BADANIE WPA
YWU OBECNOSCI DETERGENTU NA AKTYWNOŚĆ WYBRANYCH
ENZYMÓW TRAWIENNYCH
1. Badanie wpływu detergentu na działanie lipaz
Lipazy trawią tłuszcze uwalniając kwasy tłuszczowe, które oznacza się za pomocą
miareczkowania roztworem NaOH.
Do dwóch kolbek stożkowych odmierzyć 10 cm3 oleju, 1cm3 wody destylowanej (próba
ślepa) lub 1 cm3 roztworu detergentu o odpowiednim stężeniu (1, 0.1, 0.01, 0.001%) oraz
1cm3 enzymu (100 mg pankreatyny rozpuścić 100 ml buforu o pH = 7,4). Wstrząsnąć aż do
otrzymania emulsji.
Pierwszą kolbę wstawić do termostatu o temp. 37oC. Do drugiej kolby dodać 40 cm3
alkoholu, 2 krople fenoloftaleiny i miareczkować 0,1 M NaOH do różowego zabarwienia.
Do kolby po inkubacji dodać również 40 cm3 alkoholu i miareczkować zawartość wobec
fenoloftaleiny roztworem NaOH.
Od wyniku drugiego miareczkowania (próby inkubowanej) odjąć wynik miareczkowania
próby ślepej (nie inkubowanej). Siłę lipolityczną enzymu wyrazić liczbą cm3 NaOH na 1 cm3
enzymu.
Uzyskane wyniki przedstawić na papierze milimetrowym w postaci wykresu zależności
aktywności badanego enzymu od stężenia dodanego detergentu.
2. Badanie wpływu detergentu na aktywność enzymów amylolitycznych
Do probówki odmierzyć 5 cm3 1% roztworu skrobi, 2 cm3 1% roztworu NaCl, 1 cm3
wody destylowanej (próba ślepa) lub 1 cm3 roztworu detergentu o odpowiednim stężeniu (1,
0.1, 0.01, 0.001%) oraz 2cm3 buforu o pH = 6,8.
Probówkę wstawić na 5 min. do łaz
ni wodnej o temp. 37oC. Następnie dodać 1 cm3
roztworu enzymu (przygotowanego w ćwiczeniu 1). Zamieszać, wstawić do łaz
ni wodnej
(37oC) i zanotować czas. Dokładnie w odstępach 1 minutowych pobierać 2 krople
inkubowanej mieszaniny i dodawać 3 krople płynu Lugola (J w KJ) i kroplę rozcieńczonego
HCl.
Barwa niebieska z jodem wskazuje na obecność niestrawionej skrobi. Jeśli trawienie
jest w toku, powstaje barwa czerwono-fioletowa. Brak zmiany w barwie świadczy o
rozłożeniu całej skrobi do niskich dekstryn. Jest to punkt achromowy.
Należy zanotować czas osiągnięcia punktu achromowego i obliczyć ilość jednostek
aktywności amylazy w 1 cm3 enzymu. Za umowną jednostkę aktywności przyjęto taką ilość
amylazy, która w czasie 10 min., w temp. 37oC i w pH = 6,8 trawi 50 mg skrobi do
produktów nie dających barwy z jodem. Na przykład, jeśli punkt achromowy osiągnięto po 8
min., to znaczy, że 1 cm3 enzymu zawiera 10/8 jednostek aktywności.
Uzyskane wyniki przedstawić na papierze milimetrowym w postaci wykresu zależności
aktywności badanego enzymu od stężenia dodanego detergentu.
Uwaga!
Jeśli punkt achromowy osiągnięto w czasie krótszym od 3 min. lub dłuższym od 20 min.,
należy powtórzyć doświadczenie zmniejszając lub zwiększając ilość dodanego enzymu.