Postępy Biochemii 59 (3) 2013

257

Jerzy Kotlinowski
Józef Dulak
Alicja Józkowicz



Zakład Biotechnologii Medycznej, Wydział

Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwer-

sytet Jagielloński, Kraków



Zakład Biotechnologii Medycznej, Wydział

Biochemii,

Biofizyki

i

Biotechnologii,

Uniwersytet Jagielloński, ul. Gronostajowa 7,

30-387 Kraków; tel.: [phone], e-mail alicja.

[e-mail]

Artykuł otrzymano 2 lutego 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 9 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: cukrzyca, komórki progeni-

torowe śródbłonka, powikłania cukrzycowe

Wykaz skrótów: T2DM (ang. type 2 diabetes

mellitus) — cukrzyca typu 2; EPC (ang. endothe-

lial progenitor cells) — komórki progenitorowe

śródbłonka

Cukrzyca typu 2 upośledza funkcjonowanie

komórek progenitorowych śródbłonka

StreSzczenie

c

ukrzyca typu 2 (t2DM, ang.

type 2 diabetes mellitus) jest chorobą związaną z defektem

działania insuliny prowadzącym do szeregu zmian w metabolizmie komórek. Połącze-

nie insulinooporności i hiperglikemii, obecne u pacjentów z T2DM, jest przyczyną zabu-

rzeń w funkcjonowaniu zarówno dojrzałych, jak i progenitorowych komórek śródbłonka

(EPC, ang.

endothelial progenitor cells). EPC charakteryzowane są jako jednojądrzaste ko-

mórki eksprymujące równocześnie markery śródbłonkowe oraz progenitorowe. Do opisu

EPC wykorzystuje się też ich właściwości angiogenne: tworzenie kapilar

in vitro, tworzenie

wtórnych kolonii komórek śródbłonka, produkcję czynników proangiogennych czy udział

w naprawie naczyń

in vivo. Komórki progenitorowe pochodzące ze szpiku kostnego biorą

udział w regeneracji naczyń krwionośnych. Wykazano jednak, że ich funkcjonowanie jest

upośledzone u osób chorych na cukrzycę. W artykule scharakteryzowano wpływ T2DM na

funkcjonowanie EPC, uwzględniając ponadto powikłania cukrzycowe i wpływ stosowanych

powszechnie leków regulujących poziom glukozy. Zmniejszona liczba i pogorszone funk-

cjonowanie EPC u osób chorych na cukrzycę może być jednym z czynników prowadzących

do zwiększenia ryzyka chorób sercowo-naczyniowych oraz powstawania mikro- i makroan-

giopatii.

WProWaDZEniE

Cukrzyca (DM, łac. Diabetes mellitus) jest schorzeniem towarzyszącym ludz-

kości od pokoleń. Pierwsze informacje o tej chorobie pochodzą z XVI wieku

p.n.e. i dotyczą klasycznych objawów, czyli nadmiernego wydzielania moczu

i jego słodkiego smaku. W starożytnej Grecji Areteusz z Kapadocji — jak się

współcześnie uważa, po raz pierwszy — wprowadził termin diabetes, opisujący

poliurię. Drugi człon łacińskiej nazwy — mellitus, oznaczający po łacinie miód —

został wprowadzony dopiero w 1675 roku przez angielskiego lekarza Thomasa

Willisa [1].

Przez wiele lat nie wiedziano ani jak leczyć cukrzycę, ani jaka jest jej pato-

geneza. Stosowane terapie nie przynosiły zamierzonych rezultatów, choć poja-

wiały się również właściwe przesłanki wiążące otyłość z rozwojem cukrzycy i

zalecające pacjentom aktywność fizyczną [1]. Duży wkład w odkrycie patologii

cukrzycy mieli Joseph von Mering i Oskar Minkowski. W 1889 roku wywołali

oni cukrzycę u psów, którym usunęli operacyjnie trzustkę [2]. O krok dalej po-

sunęli się w swoim eksperymencie Frederick Banting i Charles Best w 1921 roku,

którzy podobnie jak poprzednicy poddali psy pankreatektomii prowadzącej do

cukrzycy, następnie jednak podawali im ekstrakt z trzustek zdrowych zwierząt,

co spowodowało ustąpienie symptomów choroby. Jak przypuszczano, ekstrakt

ten zawierał czynną substancję, której nazwę — insulina — (łac. insula, wyspa)

zaproponowano kilka lat wcześniej [3]. Dalsze badania insuliny potoczyły się

dużo szybciej i doprowadziły do jej oczyszczenia z trzustek bydlęcych oraz te-

rapeutycznego zastosowania hormonu w formie iniekcji u osób chorych na cu-

krzycę już w 1922 roku [1].

Współczesna definicja cukrzycy przyjęta przez Światową Organizację Zdro-

wia (WHO, ang. World Health Organization) podaje, że jest to choroba metabo-

liczna związana z defektem wydzielania lub działania insuliny. W wyniku tych

zmian, dochodzi do przewlekłej hiperglikemii odpowiedzialnej za zaburzenia

czynności oraz uszkodzenie nerek, oczu, nerwów czy naczyń krwionośnych.

Należy podkreślić, że hiperglikemia jest zjawiskiem pierwotnym, prowadzącym

do rozwoju powikłań w cukrzycy, które u osób nieleczonych mogą doprowa-

dzić do śmierci [4]. W ustanowionej przez WHO klasyfikacji tej choroby wy-

różnia się 4 typy cukrzycy: cukrzycę typu 1 (T1DM, ang. type 1 diabetes mellitus),

cukrzycę typu 2 (T2DM, ang. type 2 diabetes mellitus), cukrzycę o znanej etiologii

i cukrzycę ciężarnych [1,4]. Przyczyną występowania T1DM jest niszczenie ko-

mórek β trzustki w procesie autoimmunologicznym, prowadzącym do braku

258

www.postepybiochemii.pl

endogennej insuliny. Natomiast do rozwoju T2DM docho-

dzi na skutek insulinooporności, mimo produkowania tego

hormonu przez komórki β. Do grupy cukrzyc o znanej etio-

logii należy najwięcej form tej choroby. Zalicza się do niej

m. in. cukrzycę spowodowaną chorobami genetycznymi,

zakażeniami oraz wpływem substancji chemicznych. Jako

przyczynę rozwoju tej choroby podaje się również endo-

krynopatie i choroby wydzielniczej części trzustki. Ostat-

ni, 4 typ cukrzycy opisuje się w przypadku każdego stanu

hiperglikemicznego pojawiającego się u zdrowych dotąd

kobiet będących w ciąży. Należy podkreślić, że T2DM jest

najczęstszą postacią schorzenia, diagnozowaną u 90-95%

wszystkich pacjentów cukrzycowych [1,4].

Ze względu na duży wzrost liczby zachorowań oraz

skomplikowaną terapię, eksperci WHO uznali cukrzycę za

epidemię XXI wieku. Szacują oni, że obecnie na świecie cho-

ruje ponad 220 milionów osób, a liczba ta ma się podwoić

przed rokiem 2030 [4]. Podobne wyniki otrzymali Shaw i

wsp., którzy liczbę chorych na świecie w 2010 roku oceni-

li na 285 milionów [5]. Tylko w 2004 roku bezpośrednio z

powodu hiperglikemii lub w związku z rozwojem powi-

kłań cukrzycowych zmarło około 3,4 miliona osób. Pacjenci

chorzy na cukrzycę są również bardziej podatni na rozwój

przewlekłych powikłań, takich jak trudno gojące się rany,

uszkodzenia nerek czy neuropatie, które znacząco obniżają

jakość życia [5].

objaWy i DiagnosTyKa CuKrZyCy

Prawidłowe rozpoznanie cukrzycy i wczesne rozpoczę-

cie terapii jest utrudnione przez brak swoistych i jedno-

znacznych objawów. Ocenia się, że nawet 50% chorych na

cukrzycę jest nieświadomych choroby [1]. Sytuację dodat-

kowo utrudnia fakt, że wiele przypadków T2DM przebie-

ga praktycznie bezobjawowo, dlatego w rozpoznaniu tej

choroby bardzo istotne znacznie ma wykrycie czynników

ryzyka i badanie przesiewowe. Występowanie nadciśnienia

tętniczego, otyłości czy cukrzycy w rodzinie chorego po-

winno być wskazaniem do badań w kierunku cukrzycy. Jak

wskazują statystyki, np. otyłość, zwłaszcza typu brzuszne-

go, występuje aż u 85% pacjentów z T2DM [1].

Standardowym badaniem wykorzystywanym w diagno-

styce cukrzycy jest pomiar glikemii [1,6]. Oznaczenia stęże-

nia glukozy wykonuje się w osoczu krwi żylnej metodami

enzymatycznymi zarówno na czczo jak i po obciążeniu

glukozą (tzw. test tolerancji glukozy). Z kolei doustny test

tolerancji glukozy (OGTT, ang. oral glucose tolerance test) jest

najczęściej wykonywanym testem czynnościowym. Polega

na oznaczeniu glikemii na czczo oraz na sprawdzeniu jak

szybko glukoza jest pobierana z krwi przez komórki doce-

lowe. Standardowo w teście tym określa się glikemię przed

i dwie godziny po wypiciu przez pacjenta szklanki wody

zawierającej 75 g glukozy [6]. Natomiast w przypadku osób

cierpiących na cukrzycę, do oceny skuteczności zastosowa-

nej terapii wykorzystuje się pomiar stężenia glikowanej he-

moglobiny (HbA1c) w krwi [6]. Ze względu na średni czas

życia erytrocytów wynoszący 120 dni, HbA1c odzwiercie-

dla trzymiesięczną historię choroby. Opisane testy pozwa-

lają na przeprowadzenie diagnozy cukrzycy, zgodnie z al-

gorytmem przedstawionym na rycinie 1.

Warto pamiętać, że do opisu stanów hiperglikemicznych

stosuje się kilka terminów: stan przedcukrzycowy (ang. pre-

diabetes), który rozpoznaje się na podstawie wykrycia nie-

prawidłowej glikemii na czczo (IFG, ang. impaired fasting

glucose) i/lub upośledzonej tolerancji glukozy (IGT, ang.

impaired glucose tolerance). Diagnozuje się go na podstawie

wartości IFG i IGT wynoszących odpowiednio 100–125 mg/

dL i 140–199 mg/dL. U osób z rozpoznanym stanem przed-

cukrzycowym zaleca się powtarzanie badań co 2 lata [6]. Z

kolei cukrzycę stwierdza się w przypadku spełnienia przez

pacjentów jednego z poniższych kryteriów:

1. występowania typowych objawów klinicznych w po-

łączeniu z wartością glikemii o dowolnej porze dnia ≥ 200

mg/dL,

2. dwukrotnego pomiaru glikemii na czczo ≥ 126 mg/dL,

3. glikemii ≥ 200 mg/dL 120 minut po doustnym obciąże-

niu 75 g glukozy (test OGTT).

ETiologia i roZWój CuKrZyCy TyPu 2

Czynnikami ryzyka zwiększającymi prawdopodobień-

stwo rozwoju T2DM są zarówno uwarunkowania genetycz-

ne, jak i czynniki środowiskowe. Do najważniejszych czyn-

ników środowiskowych zalicza się otyłość typu brzusznego

i małą aktywność fizyczną, jednak do rozwoju choroby do-

chodzi tylko u części osób. U pozostałych, sprawność wy-

dzielnicza komórek β jest wystarczająco duża, by utrzymu-

jąca się przez długi czas hiperinsulinemia kompensowała

hiperglikemię. Osoby te charakteryzuje również zbliżony

do prawidłowego poziom glukozy w krwi, brak insulino-

oporności oraz rozrost podskórnej tkanki tłuszczowej, dzię-

ki czemu nie dochodzi do magazynowania tłuszczów w

wątrobie, sercu, mięśniach i trzustce [7,8].

Wydaje się jednak, że wpływ czynników środowisko-

wych promujących rozwój cukrzycy zaczyna się już w trak-

cie życia płodowego. Badania populacyjne wykazały, że u

rycina 1. Algorytm rozpoznawania cukrzycy, na podstawie [1], zmienione.

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

259

dzieci, których matka w trakcie ciąży miała cukrzycę, wcze-

śniej dochodzi do rozwoju T2DM [9]. Przykładem może być

też analiza częstości zachorowań w rodzinach, w których

matki rodziły dzieci zarówno przed, jak i po zachorowaniu

na T2DM. Stwierdzono, że dzieci urodzone zanim doszło

do rozwoju T2DM u matki rzadziej zapadały na tą chorobę

[10]. Mimo istotnego wpływu historii rodzinnej na rozwój

cukrzycy stwierdzono, że tylko u około 10% pacjentów roz-

wój choroby można wytłumaczyć znanymi dziś mutacjami.

Jedno z ostatnich badań populacyjnych przeprowadzonych

w Szwecji w 2010 roku wykazało zwiększone ryzyko wystą-

pienia cukrzycy u dzieci, których rodzeństwo również cho-

rowało na cukrzycę. Ryzyko nie było natomiast związane ze

stanem zdrowia rodziców. Wynik ten sugeruje recesywny

wzór dziedziczenia u osób narażonych na podobne czynni-

ki środowiskowe [11].

Badania porównawcze genomów pacjentów cukrzyco-

wych pozwoliły na wykrycie wielu potencjalnie istotnych

genów, których mutacje mogą wpływać na rozwój choroby.

Są to przede wszystkim geny związane z upośledzeniem

funkcjonowania komórek β, insulinoopornością oraz oty-

łością [12]. Najważniejsza znana mutacja promująca rozwój

T2DM zlokalizowana jest w intronie 3 genu kodującego

czynnik transkrypcyjny TCF7L2 (ang. transcription factor

7-like 2) [13]. TCF7L2 jest składnikiem kompleksu trans-

krypcyjnego β-katenina/TCF i reguluje przekaz sygnału w

szlaku Wnt. Jego funkcja w cukrzycy polega na stymulacji

proliferacji komórek β trzustki oraz zwiększaniu produkcji

glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1, ang. glucagon-like

peptide-1) [13].

Rozwój T2DM przebiega wieloetapowo. Zbyt wysokie,

toksyczne dla organów wewnętrznych stężenie glukozy w

krwi upośledza szereg procesów m. in. działanie insuliny

[14]. Pojawiająca się w pierwszej fazie T2DM insulinoopor-

ność prowadzi do zaburzeń we wchłanianiu i metabolizmie

glukozy przez komórki mięśniowe, adipocyty i hepatocy-

ty. W odpowiedzi na gorsze działanie insuliny, organizm

zwiększa jej produkcję, kompensując w ten sposób przez

pewien czas hiperglikemię. Jest to jednak działanie krót-

kotrwałe, ponieważ nadmierna eksploatacja komórek β

trzustki prowadzi do zmniejszenia ich masy i stopniowego

spadku wydzielania insuliny, aż do całkowitego zaprzesta-

nia funkcji wydzielniczych. Występująca w końcowej fazie

cukrzycy apoptoza komórek β prowadzi do całkowitego

braku endogennej insuliny, nasilenia hiperglikemii i ko-

nieczności podawania egzogenngo hormonu [14].

WPłyW hiPErgliKEMii na KoMórKi śróDbłonKa

Podwyższony poziom glukozy w krwi zaburza funkcjo-

nowanie hepatocytów, adipocytów, komórek mięśniowych

oraz komórek śródbłonka, zarówno dojrzałych (EC, ang.

endothelial cells), jak i progenitorowych (EPC, ang. endothe-

lial progenitor cells) [14,15]. Wpływ na komórki śródbłonka

wydaje się najistotniejszy, ponieważ związany jest z uszko-

dzeniami naczyń krwionośnych.

Glukoza jest podstawowym źródłem energii wszystkich

komórek organizmu człowieka. W warunkach prawidło-

wych jest przekształcana do acetylo-CoA, który bierze na-

stępnie udział w wytwarzaniu i magazynowaniu energii

w postaci ATP. Produktem ubocznym tych przemian jest

zawsze powstawanie niewielkiej ilości reaktywnych form

tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species). W hiperglikemii,

oprócz prawidłowej syntezy ATP dochodzi do zwiększonej

produkcji ROS, niespecyficznej glikacji białek (AGE, ang.

advanced glycation endproducts), aktywacji kinazy białkowej

C oraz indukcji szlaku poliolowego i heksozoaminowego

[16].

Produkcja ROS i AGE uważana jest za kluczowy czyn-

nik uszkadzający naczynia krwionośne i przyczyniający się

do rozwoju mikro- i makroangiopatii, głównych powikłań

cukrzycy. Wykazano, że wiązanie AGE z receptorem

wywołuje indukcję oksydaz NADPH, wzrost produkcji

ROS, a w konsekwencji prowadzi do uszkodzeń w DNA [17].

Stwierdzono również, że wywołana przez hiperglikemię i

ROS apoptoza EC zależy od szlaku NFκB, c-Jun i aktywacji

kaspaz [18]. Upośledzenie funkcji śródbłonka w warunkach

hiperglikemii wynika też z hamowania szlaku kinazy fosfa-

tydyloinozytolu-3 (PI3K, ang. phosphoinositide-3-OH kinase)

przez AGE. W prawidłowych warunkach aktywacja PI3K

poprawia żywotność EC oraz zwiększa ich zdolność do mi-

gracji i produkcji tlenku azotu (NO, ang. nitric oxide) przez

śródbłonkową syntazę NO (eNOS, ang.

endothelial nitric oxide synthase) [19]. W

hiperglikemii dochodzi do rozprzęgnię-

cia eNOS, czego efektem jest zmniej-

szenie syntezy NO, nasilenie produkcji

anionorodnika ponadtlenkowego (O

2

-

∙)

i w konsekwencji powstawanie bardzo

toksycznego nadtlenoazotynu (ONOO-)

[19].

U chorych na cukrzycę dysfunkcja

śródbłonka związana jest ponadto z

nasiloną syntezą cytokin prozapalnych,

adhezyn i czynników wzrostowych.

Prowadzi to do nadmiernej adhezji lim-

focytów, płytek krwi i monocytów, co

indukuje reakcję zapalną i może zwięk-

szać ryzyko rozwoju miażdżycy [16].

Dodatkowym czynnikiem ułatwiającym

rycina 2. Prawidłowy śródbłonek naczyń krwionośnych i mechanizmy odpowiedzialne za jego uszkodzenie

w hiperglikemii, na podstawie [40], zmienione.

260

www.postepybiochemii.pl

infiltrację monocytów jest zwiększona przepuszczalność

śródbłonka w warunkach hiperglikemii, spowodowana

osłabieniem połączeń międzykomórkowych [20]. Wyka-

zano też, że AGE wywołując agregację białek macierzy są

przyczyną spadku elastyczności naczyń i hamowania akty-

wacji metaloproteinaz (Ryc. 2) [21].

Wywołane przez hiperglikemię i ROS zmiany w funkcjo-

nowaniu EC oraz zaburzony skład i struktura macierzy ze-

wnątrzkomórkowej prowadzą do dysfunkcji naczyń krwio-

nośnych, zmniejszenia ich światła i upośledzenia przepływu

krwi. Wszystkie te zmiany wywołują powikłania cukrzyco-

we, które u osób nieleczonych mogą doprowadzić nawet do

śmierci [21]. Dlatego kluczowym zagadnieniem jest moż-

liwość poprawy funkcjonowania naczyń krwionośnych u

osób z cukrzycą, a jedną z możliwych strategii terapeutycz-

nych jest wykorzystanie komórek progenitorowych.

oDKryCiE KoMórEK ProgEniToroWyCh

śróDbłonKa

Przez wiele lat uważano, że tworzenie de novo naczyń

krwionośnych z niezróżnicowanych komórek prekurso-

rowych zachodzi jedynie w trakcie rozwoju płodowego.

Sądzono, że u osób dorosłych proces ten nie występuje, a

regeneracja i tworzenie nowych naczyń przebiega na dro-

dze migracji i różnicowania in situ dojrzałych komórek

śródbłonka. Ten powszechnie zaakceptowany pogląd uległ

zmianie po odkryciu przez Asaharę i współpracowników z

zespołu prof. Jeffrey’a Isnera, w krwi dorosłych osób komó-

rek progenitorowych śródbłonka zdolnych do proliferacji,

migracji i inkorporowania do istniejących naczyń [22].

Praca opublikowana w 1997 roku w Science, po raz

pierwszy udokumentowała obecność w ludzkiej krwi ob-

wodowej komórek frakcji leukocytarnej, zdolnej do różni-

cowania in vitro do komórek śródbłonka. Do izolacji EPC

wykorzystano antygeny CD34 i VEGFR-2 (KDR) ulegające

ekspresji zarówno w komórkach śródbłonkowych jak i w

hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC, ang.

hematopoietic stem cells). Pozyskane od dorosłych ochotni-

ków komórki CD34(+)/VEGFR-2(+) hodowano in vitro i już

po kilku dniach stwierdzono syntezę charakterystycznych

markerów śródbłonka, takich jak: CD31, E-selektyna, Tie-2

czy eNOS [22]. W tej samej pracy opisano też doświadcze-

nie, polegające na izolacji EPC z transgenicznych myszy wy-

kazujących ekspresję genu reporterowego β-galaktozydazy

i podaniu ich zwierzętom z niedotlenioną kończyną. Wy-

kazano obecność komórek β-gal(+)/CD31(+) w regenerują-

cych naczyniach krwionośnych, wskazując tym samym na

ich udział w waskulogenezie [22]. Kolejne doświadczenia

wykonywane przez ten sam zespół potwierdzały udział ko-

mórek EPC uwalnianych ze szpiku kostnego w tworzeniu

naczyń krwionośnych zarówno w stanach fizjologicznych

(przerost błony śluzowej macicy, ukrwienie ciałka żółtego,

gojenie ran) jak i patologicznych (wzrost nowotworu, za-

wał serca czy niedokrwienie kończyny tylnej). W badaniach

przeprowadzano rekonstytucję szpiku kostnego u napro-

mieniowanych myszy, przeszczepiając im komórki wyka-

zujące ekspresję β-galaktozydazy pod kontrolą promotorów

charakterystycznych dla komórek śródbłonka, czyli Tie-2

lub VEGFR-2. Po wykonaniu rekonstytucji szpiku kostnego

badacze stwierdzali obecność znakowanych komórek w no-

wopowstałych naczyniach [23,24]. Eksperymenty wykona-

ne przez Asaharę i wsp. dały początek wielu pracom, które

pozwoliły na lepsze poznanie funkcjonowania EPC.

Mianem EPC określa się dziś jednojądrzaste komórki

eksprymujące równocześnie markery śródbłonkowe i pro-

genitorowe [25]. EPC wykazują ponadto zdolność wiązania

lektyny, białek macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibro-

nektyny) oraz pochłaniania acetylowanych lipoprotein o

niskiej gęstości (AcLDL, ang. acetylated low density lipopro-

tein). Mimo wielu lat badań nie udało się jednak do dzisiaj

zidentyfikować antygenu ulegającego ekspresji jedynie na

EPC, który jednoznacznie definiowałby tylko tę populację

komórek. Wśród markerów obecnych na powierzchni ludz-

kich EPC wyróżnia się CD31, CD34, VE-kadherynę, CD146,

CXCR4, VEGFR-2, Tie-2 czy vWF. Synteza CD133 i c-kit,

markerów progenitorowych, zanika na powierzchni ludz-

kich EPC w trakcie ich różnicowania do EC [25]. Charak-

terystyka mysich EPC w dużej mierze jest podobna. Warto

jednak pamiętać, że komórki mysie wiążą lektynę BS1 Grif-

fonia simplicifolia (ludzkie — Ulex europaeus) i eksprymują

Sca-1. Podobnie jak w przypadku komórek ludzkich, róż-

nicowanie mysich EPC wiąże się z utratą Sca-1 i c-kit [25].

Do analizy EPC wykorzystuje się również właściwości

angiogenne tych komórek, takie jak zdolność do tworzenia

kapilar in vitro, tworzenie wtórnych kolonii EC, produkcję

czynników proangiogennych czy udział w naprawie naczyń

in vivo. Należy podkreślić, że analiza testów funkcjonalnych

jest bardzo istotna, ponieważ pozwala na ocenę rzeczywi-

stej funkcji EPC i ich ewentualnej przydatności w terapii.

Fenotypowa charakterystyka EPC jest natomiast wciąż

tematem ożywionych dyskusji i licznych kontrowersji. Nie

ma również powszechnie uznawanej, wystandaryzowanej

metody ich izolacji i hodowli co dodatkowo utrudnia inter-

pretację uzyskanych wyników [26]. Dokładne porównanie

i podsumowanie stosowanych metod przedstawili ostatnio

Richardson i Yoder, potwierdzając jednocześnie, że używa-

ny obecnie termin EPC nie definiuje ściśle jednej populacji

komórek [26]. Dodatkowo, charakterystykę EPC utrudnia

ekspresja niektórych antygenów zarówno na powierzchni

EPC, EC jak i HSC. Wykorzystanie różnych protokołów

izolacji, odmiennych warunków hodowli, czy wreszcie cha-

rakteryzowanie EPC w oparciu o niejednakowe markery i

testy funkcjonalne, utrudnia porównywanie wyników uzy-

skanych przez różne grupy badawcze. Jednak, co wydaje

się dziś bezsporne, komórki progenitorowe biorą udział w

regeneracji naczyń krwionośnych [25,27].

EPC i KonDyCja naCZyń KrWionośnyCh

Komórki progenitorowe śródbłonka rezydują w niszach

szpiku kostnego, skąd w odpowiedzi na uszkodzenie lub

niedotlenienie tkanek są mobilizowane i włączane w proce-

sy regeneracyjne [24]. Mobilizacja wiąże się z całą kaskadą

zdarzeń obejmujących uwolnienie EPC do krwi, dotarcie do

uszkodzonej tkanki oraz stymulację powstawania nowych i

naprawę już istniejących naczyń [28]. Jednymi z najważniej-

szych mediatorów odpowiedzialnych za mobilizację EPC

są czynniki VEGF-A i czynnik-1α pochodzenia stromalne-

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

261

go (SDF-1α, ang. stromal cell-derived factor-1α). Wiążą się one

do receptorów VEGFR-2 (VEGF-A) i CXCR4 (SDF-1α) na

powierzchni komórek podścieliska, indukując fosforylację

kinaz PI3K/AKT i aktywując syntazę tlenku azotu. Wzrost

produkcji NO aktywuje metaloproteinazę 9 macierzy ze-

wnątrzkomórkowej (MMP-9, ang. matrix metalloproteinase

9), która uwalnia czynnik komórek macierzystych (KitL,

ang. kit ligand) obecny w błonie komórek podścieliska. Roz-

puszczalna forma KitL (sKitL), po związaniu z receptorem

na powierzchni EPC, indukuje ich mobilizację. W kolejnym

etapie, naprowadzane przez gradient chemokin EPC docie-

rają do uszkodzonych naczyń i biorą udział w ich naprawie

(Ryc. 3) [28].

Po wniknięciu do uszkodzonych lub ischemicznych tka-

nek EPC stymulują powstawanie naczyń krwionośnych.

Uważa się, że biorą udział w waskulogenezie (tworzeniu de

novo nowych naczyń), różnicując w dojrzałe komórki śród-

błonkowe. Mogą też bezpośrednio inkorporować do uszko-

dzonych, ale już istniejących struktur, wypełniając luki w

warstwie śródbłonka [22]. Z powodu rozbieżnych wyników

dotyczących udziału EPC w utworzonych naczyniach (od

0% do 80% komórek śródbłonkowych) trudno jednak jed-

noznacznie stwierdzić, jakie jest nasilenie i znaczenie tego

procesu [29-31].

Coraz częściej zwraca się natomiast uwagę na istotną rolę

działania parakrynnego. EPC po dotarciu do uszkodzonej

tkanki wydzielają czynniki wzrostowe, aktywując zarówno

EC jak i pericyty. Do proangiogennych cytokin produko-

wanych w wysokich stężeniach przez EPC zalicza się IL-8,

czynnik wzrostu hepatocytów (HGF, ang. hepatocyte growth

factor), VEGF-A, płytkowy czynnik wzrostu-BB (PDGF-BB,

ang. platelet-derived growth factor-BB), zasadowy czynnik

wzrostu fibroblastów (bFGF, ang. basic fibroblast growth fac-

tor) oraz białko chemotaktyczne-1 dla monocytów (MCP-

1, ang. monocyte chemoactractant protein-1) [32]. Znaczenie

produkowanych przez EPC czynników wzrostowych wy-

kazali Di Santo i wsp. analizując pożywki kondycjonowa-

ne zebrane znad EPC (EPC CM). Media te indukowały in

vitro wzrost kapilar w teście krążków aortalnych na matri-

gelu oraz hamowały apoptozę EC [33]. Co najważniejsze,

domięśniowe podanie EPC CM do niedotlenionej kończy-

ny szczura przyśpieszało regenerację przepływu, poprzez

zwiększenie liczby dojrzałych kapilar. Autorzy pracy zaob-

serwowali taki sam efekt terapeutyczny po podaniu komó-

rek i kondycjonowanych mediów, co potwierdza kluczowe

znaczenie parakrynnej aktywności EPC [33].

Proangiogenny potencjał komórek progenitorowych

śródbłonka i ich duże znaczenie dla prawidłowej kondycji

naczyń krwionośnych nie budzi dziś wątpliwości, mimo

trudności z jednoznacznym wskazaniem najważniejszego

mechanizmu ich działania oraz braku ścisłej definicji tych

komórek. Wykazano, że funkcjonowanie EPC jest zaburzo-

ne w stanach patologicznych. Stwierdzono m. in. odwrotną

korelację pomiędzy liczbą i zdolnością EPC do migracji, a

czynnikami ryzyka choroby niedokrwiennej serca [34]. Wy-

kazano też istnienie zależności pomiędzy liczebnością EPC

w krwi i skalą Framingham, oceniającą ryzyko wystąpienia

zawału serca lub śmierci spowodowanej chorobą niedo-

krwienną serca w perspektywie 10 lat [34]. U pacjentów z

cukrzycą wydaje się natomiast, że nasilenie niekorzystnych

zmian w naczyniach krwionośnych wiąże się ze zmniejszo-

ną liczbą oraz osłabionym potencjałem klonogennym EPC

[34].

KonDyCja KoMórEK EPC u PaCjEnTóW

ChoryCh na CuKrZyCę

Pacjenci chorzy na cukrzycę 3–4 razy częściej zapadają na

choroby układu krążenia niż osoby z prawidłową glikemią.

Stwierdzono, że najważniejszą przyczyną tych komplikacji

jest dysfunkcja śródbłonka. Wydaje się, że nasilenie nieko-

rzystnych zmian w naczyniach wynika również ze zmniej-

szonej liczby i osłabionego potencjału klonogennego EPC

[35].

Analizy laboratoryjne przeprowadzone na materiale

pobranym od ludzi wykazały niekorzystny wpływ hiper-

glikemii na aktywność EPC. Hodowanie komórek jedno-

jądrzastych (MNC, ang. mononuclear cells) izolowanych z

krwi zdrowych osób w warunkach podwyższonego stę-

żenia glukozy zmniejszało liczbę uzyskanych EPC. Ko-

mórki wykazywały też wolniejszą migrację, zmniejszo-

ną produkcję NO oraz spadek aktywności MMP-9 [36].

Wpływ hiperglikemii na EPC uzyskane od zdrowych

ochotników i hodowane in vitro był porównywany z

wpływem stymulacji czynnikiem-α martwicy nowotwo-

rów (TNF-α, ang. tumor necrosis factor-α). Stwierdzono,

że w obu przypadkach dochodzi do aktywacji kinazy

p38 [37]. Wydaje się, że zarówno indukcja p38 wynika-

jąca z fosforylacji reszt treoniny 180 i tyrozyny 182 jak

i upośledzenie aktywności szlaku kinazy Akt ogrywają

istotną rolę w hamowaniu proliferacji i starzeniu się EPC

u pacjentów z cukrzycą [38]. Komórki EPC izolowane

z krwi chorych i hodowane in vitro wykazują obniżoną

o prawie 50% proliferację i znacznie mniej wydajnie in-

korporują do kapilar. Mimo prawidłowej adhezji do ko-

lagenu, fibrynogenu i spoczynkowych EC, ich zdolność

do wiązania się z aktywowanym śródbłonkiem jest za-

burzona [39]. Tymczasem wiązanie EPC z uszkodzonym

śródbłonkiem ma kluczowe znaczenie, gdyż warunkuje

możliwość naprawy naczyń [39]. Cukrzyca wpływa też

na działanie parakrynne ludzkich EPC. Kondycjonowane

pożywki znad takich komórek mniej wydajnie stymulują

tworzenie kapilar przez dojrzałe komórki śródbłonkowe.

Osłabienie aktywności cukrzycowych EPC utrzymuje się

nawet po kilkudniowej hodowli w warunkach normogli-

kemii [40].

rycina 3. Schemat mobilizacji komórek progenitorowych śródbłonka ze szpiku

kostnego.

262

www.postepybiochemii.pl

Badania in vivo potwierdziły niekorzystny wpływ hiper-

glikemii na liczbę i funkcjonowanie EPC u ludzi, sugerowa-

ny przez doświadczenia in vitro. Wykazano między innymi

odwrotną korelację pomiędzy stężeniem glukozy a liczbą

EPC (komórek o fenotypie CD34(+)/KDR(+)) w krwi obwo-

dowej pacjentów z T2DM. Spadek u osób chorych wynosił

około 40%, co znaczyło, że liczba EPC zmniejszała się z oko-

ło 70 do około 40 na milion komórek [41]. Wykazano też,

że liczba EPC w krwi osób zdrowych i z cukrzycą zdiagno-

zowaną po raz pierwszy (charakteryzującą się poziomem

HbA1c poniżej 7,5%) nie różni się. Kluczową rolę hipergli-

kemii w pogorszeniu funkcjonowania EPC dokumentują

również prace opisujące zwiększoną zdolność jednojądrza-

stych komórek krwi obwodowej do różnicowania in vitro w

kierunku EPC u pacjentów z lepszą kontrolą poziomu glu-

kozy [42,43].

Trudno dziś jednak jednoznacznie stwierdzić, czy wystę-

powanie mikro- i makroangiopatii w cukrzycy spowodo-

wane jest zaburzeniem funkcji EPC, czy też na skutek roz-

woju powikłań, dochodzi do zmian w biologii EPC. Anali-

zy kliniczne sugerują jedynie, że występowanie angiopatii

u osób chorych na cukrzycę, zmniejsza liczbę EPC w krwi

obwodowej, a stopień zaawansowania choroby naczyń ob-

wodowych jest odwrotnie proporcjonalny do liczby tych

komórek [41].

ZaburZonE funKCjonoWaniE KoMórEK

EPC a PoWiKłania CuKrZyCoWE

Powikłania przewlekłe powstają na skutek wieloletniej

ekspozycji komórek na podwyższone stężenie glukozy i

niemożności uniknięcia silnych wahań glikemii w trakcie

długotrwałej choroby. Stopniowe nagromadzanie uszko-

dzeń w układzie krwionośnym prowadzi bardzo często,

nawet u osób leczonych, do rozwoju dysfunkcji śródbłonka.

Rozwój powikłań przewlekłych jest największym zagroże-

niem dla pacjentów cukrzycowych. Oszacowano, że w 2000

roku przyczyniły się one do śmierci 2,9 miliona osób na ca-

łym świecie [4,5].

Najczęściej diagnozowanym przewlekłym powikłaniem

jest neuropatia cukrzycowa, występująca aż u 50% cho-

rych. Jest ona bezpośrednim skutkiem hiperglikemii, któ-

ra w połączeniu ze stresem oksydacyjnym i zaburzeniami

produkcji czynników wzrostowych prowadzi nie tylko do

demielinizacji, ale również do zaniku nerwów [1]. Badania

wpływu neuropatii cukrzycowej na właściwości EPC w

modelu szczurzym wykazały, że upośledzona mobilizacja

tych komórek związana jest z mniejszą liczbą zakończeń

nerwowych w szpiku kostnym. Obok zaniku nerwów au-

torzy pracy wykazali wzrost liczby EPC w szpiku, przy jed-

noczesnym spadku ich liczebności w krwi obwodowej [43].

Podobne wyniki uzyskano analizując nerwy kulszowe u

myszy z cukrzycą wywołaną iniekcją streptozotocyny. Wy-

kazano u nich pogorszony przepływ krwi, mniejszą liczbę

kapilar oraz słabsze przewodzenie w nerwach czuciowych

i ruchowych. Obserwowane zmiany ustąpiły po domię-

śniowym podaniu EPC, które preferencyjnie lokowały się

w naczyniach odżywiających nerwy i w okolicy dojrzałych

komórek śródbłonka. Proangiogenne i proneurogenne wła-

ściwości EPC przyczyniły się do nasilenia proliferacji komó-

rek Schwanna i EC [44].

Neuropatia, wraz ze zmniejszonym przepływem krwi

w naczyniach obwodowych, dysfunkcją śródbłonka oraz

upośledzoną angio- i arteriogenezą stanowi najważniejszy

czynnik prowadzący do powstawania trudno gojących się

ran, czyli takich, które goją się dłużej niż 8 tygodni, nie goją

się wcale, lub po wygojeniu pojawiają się powtórnie [45].

Skrajnym przypadkiem są owrzodzenia stóp występujące

u kilku procent pacjentów, które u około 1% chorych koń-

czą się amputacją [46]. W 2004 roku w USA 60% amputacji

kończyn dolnych niezwiązanych z urazem mechanicznym

było spowodowanych występowaniem cukrzycy z powi-

kłaniami [47]. Przedłużenie gojenia ran lub całkowite za-

hamowanie tego procesu w cukrzycy wynika z rozwijającej

się neuropatii i waskulopatii lub może być spowodowane

zakażeniami. Wydaje się, że zmniejszenie liczebności i upo-

śledzenie funkcji EPC w cukrzycy, może przyczyniać się do

zaburzeń gojenia ran, gdyż hiperglikemia wpływa zarów-

no na zdolności EPC do bezpośredniej naprawy naczyń,

jak również na wydzielanie czynników wzrostowych [48].

Jak wykazali Barcelos i wsp., podanie pożywek zebranych

znad komórek CD133(+) (CD133(+) CM) przyśpiesza goje-

nie owrzodzeń u myszy cukrzycowych. Proangiogenny po-

tencjał CD133(+) CM potwierdzono również in vitro: media

te stymulowały migrację i tworzenie tubul przez dojrzałe

komórki śródbłonka, a efekt był hamowany w obecności

przeciwciał wiążących VEGF-A lub IL-8 [48].

Zaangażowanie EPC w gojenie ran przebiega wieloeta-

powo, obejmując przekaz sygnału do szpiku, uwalnianie

EPC do krwi, migrację komórek do miejsca zranienia i ak-

tywne włączanie się w proces odbudowy. Zakłócenie które-

gokolwiek z tych etapów może opóźnić lub całkowicie za-

burzyć regenerację tkanek [28]. Wykazano, że upośledzone

uwalnianie komórek progenitorowych ze szpiku kostnego

w cukrzycy w odpowiedzi na m. in. VEGF-A i SDF-1α spo-

wodowane jest przede wszystkim zmniejszoną aktywnością

eNOS i wynikającym z tego osłabieniem przekazu sygnału

od sKitL [39,40]. SDF-1α jest jedną z najważniejszych che-

mokin odpowiedzialnych za mobilizację komórek progeni-

torowych. EPC migrują zgodnie z gradientem tego białka,

którego stężenie w prawidłowych warunkach powinno być

najwyższe w miejscu uszkodzenia naczyń [28]. U myszy

cukrzycowych stwierdzono jednak niższą ekspresję SDF-1α

w zranionej tkance. Dopiero odtworzenie naturalnie wystę-

pującego gradientu poprzez lokalne podanie rekombino-

wanego białka indukowało mobilizację EPC i przyśpieszało

gojenie ran [28]. Podobne wyniki otrzymano analizując trzy

odmienne modele myszy cukrzycowych (db/db, NOD i

myszy nastrzyknięte streptozotocyną). We wszystkich mo-

delach zaobserwowano spowolnienie gojenia ran, co wią-

zało się z mniejszą liczebnością EPC w miejscu zranienia.

Tak jak w przypadku SDF-1α, miejscowe podanie PDGF-BB

przyspieszało gojenie i stymulowało powstawanie nowych

naczyń [49]. Wyniki te sugerują, że stymulacja komórek EPC

może pomóc w terapii przewlekłych ran oraz owrzodzeń.

Terapia komórkowa z wykorzystaniem EPC może być

bardzo obiecująca, choć nie można wykluczyć niepożą-

danych skutków ubocznych tej metody. Potencjalnie EPC

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

263

mogą bowiem przyczyniać się do wzrostu unaczynienia

nowotworów czy rozwoju proliferacyjnej formy retinopatii

cukrzycowej. Badania potwierdziły, że EPC mogą uczest-

niczyć w patologicznej neowaskularyzacji [50], przy czym

wydaje się, że proces ten zależy od mobilizacji EPC induko-

wanej przez SDF-1. Wykazano, że w ciele szklistym myszy

będących modelem proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej,

stężenie SDF-1 jest wysokie, a blokowanie aktywności tego

białka in vivo zapobiega neowaskularyzacji [51].

Niekontrolowany wzrost naczyń krwionośnych w przy-

padku retinopatii cukrzycowej jest przeciwieństwem upo-

śledzonej angiogenezy opisywanej zarówno u pacjentów

T1DM jak i T2DM [38,39]. Jedna z hipotez tłumaczących ten

paradoks zakłada, że w odpowiedzi na lokalną mobilizację

EPC w niedotlenionej siatkówce dochodzi do wzrostu ka-

pilar, ale ich dalsze funkcjonowanie jest upośledzone. Hi-

poteza ta została sformułowana na podstawie wyników,

które otrzymali Asnaghi i wsp., analizując EPC krążące w

krwi obwodowej osób zdrowych, cierpiących na T1DM bez

powikłań oraz T1DM współistniejącą z retinopatią cukrzy-

cową. Potencjał klonogenny EPC u pacjentów z cukrzycą

i retinopatią był większy niż u pozostałych grup. Autorzy

potwierdzili również osłabienie potencjału klonogennego

cukrzycowych EPC (od pacjentów z T1DM bez retinopa-

tii) w porównaniu do komórek osób zdrowych [52]. Także

Fadini i wsp. analizując komórki CD34(+)/KDR(+) w krwi

obwodowej pacjentów z T2DM stwierdzili, że występowa-

nie powikłań koreluje z liczebnością EPC. W porównaniu

do osób z cukrzycą bez komplikacji, pacjenci z cukrzycą i

z chorobą naczyń obwodowych mieli mniej EPC. Współ-

istnienie cukrzycy i retinopatii było natomiast związane ze

zwiększoną liczbą tych komórek [53].

MożliWośCi PoPraWy funKCjonoWania EPC

Ze względu na potencjalne znaczenie terapeutyczne EPC,

podejmowane są liczne próby poprawy ich właściwości. Ba-

dania przeprowadzone u zdrowych ochotników sugerują,

że nawet jednorazowy wysiłek fizyczny stymuluje uwalnia-

nie EPC. Rehman i wsp. opisali prawie czterokrotny wzrost

ich liczby w krwi osób poddanych ćwiczeniom w stosunku

do grupy kontrolnej [54]. Podobny efekt zaobserwowano

w przypadku regularnych ćwiczeń trwających 3 miesiące.

Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że długotrwała

gimnastyka zwiększa zarówno potencjał klonogenny EPC,

jak i ich zdolność do migracji. Autorzy udokumentowa-

li również pogorszenie funkcjonowania EPC u osób star-

szych, przy czym trend ten został częściowo odwrócony w

wyniku fizykoterapii [55].

Ćwiczenia fizyczne wpływają korzystnie na komórki

EPC nie tylko u osób zdrowych, ale także u cierpiących na

choroby układu krążenia. Poprawę liczebności, potencjału

migracyjnego i klonogennego EPC wykazano np. u pacjentów

z chorobą tętnic obwodowych poddanych regularnemu

treningowi. Efektem treningu było zwiększenie dystansu,

jaki chorzy mogli przejść bez wystąpienia dolegliwości

bólowych [56]. Ćwiczenia fizyczne miały również korzystny

wpływ na EPC u chorych z przewlekłą niewydolnością

serca, chorobą niedokrwienną serca i cukrzycą typu 2 [57,58].

Również nasze badania wykazały wzrost liczby krążących

EPC u pacjentów z miażdżycą tętnic obwodowych już w

trzy godziny po jednorazowym wysiłku na bieżni, choć

efekt taki nie był obserwowany po jednorazowym wysiłku

u pacjentów trenujących regularnie przez trzy miesiące [59].

Poprawę funkcjonowania EPC obserwuje się również

po zastosowaniu odpowiednio dobranej farmakoterapii.

Badania in vitro pokazały, że insulina stymuluje tworzenie

kapilar oraz zwiększa potencjał klonogenny EPC. Związane

jest to z aktywacją szlaku receptora dla insulinopodobnego

czynnika wzrostu-1 (IGF-1, ang. insulin-like growth factor) i

kinaz MAP (Erk1/2 i p38) [60]. Insulina wpływa także na

mobilizację komórek CD34(+)/CD133(+) u pacjentów z

cukrzycą. Wykazano, że kilkutygodniowa insulinoterapia

doprowadziła do obniżenia poziomu glikowanej hemoglo-

biny oraz do znaczącego wzrostu liczby komórek EPC w

krwi. Wyniki opublikowane ostatnio przez Fadini i wsp. po-

twierdzają, że normalizacja glikemii u pacjentów z T2DM i

makroangiopatią poddanych insulinoterapii związana jest z

poprawą kondycji naczyń krwionośnych. Towarzyszy temu

obniżenie produkcji prozapalnych białek adhezyjnych: mię-

dzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1, ang. in-

tercellular adhesion molecule-1), naczyniowej cząsteczki ad-

hezyjnej-1 (VCAM-1, ang. vascular cell adhesion molecule-1),

E-selektyny oraz zwiększenie liczby krążących EPC [61].

U chorych na cukrzycę wykazano także korzystny

wpływ na EPC agonistów receptora aktywowanego przez

proliferatory peroksysomów-gamma (PPARγ, ang. peroxi-

some proliferator-activated receptor gamma). PPARγ to czyn-

nik transkrypcyjny z nadrodziny receptorów jądrowych,

który w wyniku aktywacji tworzy heterodimer i wiąże się

do sekwencji PPRE (PPAR, ang. responsive element) na pro-

motorach genów, bezpośrednio aktywując ich transkrypcję.

Działa głównie na geny zaangażowane w regulację meta-

bolizmu lipidów i glukozy. Jego ekspresja jest najwyższa w

białej tkance tłuszczowej, a indukcja PPARγ jest warunkiem

dojrzewania adipocytów [62]. Wzrost aktywności PPARγ

zwiększa także liczbę EPC w krwi oraz poprawia ich wła-

ściwości in vitro [42,63,64]. Syntetycznymi agonistami

PPARγ, które stosowano u pacjentów z insulinoopornością

są związki z grupy tiazolidinedionów (TZD, ang. thiazolidi-

nediones) takie jak rosiglitazon i pioglitazon.

Pierwsze wyniki dotyczące wpływu TZD na funkcjono-

wanie EPC u pacjentów z T2DM opublikowali Pistrosch i

wsp. w 2005 roku. W pracy opisano wyniki trzymiesięcznej

terapii rosiglitazonem u osób z cukrzycą, w wyniku której

zaobserwowano normalizację upośledzonej migracji EPC

oraz wzrost ich liczby. Korzystne efekty utrzymywały się

nawet przez 9 tygodni od zakończenia terapii [42]. Podobne

wyniki uzyskano w przypadku dodatkowego podawania

pioglitazonu pacjentom leczonym metforminą, przy czym

w grupie leczonej dodatkowo TZD obserwowano normali-

zację parametrów biochemicznych, takich jak poziom trigli-

cerydów, lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL, ang.

very low density lipoproteins) i białka C-reaktywnego. Zarów-

no bezpośrednie jak i pośrednie działanie pioglitazonu na

EPC doprowadziło do zwiększenia ich liczby, poprawy mi-

gracji oraz nasilenia adhezji do fibronektyny i kolagenu. Za-

obserwowano również normalizację proliferacji i potencjału

klonogenennego EPC u osób poddanych terapii [65].

264

www.postepybiochemii.pl

Efekty aktywatorów PPARγ nie zależą wyłącznie od

wpływu na insulinooporność, gdyż korzystne działanie

pioglitazonu na EPC wykazano również u pacjentów z pra-

widłową tolerancją glukozy cierpiących na chorobę niedo-

krwienną serca. Trwająca 30 dni terapia zwiększała liczbę

komórek CD34(+)/KDR(+), nasilała migrację zależną od

SDF-1 i wzmacniała potencjał klonogenny in vitro [64]. Ak-

tywacja PPARγ znosiła również negatywny wpływ AGE –

stymulacja EPC rosiglitazonem zmniejszała zahamowanie

proliferacji, migracji, aktywacji Akt i fosforylacji eNOS wy-

woływane przez AGE [64].

Szczegółowe badania analizujące wpływ TZD na funk-

cjonowanie EPC pozwoliły na poznanie niektórych mecha-

nizmów odpowiedzialnych za ten proces. Do szlaków zwią-

zanych z aktywacją PPARγ przez TZD i mających korzystny

wpływ na cukrzycowe EPC zalicza się m. in. aktywację telo-

merazy w komórkach śródbłonka. Krótkotrwałe, kilkudnio-

we podawanie myszom pioglitazonu nie tylko zwiększało

liczbę EPC, ale przede wszystkim indukowało wzrost za-

wartości czynnika wiążącego telomer, typ 2 (TERF-2, ang te-

lomer repeat-binding factor 2) oraz obniżało apoptozę tych ko-

mórek [63]. Z kolei u myszy, którym podawano pioglitazon

przez miesiąc stwierdzono w komórkach aortalnych in vivo

indukcję aktywności telomerazy, wzrost syntezy TERF-2

oraz spadek zawartości białek będących markerami starze-

nia się komórek: p16 i p53. Analogiczne wyniki uzyskano

stymulując in vitro ludzkie komórki EPC, a efekty były za-

leżne od aktywacji kinazy Akt [66]. Wykazano również, że

inkubacja in vitro ludzkich EPC w obecności pioglitazonu,

podobnie jak w modelach zwierzęcych, nasila aktywność

telomerazy [67].

Nie jest natomiast jasne, na ile aktywatory PPARγ dzia-

łają bezpośrednio poprzez aktywację PPARγ, a na ile ich

aktywność jest plejotropowa i wynika z wpływu na inne

ścieżki sygnałowe. Dokładne poznanie mechanizmów dzia-

łania jest utrudnione przez brak odpowiedniego modelu

zwierzęcego, myszy pozbawionych PPARγ. Brak PPARγ

jest bowiem letalny, przy czym jednym z obserwowanych

zaburzeń jest upośledzenie unaczynienia łożyska [68], co

sugeruje bezpośrednie znaczenie PPARγ dla angiogene-

zy. Nie ma również żadnych danych wskazujących na ile

zmniejszenie zawartości lub aktywności PPARγ np. u pa-

cjentów z zespołem niewrażliwości na ligandy PPARγ, u

pacjentów z hiperhomocysteinemią lub w niektórych mo-

delach cukrzycy może wpływać na właściwości angiogenne

dojrzałych i progenitorowych komórek śródbłonka.

PoDsuMoWaniE

Zmniejszona liczba i upośledzenie funkcji EPC u osób

chorych na cukrzycę może być jednym z czynników pro-

wadzących do zwiększenia ryzyka chorób sercowo-na-

czyniowych oraz powstawania mikro- i makroangiopatii.

Wiadomo obecnie, że stosowanie leków regulujących po-

ziom glukozy poprawia funkcjonowanie EPC, przy czym

molekularne mechanizmy tego działania są różnorodne i

odmienne dla poszczególnych grup leków. Ich zrozumienie

jest niezbędne, aby w przyszłości można było skuteczniej

wykorzystać prowaskulogenne właściwości leków prze-

ciwcukrzycowych w praktyce klinicznej.

PiśMiEnniCTWo

1. Sieradzki J (2005) Cukrzyca i zespół metaboliczny, W: Szczeklik A

(red) Choroby wewnętrzne. Medycyna Praktyczna. Kraków, str. 1179-

1215

2. Luft R (1989) Oskar Minkowski: discovery of the pancreatic origin of

diabetes, 1889. Diabetologia 32: 399-401

3. Banting FG, Best CH, Collip JB, Campbell WR, Fletcher AA (1922) Pan-

creatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus. Can Med Assoc

J 12: 141-146

4. Jagielski AK, Piesiewicz A (2011) Diabetes as the challenge to 21 cen-

tury medicine-insights from clinical and biochemical investigations.

Postepy Biochem 57: 191-199

5. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ (2010) Global estimates of the preva-

lence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract 87: 4-14

6. Grzeszczak W (2011) Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u

chorych na cukrzycę. Diabetologia Praktyczna A1-A46

7. Prentki M, Nolan CJ (2006) Islet beta cell failure in type 2 diabetes. J

Clin Invest 116: 1802-1812

8. Defronzo RA (2009) Banting Lecture. From the triumvirate to the omi-

nous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mel-

litus. Diabetes 58: 773-795

9. Pettitt DJ, Lawrence JM, Beyer J, Hillier TA, Liese AD, Mayer-Davis B,

Loots B, Imperatore G, Liu L, Dolan LM, Linder B, Dabelea D (2008)

Association between maternal diabetes in utero and age at offspring’s

diagnosis of type 2 diabetes. Diabetes Care 31: 2126-2130

10. Dabelea D, Hanson RL, Lindsay RS, Pettitt DJ, Imperatore G, Gabir

MM, Roumain J, Bennett PH, Knowler WC (2000) Intrauterine expo-

sure to diabetes conveys risks for type 2 diabetes and obesity: a study

of discordant sibships. Diabetes 49: 2208-2211

11. Hemminki K, Li X, Sundquist K, Sundquist J (2009) Familial risks for

type 2 diabetes in Sweden. Diabetes Care 33: 293-297

12. Voight BF, Scott LJ, Steinthorsdottir V, Morris AP, Dina C, Welch RP,

Zeggini E, Huth C, Aulchenko YS, Thorleifsson G et al. (2010) Twelve

type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale asso-

ciation analysis. Nat Genet 42: 579-589

13. Jin T, Liu L (2008) The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and

type 2 diabetes mellitus. Mol Endocrinol 22: 2383-2392

14. Pawlak J, Derlacz RA (2011) The mechanism of insulin resistance in

peripheral tissues Postepy Biochem 57: 200-206

15. Fadini GP, Avogaro A (2010) Potential manipulation of endothelial

progenitor cells in diabetes and its complications. Diabetes Obes Me-

tab 12: 570-583

16. Schleicher E, Friess U (2007) Oxidative stress, AGE, and atherosclero-

sis. Kidney Int Suppl S17-26

17. Inoguchi T, Li P, Umeda F, Yu HY, Kakimoto M, Imamura M, Aoki

T, Etoh T, Hashimoto T, Naruse M, Sano H, Utsumi H, Nawata H

(2000) High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen

species production through protein kinase C-dependent activation of

NAD(P)H oxidase in cultured vascular cells. Diabetes 49: 1939-1945

18. Ho FM, Lin WW, Chen BC, Chao CM, Yang CR, Lin LY, Lai CC, Liu

SH, Liau CS (2006) High glucose-induced apoptosis in human vascu-

lar endothelial cells is mediated through NF-kappaB and c-Jun NH2-

-terminal kinase pathway and prevented by PI3K/Akt/eNOS path-

way. Cell Signal 18: 391-399

19. Sessa WC (2005) Regulation of endothelial derived nitric oxide in he-

alth and disease. Mem Inst Oswaldo Cruz Suppl 1: 15-18

20. Scalia R, Gong Y, Berzins B, Zhao LJ, Sharma K (2007) Hyperglycemia

is a major determinant of albumin permeability in diabetic microcircu-

lation: the role of mu-calpain. Diabetes 56: 1842-1849

21. Spinetti G, Kraenkel N, Emanueli C, Madeddu P (2008) Diabetes and

vessel wall remodelling: from mechanistic insights to regenerative the-

rapies. Cardiovasc Res 78: 265-273

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

265

22. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T,

Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM (1997) Isolation of putative

progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-967

23. Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, Ke-

arne M, Magner M, Isner JM (1999) Bone marrow origin of endothelial

progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiolo-

gical and pathological neovascularization. Circ Res 85: 221-228

24. Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Ma-

gner M, Isner JM, Asahara T (1999) Ischemia- and cytokine-induced

mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for

neovascularization. Nat Med 5: 434-438

25. Rafii S, Lyden D (2003) Therapeutic stem and progenitor cell trans-

plantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med 9:

702-712

26. Richardson MR, Yoder MC (2011) Endothelial progenitor cells: quo

vadis? J Mol Cell Cardiol 50: 266-272

27. Yoder MC, Mead LE, Prater D, Krier TR, Mroueh KN, Li F, Krasich R,

Temm CJ, Prchal JT, Ingram DA (2007) Redefining endothelial proge-

nitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell

principals. Blood 109: 1801-1809

28. Liu ZJ, Velazquez OC (2008) Hyperoxia, endothelial progenitor cell

mobilization, and diabetic wound healing. Antioxid Redox Signal 10:

1869-1882

29. Kopp HG, Ramos CA, Rafii S (2006) Contribution of endothelial pro-

genitors and proangiogenic hematopoietic cells to vascularization of

tumor and ischemic tissue. Curr Opin Hematol 13: 175-181

30. Garcia-Barros M, Paris F, Cordon-Cardo C, Lyden D, Rafii S, Haimo-

vitz-Friedman A, Fuks Z, Kolesnick R (2003) Tumor response to radio-

therapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 300: 1155-1159

31. Urbich C, Dimmeler S (2004) Endothelial progenitor cells functional

characterization. Trends Cardiovasc Med 14: 318-322

32. Urbich C, Aicher A, Heeschen C, Dernbach E, Hofmann WK, Zeiher

AM, Dimmeler S (2005) Soluble factors released by endothelial proge-

nitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident

progenitor cells. J Mol Cell Cardiol 39: 733-742

33. Di Santo S, Yang Z, Wyler von Ballmoos M, Voelzmann J, Diehm N,

Baumgartner I, Kalka C (2009) Novel cell-free strategy for therapeutic

angiogenesis: in vitro generated conditioned medium can replace pro-

genitor cell transplantation. PLoS One 4: e5643

34. Hill JM, Zalos G, Halcox JP, Schenke WH, Waclawiw MA, Quyyumi

AA, Finkel T (2003) Circulating endothelial progenitor cells, vascular

function, and cardiovascular risk. N Engl J Med 348: 593-600

35. Loomans CJ, van Haperen R, Duijs JM, Verseyden C, de Crom R, Le-

enen PJ, Drexhage HA, de Boer HC, de Koning EJ, Rabelink TJ, Staal

FJ, van Zonneveld AJ (2009) Differentiation of bone marrow-derived

endothelial progenitor cells is shifted into a proinflammatory pheno-

type by hyperglycemia. Mol Med 15: 152-159

36. Seeger FH, Haendeler J, Walter DH, Rochwalsky U, Reinhold J, Urbich

C, Rössig L, Corbaz A, Chvatchko Y, Zeiher AM, Dimmeler S (2005)

p38 mitogen-activated protein kinase downregulates endothelial pro-

genitor cells. Circulation 111: 1184-1191

37. Kuki S, Imanishi T, Kobayashi K, Matsuo Y, Obana M, Akasaka T

(2006) Hyperglycemia accelerated endothelial progenitor cell sene-

scence via the activation of p38 mitogen-activated protein kinase. Circ

J 70: 1076-1081

38. Tepper OM, Galiano RD, Capla JM, Kalka C, Gagne PJ, Jacobowitz

GR, Levine JP, Gurtner GC (2002) Human endothelial progenitor cells

from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and in-

corporation into vascular structures. Circulation 106: 2781-2786

39. Loomans CJ, de Koning EJ, Staal FJ, Rookmaaker MB, Verseyden C,

de Boer HC, Verhaar MC, Braam B, Rabelink TJ, van Zonneveld AJ

(2004) Endothelial progenitor cell dysfunction: a novel concept in the

pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes. Diabetes 53:

195-199

40. Fadini GP, Miorin M, Facco M, Bonamico S, Baesso I, Grego F, Mene-

golo M, de Kreutzenberg SV, Tiengo A, Agostini C, Avogaro A (2005)

Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral va-

scular complications of type 2 diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol 45:

1449-1457

41. Kusuyama, T, Omura T, Nishiya D, Enomoto S, Matsumoto R, Ta-

keuchi K, Yoshikawa J, Yoshiyama M (2006) Effects of treatment for

diabetes mellitus on circulating vascular progenitor cells. J Pharmacol

Sci 102: 96-102

42. Pistrosch F, Herbrig K, Oelschlaegel U, Richter S, Passauer J, Fischer S,

Gross P (2005) PPARgamma-agonist rosiglitazone increases number

and migratory activity of cultured endothelial progenitor cells. Athe-

rosclerosis 183: 163-167

43. Busik JV, Tikhonenko M, Bhatwadekar A, Opreanu M, Yakubova N,

Caballero S, Player D, Nakagawa T, Afzal A, Kielczewski J, Sochac-

ki A, Hasty S, Li Calzi S, Kim S, Duclas SK, Segal MS, Guberski DL,

Esselman WJ, Boulton ME, Grant MB (2009) Diabetic retinopathy is

associated with bone marrow neuropathy and a depressed peripheral

clock. J Exp Med 206: 2897-2906

44. Jeong JO, Kim MO, Kim H, Lee MY, Kim SW, Ii M, Lee JU, Lee J, Choi

YJ, Cho HJ, Lee N, Silver M, Wecker A, Kim DW, Yoon YS (2009) Dual

angiogenic and neurotrophic effects of bone marrow-derived endothe-

lial progenitor cells on diabetic neuropathy. Circulation 119: 699-708

45. Baum CL, Arpey CJ (2005) Normal cutaneous wound healing: clinical

correlation with cellular and molecular events. Dermatol Surg 31: 674-

686

46. Wu SC, Driver VR, Wrobel JS, Armstrong DG (2007) Foot ulcers in the

diabetic patient, prevention and treatment. Vasc Health Risk Manag

3: 65-76

47. National diabetes fact sheet: national estimates and general infor-

mation on diabetes and prediabetes in the United States, 2011., Cen-

ters for Disease Control and Prevention. Department of Health and

Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, 2011.

Atlanta, GA: U.S.

48. Barcelos LS, Duplaa C, Kränkel N, Graiani G, Invernici G, Katare R,

Siragusa M, Meloni M, Campesi I, Monica M, Simm A, Campagnolo

P, Mangialardi G, Stevanato L, Alessandri G, Emanueli C, Madeddu P

(2009) Human CD133+ progenitor cells promote the healing of diabe-

tic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and acti-

vation of Wnt signaling. Circ Res 104: 1095-1102

49. Keswani SG, Katz AB, Lim FY, Zoltick P, Radu A, Alaee D, Herlyn

M, Crombleholme TM (2004) Adenoviral mediated gene transfer of

PDGF-B enhances wound healing in type I and type II diabetic wo-

unds. Wound Repair Regen 12: 497-504

50. Grant MB, May WS, Caballero S, Brown GA, Guthrie SM, Mames RN,

Byrne BJ, Vaught T, Spoerri PE, Peck AB, Scott EW (2002) Adult hema-

topoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during

retinal neovascularization. Nat Med 8: 607-612

51. Butler JM, Guthrie SM, Koc M, Afzal A, Caballero S, Brooks HL, Ma-

mes RN, Segal MS, Grant MB, Scott EW l (2005) SDF-1 is both neces-

sary and sufficient to promote proliferative retinopathy. J Clin Invest

115: 86-93

52. Asnaghi V, Lattanzio R, Mazzolari G, Pastore MR, Ramoni A, Ma-

estroni A, Ruggieri D, Luzi L, Brancato R, Zerbini G (2006) Increased

clonogenic potential of circulating endothelial progenitor cells in pa-

tients with type 1 diabetes and proliferative retinopathy. Diabetologia

49: 1109-1111

53. Fadini GP, Sartore S, Baesso I, Lenzi M, Agostini C, Tiengo A, Avogaro

A (2006) Endothelial progenitor cells and the diabetic paradox. Diabe-

tes Care 29: 714-716

54. Rehman J, Li J, Parvathaneni L, Karlsson G, Panchal VR, Temm CJ,

Mahenthiran J, March KL (2004) Exercise acutely increases circulating

endothelial progenitor cells and monocyte-/macrophage-derived an-

giogenic cells. J Am Coll Cardiol 43: 2314-2318

55. Hoetzer GL, Van Guilder GP, Irmiger HM, Keith RS, Stauffer BL, De-

Souza CA (2007) Aging, exercise, and endothelial progenitor cell clo-

nogenic and migratory capacity in men. J Appl Physiol 102: 847-852

56. Schlager O, Giurgea A, Schuhfried O, Seidinger D, Hammer A, Gröger

M, Fialka-Moser V, Gschwandtner M, Koppensteiner R, Steiner S

(2011) Exercise training increases endothelial progenitor cells and de-

266

www.postepybiochemii.pl

Type 2 Diabetes Mellitus impairs endothelial progenitor cells functions

Jerzy Kotlinowski, Józef Dulak, Alicja Józkowicz



Department of Medical Biotechnology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 7 Gronostajowa St., 30-387

Krakow, Poland



e-mail: [e-mail]

Key words: diabetes, endothelial progenitor cells, diabetic complications

absTraCT

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a metabolic disease caused by insulin resistance that leads to changes in glucose metabolism. importan-

tly, both insulin resistance and hyperglycemia are present in T2DM patients as a hallmarks of metabolic syndrome. They negatively affect

functions of many cells, for example endothelial cells. Endothelial progenitor cells (EPC) is a population of mononuclear cells that expresses

endothelial and progenitor markers. EPC are also characterized by ability to form tubes on matrigel, outgrowth into mature endothelial cells,

produce proangiogenic factors or take part in the blood vessels formation. upon injury endothelial progenitor cells are mobilized from bone

marrow, home to injured site and take part in vessels formation. it was shown however, that functions of EPC in T2DM patients are impaired.

in this review we focused on the T2DM and its detrimental effects on EPC biology. taking also into account the beneficiary role of anti-diabet-

ic drugs. Decreased number and impaired functions of EPC in T2DM patients might lead to increased frequency of cardiovascular incidents

and development of micro- or macroangiopathies.

creases asymmetric dimethylarginine in peripheral arterial disease: A

randomized controlled trial. Atherosclerosis 217: 240-248

57. Sarto P, Balducci E, Balconi G, Fiordaliso F, Merlo L, Tuzzato G, Pap-

pagallo GL, Frigato N, Zanocco A, Forestieri C, Azzarello G, Mazzuc-

co A, Valenti MT, Alborino F, Noventa D, Vinante O, Pascotto P, Sarto-

re S, Dejana E, Latini R (2007) Effects of exercise training on endothelial

progenitor cells in patients with chronic heart failure. J Card Fail 13:

701-708

58. Reinhard H, Jacobsen PK, Lajer M, Pedersen N, Billestrup N, Man-

drup-Poulsen T, Parving HH, Rossing P (2010) Multifactorial treat-

ment increases endothelial progenitor cells in patients with type 2

diabetes. Diabetologia 53: 2129-2133

59. Nowak WN, Mika P, Nowobilski R, Kusinska K, Bukowska-Strakova

K, Nizankowski R, Józkowicz A, Szczeklik A, Dulak J (2012) Exercise

training in intermittent claudication: effects on antioxidant genes, in-

flammatory mediators and proangiogenic progenitor cells. Thromb

Haemost 108: 824-831

60. Humpert PM, Djuric Z, Zeuge U, Oikonomou D, Seregin Y, Laine K,

Eckstein V, Nawroth PP, Bierhaus A (2008) Insulin stimulates the clo-

nogenic potential of angiogenic endothelial progenitor cells by IGF-1

receptor-dependent signaling. Mol Med 14: 301-308

61. Fadini GP, de Kreutzenberg SV, Mariano V, Boscaro E, Bertolini F,

Mancuso P, Quarna J, Marescotti M, Agostini C, Tiengo A, Avogaro A

(2011) Optimized glycaemic control achieved with add-on basal insu-

lin therapy improves indexes of endothelial damage and regeneration

in type 2 diabetic patients with macroangiopathy: a randomized cross-

over trial comparing detemir versus glargine. Diabetes Obes Metab

13: 718-725

62. Koppen A, Kalkhoven E (2010) Brown vs white adipocytes: the PPAR-

gamma coregulator story. FEBS Lett 584: 3250-3259

63. Gensch C, Clever YP, Werner C, Hanhoun M, Böhm M, Laufs U (2007)

The PPAR-gamma agonist pioglitazone increases neoangiogenesis

and prevents apoptosis of endothelial progenitor cells. Atherosclero-

sis 192: 67-74

64. Werner C, Kamani CH, Gensch C, Böhm M, Laufs U (2007) The per-

oxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist pioglitazone

increases number and function of endothelial progenitor cells in pa-

tients with coronary artery disease and normal glucose tolerance. Dia-

betes 56: 2609-2615

65. Wang CH, Ting MK, Verma S, Kuo LT, Yang NI, Hsieh IC, Wang SY,

Hung A, Cherng WJ (2006) Pioglitazone increases the numbers and

improves the functional capacity of endothelial progenitor cells in pa-

tients with diabetes mellitus. Am Heart J 152: 1051 e1-8

66. Werner C, Gensch C, Pöss J, Haendeler J, Böhm M, Laufs U (2011)

Pioglitazone activates aortic telomerase and prevents stress-induced

endothelial apoptosis. Atherosclerosis 216: 23-34

67. Imanishi T, Kobayashi K, Kuroi A, Ikejima H, Akasaka T (2008) Piogli-

tazone inhibits angiotensin II-induced senescence of endothelial pro-

genitor cell. Hypertens Res 31: 757-765

68. Nadra K, Quignodon L, Sardella C, Joye E, Mucciolo A, Chrast R, Des-

vergne B (2010) PPARgamma in placental angiogenesis. Endocrinol-

ogy 151: 4969-4981