmodulinę. Motyw ten pośredniczy w zależnej

od wapnia inaktywacji kanału Ca

v

1.2, wyzwalanej przez

tworzenie kompleksu Ca

2+

/CaM i wiązaniu go w rejonie C-

-końcowym podjednostki α. Ważną rolę w aktywacji kanału

za pośrednictwem CaMKII odgrywa również podjednostka

β, której przynajmniej jedna izoforma jest fosforylowana

in vitro w pozycji Thr

498

[40]. Najnowsze badania nad rolą

CaM-kinazy II w komórkach mięśnia sercowego wykazały

interesujący mechanizm hamowania syntezy kanału Ca

v

1.2.

CaMKII aktywuje bowiem wiązanie elementu regulatoro-

wego DRE z czynnikiem transkrypcyjnym DREAM, który

wycisza ekspresję genów kanałów typu L [42]. Autorzy ba-

dań wnioskują, że kaskada Ca

2+

/CaMKII-DREAM stanowi

mechanizm sprzężenia zwrotnego, umożliwiający komór-

kom regulowanie intensywności napływu Ca

2+

do ich we-

wnątrzkomórkowego stężenia wykrytego przez CaMKII.

Można więc mówić o podwójnej roli CaM-kinazy II, która

aktywując kanały typu L poprzez fosforylację, jednocześnie

wpływa na obniżenie ich wytwarzania [42].

Kanały typu P/Q pełnią rolę w regulacji uwalniania

pęcherzyków wydzielniczych w synapsach i w szcze-

gólnie dużej ilości występują w móżdżku, korze mózgu

i hipokampie ssaków [43,44]. Aktywowane są przez

kilka następujących po sobie krótkich depolaryzacji, zaś

w aktywacji podtypu Ca

v

2.1 pośredniczy kalmodulina.

Zależna od Ca

2+

inaktywacja Ca

v

2.1 wymaga dwóch se-

kwencji EF-hand w domenie N-końcowej kalmoduliny,

natomiast w jego aktywacji uczestniczą dwie EF-hands

C-końcowe lub wszystkie cztery [40]. W przypadku ka-

nałów Ca

v

2.1 widać wyraźnie, w jaki sposób jony wap-

nia wpływają zarówno na aktywację, jak i na hamowanie

kanału. W oba typy regulacji zaangażowana jest kalmo-

dulina, która ma zdolność wiązania się z dwoma miejsca-

mi w C-końcowym odcinku podjednostki α kanału: tzw.

domeną wiążącą kalmodulinę (CBD, ang. calmodulin bin-

ding domain) i domeną typu IQ, której nazwa odnosi się

do dwóch pierwszych aminokwasów wchodzących w jej

skład — izoleucyny (I) oraz glutaminy (Q). Wykazano, że

delecja domeny CBD całkowicie blokuje możliwość akty-

wacji oraz hamowania kanału [45].

Dalsze badania poświęcone wyjaśnieniu roli, jaką w re-

gulacji kanałów Ca

v

2.1 pełnią domeny EF-hand wykazały,

że motywy znajdujące się w końcu C kalmoduliny okazały

się kluczowe dla aktywacji zależnej od Ca

2+

. Zaproponowa-

no, że aktywacja, za którą odpowiada rejon C-końcowy jest

prawdopodobnie skuteczniejsza podczas szybkiego, lokal-

nego napływu Ca

2+

. Zgodnie z tą teorią mniej gwałtowny,

globalny napływ Ca

2+

do komórki powoduje jego wiązanie

do motywów końca N, wywołując zamykanie kanałów i

chroniąc przed wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia

Ca

2+

do wartości toksycznych. Obecnie coraz więcej danych

potwierdza powyższe przypuszczenia [46].

Kanał wapniowy Cav2.1 jest uważany za szczególnie

ważny w inicjacji transmisji synaptycznej. Przypuszcza

się, że jego dynamiczna regulacja zależna od Ca

2+

, przy

udziale mającej „podwójne” działanie kalmoduliny,

może wpływać na przesyłanie informacji w neuronach

poprzez formowanie krótkotrwałej plastyczności synap-

tycznej [47]. Interesującym aspektem regulacji kanałów

Ca

v

2.1 jest udział w niej kinazy CaMKII, kluczowego re-

gulatora odpowiedzi synaptycznych w gęstości postsy-

naptycznej. Rola tego mechanizmu jest prawdopodobnie

istotna w presynaptycznych zakończeniach neuronów,

gdzie kanały typu P/Q inicjują wydzielanie neuroprze-

kaźników [48].

398

www.postepybiochemii.pl

W kanałach wapniowych typu T (Ca

v

3), bramkowanych

przez niewielkie depolaryzacje, nie występuje mechanizm

regulacji bezpośrednio zależny od kalmoduliny [46]. Na

przykładzie kanałów Ca

v

3.2 wykazano jednak wpływ CaM-

KII, która katalizując fosforylację reszty Ser

1198

, zwiększa ak-

tywność kanałów poprzez przesunięcie potencjału aktywa-

cji w stronę hiperpolaryzacji. Co ciekawe, mechanizm ten

nie występuje w kanałach Ca

v

3.1, ze względu na brak reszty

seryny w tej pozycji [40,49].

ODDZIAłyWANIE KALMODULINy

Z RECEPTOREM NMDA

Receptor NMDA jest receptorem zależnym zarówno od

potencjału błonowego jak i od ligandów, którymi są gluta-

minian, asparaginian i glicyna. Jest to niespecyficzny kanał

jonowy transportujący oprócz jonów wapniowych także

jony sodowe i potasowe. Jest heterotetra- lub heteropen-

tamerem zbudowanym z jednej lub dwóch podjednostek

NR1, dwóch lub trzech podjednostek NR2 (GluN) oraz cza-

sami jednej podjednostki NR3. Podjednostki NR2 występu-

ją w czterech izoformach NR2A-D. Receptor ten szczególną

rolę odgrywa w hipokampie, zwłaszcza w neuronach gluta-

minergicznych, gdzie uczestniczy w tworzeniu LTP, a tym

samym w procesach uczenia się i zapamiętywania. Napływ

jonów wapniowych przez receptor NMDA odgrywa także

znaczącą rolę w uszkodzeniach wywołanych niedotlenie-

niem.

Kalmodulina wpływa na aktywność tego kanału głów-

nie poprzez aktywację kinazy CaMKII, która następnie ule-

ga przemieszczeniu i związaniu z podjednostką receptora

NMDA [50]. Ustalono, że tylko izoforma α CaMKII oddzia-

łuje z receptorem NMDA. Może się ona wiązać ze wszystki-

mi rodzajami podjednostek receptora. Najsilniej wiąże się z

podjednostką NR2B, słabiej z podjednostkami NR1 i NR2A

[50].

Wcześniejsza aktywacja kinazy przez kompleks Ca

2+

/

CaM jest etapem niezbędnym do wiązania z podjednost-

ką NR2B (znaną również pod nazwą GluN2B). Kolejnym

etapem jest autofosforylacja CaMKII (reszta Thr

286

), która

nie jest konieczna, ale w efekcie prowadzi do silniejszego

wiązania CaMKII z receptorem NMDA, jednocześnie unie-

zależniając to wiązanie od obecności Ca

2+

/CaM [50-54].

Autofosforylacja Thr

305/306

lub fosforylacja Ser

1416

przez PKC

hamuje wiązanie kinazy z receptorem [55]. Zaobserwowa-

no także, że indukowane kompleksem Ca

2+

/CaM wiązanie

CaMKII z NR2B było silniejsze w obecności ADP niż ATP

(AMP nie ma wpływu na to oddziaływanie) [56].

Autofosforylacja CaMKII wymagana jest również pod-

czas przyłączania kinazy do podjednostki NR1. Autofosfo-

rylacja reszty Thr

286

kinazy obniża tempo uwalniania CaM-

KII z podjednostki NR1 [57]. Autofosforylacja kinazy (reszty

Thr

305/306

) jest pobudzana podczas powrotu jonów wapnio-

wych do poziomu podstawowego, a kalmodulina odłącza-

na jest od ufosforylowanej na reszcie Thr

286

CaMKII. Reakcja

ta hamuje wiązanie enzymu z CaM oraz znacznie obniża

powinowactwo kinazy do podjednostek NR1, NR2B/P i

NR2B/C. Stwierdzono także, że sam kompleks Ca

2+

/CaM

może bezpośrednio oddziaływać z NR1, prawdopodob-

nie w tym samym miejscu, w którym wiąże się z CaMKII.

Przypuszcza się, że CaMKII i kompleks Ca

2+

/CaM współza-

wodniczą o NR1 lub oddziałują jednocześnie. Mechanizm i

rola takiego współzawodnictwa nie są jeszcze wyjaśnione

i wymagają dalszych badań. Zaobserwowano także dodat-

kowy mechanizm regulujący działanie NR1 polegający na

modulowaniu przez kalmodulinę oddziaływań pomiędzy

α-aktyniną i receptorem NMDA, obniżając tym samym ak-

tywność receptora [57,58]. Nie tylko kalmodulina, ale także

CaMKII współzawodniczy z α-aktyniną o wiązanie z NR1

[59]. Badania wskazują, że CaMKII w powiązaniu z CaM

prowadzi do usunięcia α-aktyniny z podjednostki receptora

[50].

Opisana różnorodność modyfikacji regulujących oddzia-

ływanie CaMKII i samej kalmoduliny z podjednostkami

receptora NMDA oraz odmienność wywoływanych tymi

modyfikacjami efektów świadczy o istnieniu bardzo pre-

cyzyjnych mechanizmów regulujących tak istotne procesy

jak LTP, uczenie się i zapamiętywanie. W doświadczeniach

wykonanych na myszach zaobserwowano, że zaburzenia

w oddziaływaniu pomiędzy CaMKII i NR2B hamują fos-

forylację reszty Thr

286

αCaMKII, obniżając w konsekwencji

fosforylację ważnego substratu CaMKII, jakim jest receptor

AMPA i powstawanie LTP w hipokampie [60].

Kalmodulina reguluje działanie receptora NMDA nie

tylko bezpośrednio i przez aktywację kinazy CaMKII, lecz

także przez aktywowanie kinazy CaMKIV. CaMKIV uczest-

niczy w hamowaniu alternatywnego składania eksonów

podjednostki NR1 receptora NMDA. Podjednostka NR1 ko-

dowana jest przez jeden gen, natomiast warianty powstają

w wyniku alternatywnego składania trzech eksonów — 5,

21 i 22. Regulacja tego procesu ma istotne znaczenie dla

szybkości przemieszczania się podjednostki NR1 z siateczki

śródplazmatycznej do błony, fosforylacji zależnej od kinaz

C i A, oddziaływania z neurofilamentem L oraz wiązania

z kalmoduliną. W eksonie piątym znajduje się sekwencja

nukleotydowa kodująca fragment zewnątrzkomórkowy

na końcu aminowym, odpowiedzialny za farmakologiczne

właściwości receptora. Wykazano, że alternatywne składa-

nie eksonów 5 i 21 jest zahamowane w obecności aktyw-

nej formy CaMKIV. Odpowiedzialne za oddziaływanie z

CaMKIV są dwa motywy RNA: podobny do intronowego

fragment CaRRE (ang. CaMKIV-responsive RNA element) i

niedawno odkryty eksonowy motyw CaRRE2 [61].

KALMODULINA A RECEPTORy ZLOKALIZOWANE

W SIATECZCE śRóDPLAZMATyCZNEj

Kalmodulina odgrywa także ważną rolę w kontrolowa-

niu funkcji wewnątrzkomórkowych magazynów Ca

2+

, po-

przez regulację dwóch typów receptorów znajdujących się

w siateczce endo/sarkoplazmatycznej (ER/SR) — recepto-

rów rianodynowych (RyR) oraz receptorów IP

3

.

Receptory rianodynowe, występujące w postaci trzech

tetramerycznych izoform odpowiadają za przepływ Ca

2+

z ER/SR do cytoplazmy. Mają jedno miejsce wiązania dla

kalmoduliny, zarówno zawiązanej z wapniem (Ca

2+

/CaM)

jaki i wolnej (apoM). RyR mogą być regulowane również

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

399

poprzez fosforylację, w tym przez CaMKII [62,63]. RyR1

występuje głównie w mięśniach szkieletowych i jest nie-

zbędny do rozpoczęcia skurczu, uwalniając jony wapnia z

SR [64]. Badania in vitro pokazały, że przyłączenie apoCaM

aktywuje receptor i dochodzi do uwolnienia jonów wapnia,

natomiast Ca

2+

/CaM jest inhibitorem tego receptora. Tak

samo regulowany jest RyR3 występujący w wielu różnych

komórkach. Nie dominuje on jednak w żadnej tkance tak,

jak dwie pozostałe izoformy [62].

RyR2 obecny jest przede wszystkim w komórkach mię-

śnia sercowego, gdzie bierze udział w przemianie impulsu

elektrycznego na reakcję mechaniczną [65]. Przyłączenie

apoCaM do receptora powoduje zamknięcie kanału i taki

mechanizm jest niezbędny do prawidłowego funkcjono-

wania serca. Mutacje w domenie odpowiedzialnej za przy-

łączenie kalmoduliny zaburzają działanie receptora, zaś

ciągłe uwalnianie jonów wapniowych z siateczki endo/

sarkoplazmatycznej przyczynia się do licznych chorób ser-

ca [66]. Również wiązanie przez receptor kompleksu Ca

2+

/

CaM blokuje jego działanie. RyR2 ma trzy miejsca fosfory-

lacji (reszty seryny), z których tylko dwa podlegają działa-

niu CaMKII [67]. Fosforylacja receptora hamuje uwalnianie

Ca

2+

. Jednakże przy nieprawidłowym funkcjonowaniu mię-

śnia sercowego (np. migotanie przedsionków), RyR2 ufos-

forylowany przez CaMKII zwiększa wypływ jonów wapnia

z SR [68,69].

Receptor IP

3

(IP

3

R) obecny w błonie siateczki śródpla-

zmatycznej prawie wszystkich komórek występuje w trzech

izoformach IP

3

R1-3 wykazujących 65-85% homologii. Jest

to homo- lub heterotetramer tworzący kanał dla Ca

2+

[70].

Głównym ligandem receptora jest inozytolo-1,4,5-trisfos-

foran powstający w wyniku działania fosfolipazy C (PLC),

aktywowanej czynnikami zewnątrzkomórkowymi takimi

jak: hormony, czynniki wzrostu, neuroprzekaźniki i światło

[70]. Oprócz domeny wiążącej IP

3

, receptor zawiera kilka

regionów odpowiedzialnych za regulację jego aktywności

przez wiązanie Ca

2+

, CaM, ATP lub fosforylację przy udzia-

le kinaz: PKA, PKC, CaMKII i kinazy tyrozynowej. Aktyw-

ność IP

3

R zależy od stężenia jonów wapnia; niskie stężenie

aktywuje kanał przez bezpośrednie wiązanie Ca

2+

, nato-

miast wysokie stężenie hamuje jego aktywność [71]. Istnieją

przynajmniej dwa miejsca specyficznego wiązania kalmo-

duliny w każdej podjednostce IP

3

R [72]. Możliwe jest wią-

zanie zarówno kompleksu Ca

2+

/CaM jak i samej apokalmo-

duliny [73,74]. Wiązanie kalmoduliny z receptorem może

być zależne (IP

3

R1 i IP

3

R2) lub niezależne od obecności

jonów wapnia (IP

3

R3) [71]. Scharakteryzowano także miej-

sce niezależnego od wapnia wiązania kalmoduliny w IP

3

R1

znajdujące się w końcu N-aminokwasowym podjednostek

receptora [75]. CaM hamuje aktywność receptora IP

3

, przez

blokowanie wiązania inozytolo-1,4,5-trisfosforanu, proces

ten intensywniej zachodzi przy wyższych, mikromolowych

stężeniach wapnia [71]. Z drugiej strony wykazano, że usu-

nięcie endogennie związanej z receptorem kalmoduliny

powoduje całkowitą utratę aktywności IP

3

R [71]. Badania

potwierdziły, że wpływ kalmoduliny na wiązanie IP

3

jest

zależny od typu receptora [76].

Pośredni wpływ kalmoduliny na transport Ca

2+

przez

IP

3

R polega na aktywowaniu kinaz białkowych fosforylu-

jących receptor. Zależna od CaMKII fosforylacja podtypów

IP

3

R1 oraz IP

3

R2 prowadzi do znacznego obniżenia aktyw-

ności receptora, wskazując na zależną od Ca

2+

negatywną

regulację [70,77,78].

KALMODULINA A RECEPTORy TRP

Kolejną grupa białek, z którymi oddziałuje CaM są ka-

nały TRP (ang. transient receptor potential) [79]. Kanały TRP

tworzą zróżnicowaną rodzinę około 30 białek, obecnych w

wielu rodzajach komórek. Wyróżnia się 7 podrodzin: TRPC

(ang. cannonical), TRPV (ang. vaniloid), TRPM (ang. melasta-

tin), TRPML (ang. mucolipin), TRPP (ang. polycystic), TRPA

(ang. ankyrin) i TRPN [80]. Odgrywają one rolę w regulacji

fototransdukcji, osmoregulacji, przekaźnictwie bodźców

bólowych, termoregulacji, utrzymywaniu wewnątrzko-

mórkowego stężenia jonów wapnia, regulacji cyklu komór-

kowego i wydłużaniu aksonalnych stożków wzrostu. Ich

struktura — sześć transbłonowych domen, cytoplazma-

tyczne końce C i N oraz region porowy zalicza je do grupy

kanałów jonowych zależnych od potencjału i cyklicznych

nukleotydów [81].

TRPC tworzy kanał przepuszczalny dla Ca

2+

związany

z receptorem RACCs. Wiązanie to prowadzi do aktywacji

fosfolipazy C i hydrolizy PIP

2

do IP

3

i diacyloglicerolu. IP

3

aktywuje kanały SOCs (ang. store-operated channels) powo-

dując wypływ jonów wapnia z siateczki śródplazmatycznej.

Kanały TRPV odgrywają rolę czujników temperatury, wraż-

liwych na wysoką temperaturę i pH. W przeciwieństwie do

nich podrodzina TRPM (biorąca nazwę od melastatyny,

markera przerzutów czerniaka), odpowiada na niskie tem-

peratury i mentol. Kanały TRP służą więc jako sensory róż-

nych czynników środowiskowych [82].

Funkcjonalnie kanały TRP charakteryzuje się jako nie-

selektywne kanały kationowe. Choć wykazują one dużą

różnorodność w przepuszczalności dla jonów, większość z

nich jest bardziej selektywna dla Ca

2+

. Dlatego też mogą być

postrzegane jako kanały wapniowe, gdzie napływ Ca

2+

re-

prezentuje jedną z ich wspólnych ról fizjologicznych. W tym

przypadku najważniejsze w utrzymaniu homeostazy wap-

niowej jest ujemne sprzężenie zwrotne, wspomagane przez

kinazy, fosfatazy, fosfolipazy i kalmodulinę. Uznaje się, że

bezpośrednie związanie Ca

2+

/CaM z cytoplazmatycznymi

końcami kanału TRP powoduje spadek wrażliwości recep-

tora [79,83]. Ten sam mechanizm występuje w różnych ka-

nałach z podrodzin TRPC, TRPV i TRPM. Miejsce wiąza-

nia kalmoduliny w rejonie C-końcowym zaproponowano

dla kanałów TRPC1-7, TRPCM4, TRPCV1, TRPCV4-6, a w

rejonie N-końcowym dla TRPM2 i TRPV1 [83]. Niektóre z

tych miejsc wiążą fosfatydyloinozytol (PIP), fofatydylo-

inozytolo-4,5-bisfosforan (PIP

2

) oraz fosfatydyloinozytolo-

-3,4,5-trisfosforan (PIP

3

). W warunkach fizjologicznych PIP

jest ujemnie naładowany, co pozwala na elektrostatyczne

oddziaływanie z resztami aminokwasów o dodatnim ła-

dunku. Domeny wiążące CaM często zawierają takie reszty.

W kanałach TRPC6 w rejonie C-końcowym odkryto rejony

wiążące zarówno CaM i PIP

2

, a w TRPV1 przy przyłącza-

niu CaM do miejsca w rejonie C-końcowym, ma swój udział

fosfatydyloinozytol, przy czym CaM i PIP

2

wiążą się z za-

chodzącymi na siebie, ale nie identycznymi miejscami [82].

400

www.postepybiochemii.pl

W podrodzinie TRPC znajduje się przypuszczalnie od

jednego do czterech miejsc wiążących kalmodulinę. Jedno

z nich jest nazywane „CaM-IP

3

receptor binding” lub CRIB i

występuje u wszystkich przedstawicieli TRPC. CaM może

działać na te kanały stymulująco, jak i hamująco. Zgodnie z

hipotezą sformułowaną dla TRPV4, ale być może prawdzi-

wa także dla innych białek przepuszczalnych dla wapnia.

w stanie spoczynku koniec N receptora tworzy autoinhi-

bitorowy kompleks z końcem C, który zawiera też miejsce

wiązania CaM. Na skutek zwiększenia wewnątrzkomórko-

wego stężenia Ca

2+

, następuje rozpad kompleksu utworzo-

nego przez oba końce i przyłączenie kalmoduliny [84,85].

Takie dane sugerują, że kalmodulina odgrywa ważną rolę

w kontrolowaniu kanałów TRP, jednak intensywność i spo-

sób działania jest różna dla poszczególnych podrodzin.

CaM została odkryta praktycznie jednocześnie w dwóch

laboratoriach w 1970 r przez zespoły Shiro Kakiuchi i Wai

Yiu Cheung [86,87] jako aktywator fosfodiesterazy cAMP.

Dalsze, lawinowo pojawiające się prace wykazały, że to

niewielkie białko ma wyjątkowe znaczenie dla homeosta-

zy wapniowej wszystkich typów komórek, co znakomicie

odzwierciedla jego nazwa wprowadzona w 1979 r. — cal-

modulin czyli Calcium modulated protein. Do dziś jednak

niewiadomo, dlaczego u szczura trzy geny kodują osiem

głównych transkryptów, a każdy z nich koduje identyczne

białko.

PIśMIENNICTWO

1. Burgoyne RD (2001) The neuronal calcium sensor family of Ca

2+

-bin-

ding proteins. Biochem J 353: 1-12

2. Haynes LP, McCue HV, Burgoyne RD (2012) Evolution and functional

diversity of the calcium binding proteins (CaBPs). Front Mol Neurosci

5: 9

3. Raghuram V, Sharma Y, Kreutz MR (2012) Ca

2+

sensor proteins in den-

dritic spines: a race for Ca

2+

. Front Mol Neurosci 5: 61

4. Bähler M, Rhoads A (2002) Calmodulin signaling via the IQ motif.

FEBS Lett 513: 107-113

5. Grabarek Z (2006) Structural basis for diversity of the EF-hand cal-

cium-binding proteins. J Mol Biol 359: 509-525

6. Valeyev NV, Bates DG, Heslop-Harrison P, Postlethwaite I, Kotov NV

(2008) Elucidating the mechanisms of cooperative calcium-calmodulin

interactions: a structural systems biology approach. BMC Syst Biol 2:

48

7. Shifman JM, Mayo SL (2002) Modulating calmodulin binding speci-

ficity through computational protein design. J Mol Biol 323: 417-423

8. Kortvely E, Gulya K (2004) Calmodulin, and various ways to regulate

its activity. Life Sci 74: 1065-1070

9. Palfi A, Kortvely E, Fekete E, Kovacs B, Varszegi S, Gulya K (2002)

Differential calmodulin gene expression in the rodent brain. Life Sci

70: 2829-2855

10. Toutenhoofd SL, Strehler EE (2000) The calmodulin multigene family

as a unique case of genetic redundancy: multiple levels of regulation

to provide spatial and temporal control of calmodulin pools? Cell Cal-

cium 28: 83-96

11. Kortvely E, Palfi A, Bakota L, Gulya K (2002) Ontogeny of calmodulin

gene expression in rat brain. Neuroscience 114: 301-316

12. Kortvely E, Varszegi S, Palfi A, Gulya K (2003) Intracellular targeting

of calmodulin mRNAs in primary hippocampal cells. J Histochem Cy-

tochem 51: 541-544

13. Bai G, Weiss B (1991) The increase of calmodulin in PC12 cells induced

by NGF is caused by differential expression of multiple mRNAs for

calmodulin. J Cell Physiol 149: 414-421

14. Wu X, Bers DM (2007) Free and bound intracellular calmodulin me-

asurements in cardiac myocytes. Cell Calcium 41: 353-364

15. Ferrington DA, Chen X, Krainev AG, Michaelis EK, Bigelow DJ (1977)

Protein half-lives of calmodulin and the plasma membrane Ca-ATPa-

se in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 237: 163-165

16. McGinnis KM, Shariat-Madar Z, Gnegy ME (1998) Cytosolic calmodu-

lin is increased in SK-N-SH human neuroblastoma cells due to release

of calcium from intracellular stores. J Neurochem 70: 139-146

17. Roberson MS, Bliss SP, Xie J, Navratil AM, Farmerie TA, Wolfe MW,

Clay CM (2005) Gonadotropin-releasing hormone induction of extra-

cellular-signal regulated kinase is blocked by inhibition of calmodulin.

Mol Endocrinol 19: 2412-2423

18. Ye XF, Lu Y, Zhang P, Liang JH (2004) Calmodulin inhibitor trifluo-

perazine attenuates the development and expression of morphine-

induced conditioned place preference in rats. Eur J Pharmacol 486:

265-271

19. Olson JE, Li GZ, Wang L, Lu L (2004) Volume-regulated anion conduc-

tance in cultured rat cerebral astrocytes requires calmodulin activity.

Glia 46: 391-401

20. Mangels LA, Gnegy ME (1990) Muscarinic receptor-mediated trans-

location of calmodulin in SK-N-SH human neuroblastoma cells. Mol

Pharmacol 37: 820-826

21. Ferré S, Woods AS, Navarro G, Aymerich M, Lluís C, Franco R (2010)

Calcium-mediated modulation of the quaternary structure and func-

tion of adenosine A2A-dopamine D2 receptor heteromers. Curr Opin

Pharmacol 10: 67-72

22. Ritter SL, Hall RA (2009) Fine-tuning of GPCR activity by receptor-

interacting proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 819-830

23. Mermelstein PG, Deisseroth K, Dasgupta N, Isaksen AL, Tsien RW

(2001) Calmodulin priming: nuclear translocation of a calmodulin

complex and the memory of prior neuronal activity. Proc Natl Acad

Sci USA 98: 15342-15347

24. Kahl CR, Means AR (2003) Regulation of cell cycle crogression by cal-

cium/calmodulin-dependent pathways. Endocr Rev 24: 719-736

25. Zhang J, Sutachan JJ, Montoya-Gacharna J, Xu CF, Xu F, Neubert TA,

Recio-Pinto E, Blanck TJ (2009) Isoflurane inhibits cyclic adenosine

monophosphate response element-binding protein phosphorylation

and calmodulin translocation to the nucleus of SH-SY5Y cells. Anesth

Analg 109: 1127-1134

26. Benaim G, Villalobo A (2002) Phosphorylation of calmodulin. Functio-

nal implications. Eur J Biochem 269: 3619-3631

27. Sharma RK, Das SB, Lakshmikuttyamma A, Selvakumar P, Shrivastav

A (2006) Regulation of calmodulin-stimulated cyclic nucleotide phos-

phodiesterase (PDE1): review. Int J Mol Med 18: 95-105

28. Xiao H, Zhou H, Chen G, Liu S, Li G (2007) Interaction between in-

ducible nitric oxide synthase and calmodulin in Ca

2+

-free and -bound

forms. J Proteome Res 6: 1426-1429

29. Swulius MT, Waxham MN (2008) Ca

2+

/calmodulin-dependent pro-

tein kinases. Cell Mol Life Sci 65: 2637-2657

30. Sindreu CB, Storm DR (2008) How I learned to stop worrying and love

calcineurin. Nat Neurosci 11: 527-528

31. Rodríguez-Vilarrupla A, Jaumot M, Abella N, Canela N, Brun S, Díaz

C, Estanyol JM, Bachs O, Agell N (2005) Binding of calmodulin to the

carboxy-terminal region of p21 induces nuclear accumulation via in-

hibition of protein kinase C-mediated phosphorylation of Ser153. Mol

Cell Biol 25: 7364-7374

32. Díez-Guerra FJ (2010) Neurogranin, a link between calcium/calmodu-

lin and protein kinase C signaling in synaptic plasticity. IUBMB Life

62: 597-606

33. Haiech J, Audran E, Feve M, Ranjeva R, Kilhoffer M-C (2011) Revisit-

ing intracellular calcium signaling semantics. Biochimie 93: 2029-2037

34. Brini M, Carafoli E (2009) Calcium pumps in health and disease. Phy-

siol Rev 89: 1341-1378

35. Strehler EE, Treiman M (2004) Calcium pumps of plasma membrane

and cell interior. Curr Mol Med 4: 323-335

Postępy Biochemii 58 (4) 2012

401

36. Strehler EE, Zacharias DA (2001) Role of Alternative Splicing in Gen-

erating Isoform Diversity Among Plasma Membrane Calcium Pumps.

Physiol Rev 81: 21-50

37. Grover AK, Xu A, Samson SE, Narayanan N (1996) Sarcoplasmic re-

ticulum Ca

2+

pump in pig coronary artery smooth muscle is regulated

by a novel pathway. Am J Physiol 271: 181-187

38. MacLennan DH, Kranias EG (2003) Phospholamban: a crucial regula-

tor of cardiac contractility. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 566-577

39. Treinys R, Jurevicius J (2008) L-type Ca

2+

channels in the heart: struc-

ture and regulation. Medicina (Kaunas) 44: 491-499

40. Dai S, Hall DD, Hell JW (2009) Supramolecular assemblies and local-

ized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev 89: 411-452

41. Benmocha A, Almagor L, Oz S, Hirsch JA, Dascal N (2009) Charac-

terization of the calmodulin-binding site in the N terminus of CaV1.2.

Channels (Austin) 3: 337-342

42. Ronkainen JJ, Hänninen SL, Korhonen T, Koivumäki JT, Skoumal R,

Rautio S, Ronkainen VP, Tavi P (2011) Ca

2+

-calmodulin-dependent

protein kinase II represses cardiac transcription of the L-type calcium

channel alpha(1C)-subunit gene (Cacna1c) by DREAM translocation.

J Physiol 589: 2669-2686

43. Nimmrich V, Gross G (2012) P/Q-type calcium channel modulators.

Br J Pharmacol 167: 741-59

44. Rajakulendran S, Kaski D, Hanna MG (2012) Neuronal P/Q-type cal-

cium channel dysfunction in inherited disorders of the CNS. Nat Rev

Neurol 8: 86-96

45. Lee A, Zhou H, Scheuer T, Catterall WA (2003) Molecular determi-

nants of Ca

2+

/calmodulin-dependent regulation of Ca(v)2.1 channels.

Proc Natl Acad Sci USA 100: 16059-16064

46. Dunlap K (2007) Calcium channels are models of self-control. J Gen

Physiol 129: 379-383

47. Chaudhuri D, Issa JB, Yue DT (2007) Elementary mechanisms produc-

ing facilitation of Cav2.1 (P/Q-type) channels. J Gen Physiol 129: 385-

401

48. Jiang X, Lautermilch NJ, Watari H, Westenbroek RE, Scheuer T, Cat-

terall WA (2007) Modulation of CaV2.1 channels by Ca

2+

/calmodulin-

dependent protein kinase II bound to the C-terminal domain. Proc

Natl Acad Sci USA 105: 341-346

49. Welsby PJ, Wang H, Wolfe JT, Colbran RJ, Johnson ML, Barrett PQ

(2003) A mechanism for the direct regulation of T-type calcium chan-

nels by Ca2+/calmodulin-dependent kinase II. J Neurosci 23: 10116-

10121

50. Colbran RJ (2004) Targeting of calcium/calmodulin-dependent pro-

tein kinase II. Biochem J 378: 1-16

51. Bayer KU, De Koninck P, Leonard AS, Hell JW, Schulman H (2001)

Interaction with the NMDA receptor locks CaMKII in an active con-

formation. Nature 411: 801-805

52. Raveendran R, Devi Suma Priya S, Mayadevi M, Steephan M, Santho-

shkumar TR, Cheriyan J, Sanalkumar R, Pradeep KK, James J, Omku-

mar RV (2009) Phosphorylation status of the NR2B subunit of NMDA

receptor regulates its interaction with calcium/calmodulin-dependent

protein kinase II. J Neurochem 110: 92-105

53. Pradeep KK, Cheriyan J, Suma Priya SD, Rajeevkumar R, Mayadevi

M, Praseeda M, Omkumar RV (2009) Regulation of Ca

2+

/calmodulin-

-dependent protein kinase II catalysis by N-methyl-D-aspartate recep-

tor subunit 2B. Biochem J 419: 123–132

54. Sessoms-Sikes S, Honse Y, Lovinger DM, Colbran RJ (2005) CaMKI-

Ialpha enhances the desensitization of NR2B-containing NMDA re-

ceptors by an autophosphorylation-dependent mechanism. Mol Cell

Neurosci 29: 139-147

55. Hudmon A, Schulman H (2002) Neuronal Ca

2+

/calmodulin-depen-

dent protein kinase II: the role of structure and autoregulation in cel-

lular function. Annu Rev Biochem 71: 473-510

56. O’Leary H, Liu WH, Rorabaugh JM, Coultrap SJ, Bayer KU (2011)

Nucleotides and phosphorylation bi-directionally modulate Ca

2+

/

Calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) binding to the N-

methyl-D-aspartate (NMDA) receptor subunit GluN2B. J Biol Chem

286: 31272-31281

57. Leonard AS, Bayer KU, Merrill MA, Lim IA, Shea MA, Schulman H,

Hell JW (2002) Regulation of calcium/calmodulin-dependent protein

kinase II docking to N-methyl-D-aspartate receptors by calcium/

calmodulin and α-actinin. J Biol Chem 277: 48441-48448

58. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett

RK, Colbran RJ (2005) Multivalent interaction of calcium/calmodulin-

dependent protein kinase II with the postsynaptic density proteins

NR2B, densin-180, and α-actinin-2. J Biol Chem 280: 35329-35336

59. Robison AJ, Barlett RK, Bass MA, Colbran RJ (2005) Differential modu-

lation of Ca/calmodulin-dependent protein kinase II activity by regu-

lated interactions with N-methyl-D-aspartate receptor NR2B subunits

and α-actinin. J Biol Chem 280: 39316-39323

60. Zhou Y, Takahashi E, Li W, Halt A, Wiltgen B, Ehninger D, Li GD, Hell

JW, Kennedy MB, Silva AJ (2007) Interactions between the NR2B re-

ceptor and CaMKII modulate synaptic plasticity and spatial learning.

J Neurosci 27: 13843-13853

61. Lee JA, Xing Y, Nguyen D, Xie J, Lee CJ, Black DL (2007) Depolariza-

tion and CaM Kinase IV modulate NMDA receptor splicing through

two essential RNA elements. PLoS Biology 5: e40

62. Ozawa T (2010) Modulation of ryanodine receptor Ca

2+

channels. Mol

Med Report 3: 199-204

63. Lanner JT, Georgiou DK, Joshi AD, Hamilton SL (2010) Ryanodine

receptors: structure, expression, molecular details, and function in cal-

cium release. Cold Spring Harb Perspect Biol Cold Spring Harb Per-

spect Biol 2: a003996

64. Jiang J, Zhou Y, Zou J, Chen Y, Patel P, Yang JJ, Balog EM (2010) Site-

specific modification of calmodulin Ca

2+

affinity tunes the skeletal

muscle ryanodine receptor activation profile. Biochem J 432: 89-99

65. Prosser BL, Hernández-Ochoa EO, Schneider MF (2011) S100A1 and

calmodulin regulation of ryanodine receptor in striated muscle. Cell

Calcium 50: 323-331

66. Xu X, Yano M, Uchinoumi H, Hino A (2010) Defective calmodulin

binding to the cardiac ryanodine receptor plays a key role in CPVT-

associated channel dysfunction. Biochem Biophys Res Commun 394:

660-666

67. Yamaguchi N, Takahashi N, Xu L, Smithies O, Meissner G (2007) Early

cardiac hypertrophy in mice with impaired calmodulin regulation of

cardiac muscle Ca release channel. J Clin Invest 117: 1344-1353

68. Huke S, Bers DM (2008) Ryanodine receptor phosphorylation at Ser-

ine 2030, 2808 and 2814 in rat cardiomyocytes. Biochem Biophys Res

Commun 376: 80-85

69. Chelu MG, Sarma S, Sood S (2009) Calmodulin kinase II-mediated

sarcoplasmic reticulum Ca

2+

leak promotes atrial fibrillation in mice.

J Clin Invest 119: 1940-1951

70. Zhang S, Fritz N, Ibarra C, Uhle’n P (2011) Inositol 1,4,5-trisphosphate

receptor subtype-specific regulation of calcium oscillations. Neuro-

chem Res 36: 1175–1185

71. Kasri NN, Torok K, Galione A, Garnham C, Callewaert, Missiaen L,

Parys JB, De Smedt H (2006) Endogenously bound calmodulin is es-

sential for the function of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor. J Biol

Chem 281: 8332-8338

72. Cardy TJA, Taylor CW (1988) A novel role for calmodulin: Ca

2+

-inde-

pendent inhibition of type-1 inositol triphosphate receptor. Biochem J

334: 447-455

73. Jurado LA, Chockalingam PS, Jarrett HW (1999) Apocalmodulin. Phy-

siological Rev 79: 662-680

74. Kang S, Kwon H, Wen H, Sonh Y, Frueh D, Ahn HC, Yoo SH, Wagner

G, Park S (2011) Global dynamic coformational changes in the sup-

pressor domain of IP3 receptor by stepwise binding of the two lobes of

calmodulin. FASEB J 25: 840-850

75. Sienaert I, Kasri NN, Vanlingen S, Parys JB, Callewaert G, Missiaen L,

De Smedt H (2002) Localization and function of a calmodulin-apokal-

modulin-binding domain in the N-terminal part of the type 1 inositol

1,4,5-trisphosphate receptor. Biochem J 365: 269-277

76. Vanlingen S, Sipma H, De Smedt P, Callewaert G, Missiaen L, De

Smedt H (2000) Ca

2+

and calmodulin differentialy modulate myo-

inositol 1,4,5-trisphosphate (IP

3

)-binding to the recombinant ligand-

402

www.postepybiochemii.pl

The role of calmodulin in calcium-dependent signalling in excitable cells

Elżbieta Rębas



, Tomasz Boczek, Antoni Kowalski, Kinga Kuśmirowska, Malwina Lisek,

Ludmiła Żylińska

Department of Molecular Neurochemistry, Medical University of Lodz, 6/8 Mazowiecka St., 92-215 Lodz, Poland



e-mail: [e-mail]

Key words: calmodulin, VGCC, NMDA, TRP, IP

3

R, RyR

ABSTRACT

Calmodulin (CaM) is a sensor protein, which takes part in calcium-dependent signaling, regulating processes like growth, differentiation,

proliferation and motility. Calmodulin binds calcium ions during induction of intracellular signaling. It is also involved in silencing of

calcium signal through activation of plasma membrane Ca

2+

-ATPase (directly) or SERCA pump (indirectly). Calmodulin may affect various

channels, e.g. voltage gated calcium channels (VGCCs), transient receptor potential channels (TRPCs), NMDA receptors, calcium channels

dependent on cyclic nucleotides or these located in endoplasmic reticulum (ryanodine receptors and all isoforms of IP

3

-dependent receptors).

binding domains of the various IP

3

receptor isoforms. Biochem J 346:

275-280

77. Zima AV, Bare DJ, Mignery GA, Blatter LA (2007) IP3-dependent

nuclear Ca

2+

signalling in the mammalian heart. J Physiol 584: 601-611

78. Zhu DM, Tekle E, Chock PB, Huang CY (1996) Reversible phosphory-

lation as a controlling factor for sustaining calcium oscillations in HeLa

cells: Involvement of calmodulin-dependent kinase II and a calyculin

A-inhibitable phosphatase. Biochemistry 35: 7214-7223

79. Takahashi N, Kozai D, Mori Y (2012) TRP channels: sensors and trans-

ducers of gastrotransmitter signals. Front Physiol 3: 324

80. Holakovska B, Grycova L, Bily J, Teisinger J (2011) Characterization

of calmodulin binding domains in TRPV2 and TRPV5 C-tails. Amino

Acids 40: 741-748

81. Gordon-Shaag A, Zagotta WN, Gordon SE (2008) Mechanism of Ca

2+

-

dependent desensitizeation in TRP channels. Landes Bioscience 2:

125-129

82. Holendova B, Grycova L, Jirku M, Teisinger J (2012) PtdIns(4,5)P 2 in-

teracts with CaM binding domains on TRPM3 N-terminus. Channels

18: 6

83. Ming-Hui L, Lin-ling H, Zafir B, Yong Y, Tong, Yang J (2010) Molecu-

lar and structural basis of dual regulation of a canonical TRP channel

by calmodulin. Biophys J 98: 343a-343a

84. Puram VS, Riccio A, Koirala S, Ikeuchi Y, Kim AH, Corfas G, Bonni A

(2011) A TRPC5-regulated calcium signaling pathway controls den-

drite patterning in the mammalian brain. Genes Dev 25: 2659-2673

85. Strotmann R, Semtner M, Kepura F, Plant TD, Schoneberg T (2010)

Interdomain interactions control Ca

2+

-dependent potentiation in the

cation channel TRPV4. Plos One 5, e10580

86. Kakiuchi S, Yamazaki R (1970) Calcium dependent phosphodiesterase

activity and its activating factor (PAF) from brain: Studies on cyclic

3′,5′-nucleotide phosphodiesterase (3). Biochem Biophys Res Commun

41: 1097-1367

87. Cheung WY (1971) Cyclic 3’, 5’ nucleotide phosphodiesterase. J Biol

Chem 246: 2859-2869