neurogenetyka w diagnostyce klinicznej

Kurs nr 13. Neurogenetyka w diagnostyce klinicznej

organizator: J. Zaremba

1. A

alliizza

a D

A w

w cch

orro

acch

h n

errw

o--m

miiê

êœœn

niio

wyycch

h n

a p

prrzzyykk³³a

dzziie

S 7

dyyssttrro

offiiii m

miiê

êœœn

niio

ejj D

ucch

e''a

a--B

ecckke

erra

a ((D

D//B

D))

ii rrd

dzze

niio

o zza

niikku

u m

miiê

êœœn

nii ((S

A))

Janusz G. Zimowski

2. A

alliizza

a D

A w

w cch

orro

acch

h n

urro

erra

accyyjjn

nyycch

h ssp

nyycch

S 7

utta

accjja

mii d

dyyn

miicczzn

nyym

mii

Anna Su³ek

3. Z

asstto

osso

niie

e tte

ecch

niikkii P

R w

w cczza

assiie

e rrzze

ecczzyyw

wiissttyym

m w

w d

diia

ossttyycce

S 7

ossiicciie

ellssttw

a rrd

dzze

niio

o zza

niikku

u m

miiê

êœœn

nii ((S

A)) o

orra

azz p

prrzzyyp

dkkó

ów

ezz d

elle

eccjjii w

w g

niie

e S

Maria Jêdrzejowska

4. W

Wyykko

orrzzyysstta

niie

e m

etto

d a

alliizzyy D

A w

w a

atta

akkssjjii F

Frriie

drre

eiicch

S 7

Tomasz Mazurczak, Dorota Hoffman-Zacharska, Anna Su³ek

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 757

Analiza DNA w chorobach nerwowo-miêœniowych na przyk³adzie dystrofii
miêœniowej Duchenne’a-Beckera (DMD/BMD) i rdzeniowego zaniku miêœni (SMA)

Janusz G. Zimowski

Zak³ad Genetyki Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie

KURS NR 13 – WYK£AD 1

brra

azz k

klliin

niicczzn

nyy d

dyyssttrro

offiiii

miiê

êœœn

niio

ejj D

ucch

e’’a

a--B

ecck

erra

((D

D//B

D))

Dystrofia miêœniowa Duchenne’a (DMD) jest ciê¿-

kim, postêpuj¹cym, nieodwracalnym zanikiem miêœni
dotykaj¹cym ch³opców. Rozpoczyna siê w wieku kilku
lat k³opotami z wstawaniem, chodzeniem po schodach,
bieganiem, niekiedy towarzyszy jej upoœledzenie umy-
s³owe. Unieruchomienie pacjenta nastêpuje w wieku
8–12 lat, a œmieræ wywo³ana niewydolnoœci¹ kr¹¿enia
lub/i oddechow¹ nastêpuje pod koniec 2. dekady ¿ycia.
Choroba wywo³ywana jest mutacj¹ dziedziczon¹ w spo-
sób recesywny, sprzê¿ony z p³ci¹ lub mutacj¹ nowo po-
wsta³¹. Czêstoœæ zachorowañ okreœla siê jako 1 na 3 500
¿ywo urodzonych ch³opców. Znana jest rzadsza, allelicz-
na postaæ choroby nazwana dystrofi¹ miêœniow¹ Becke-
ra (BMD), objawiaj¹ca siê ³agodniejszym i wolniejszym
przebiegiem ni¿ DMD. Niektórzy chorzy dotkniêci
BMD przez wiele lat zachowuj¹ zdolnoœæ do samodziel-
nego chodzenia i do¿ywaj¹ sêdziwego wieku [1].

d³³o

o¿¿e

e m

olle

ulla

arrn

e D

D//B

Pod³o¿em molekularnym obu postaci choroby jest

uszkodzenie genu dystrofiny. Ten najwiêkszy z dotych-
czas poznanych ludzkich genów, o d³ugoœci 2,5 mln nu-
kleotydów, po³o¿ony jest w cytogenetycznym pr¹¿ku
Xp21 i sk³ada siê z 79 eksonów, których ³¹czna d³ugoœæ
wynosi 14 tys. nukleotydów. Bia³kowy produkt genu –
dystrofina o ciê¿arze cz¹steczkowym 427 kD – wystêpu-
je we wszystkich w³óknach miêœniowych. Jest ona po³¹-
czona z kompleksem glikoprotein b³onowych (dystrophin
glicoprotein complex, DGC), tworz¹c strukturalno-funk-
cjonalny pomost pomiêdzy cytoszkieletem komórki
a matriks zewn¹trzkomórkow¹ [2]. Immunohistoche-
miczne barwienie skrawków w³ókien miêœniowych ujaw-

nia ca³kowity brak dystrofiny u chorych z DMD i znacz-
nie zmniejszon¹ jej iloœæ u chorych z BMD.

Wykryte w genie dystrofiny mutacje to w 60–65%

przypadków delecje, w 5–10% duplikacje i w ok. 30%
mutacje punktowe. Ostry i ³agodny przebieg choroby
t³umaczy hipoteza Monaco, która zak³ada, ¿e mutacje
naruszaj¹ce fazê odczytu powoduj¹ ca³kowity brak bia³-
ka, zaœ mutacje zachowuj¹ce fazê odczytu powstanie
uszkodzonego bia³ka (ang. truncated protein) pozbawio-
nego tej czêœci, która odpowiada zakresowi delecji [3].

Molekularna diagnostyka DMD/BMD polega na

poszukiwaniu delecji w obrêbie genu dystrofiny i jest
wykonywana za pomoc¹ reakcji PCR-multiplex z u¿y-
ciem starterów flankuj¹cych co najmniej 30 eksonów
(ryc. 1.). Niewykrycie delecji nie zaprzecza wczeœniej-
szej diagnozie. Sugeruje jedynie mo¿liwoœæ wystêpowa-
nia innego rodzaju uszkodzenia w genie dystrofiny lub
mo¿liwoœæ mutacji w innym genie, od którego mo¿e
równie¿ zale¿eæ prawid³owe funkcjonowanie miêœnia.
Poszukiwanie mutacji punktowych w tak ogromnym
genie, jakim jest gen dystrofiny, choæ mo¿liwe, jest nie-
zwykle pracoch³onne, kosztowne i rzadko stosowane,
st¹d potrzeba uzupe³niaj¹cych badañ immunohistoche-
micznych, rozstrzygaj¹cych w wypadku braku delecji.

niie

e n

ossiicciie

ellssttw

a m

utta

accjjii

wyyw

o³³u

ujj¹

¹cce

ejj D

D//B

Za przypadek rodzinny wyst¹pienia DMD/BMD

nale¿y uwa¿aæ sytuacjê, gdy kobieta ma wiêcej ni¿ jed-
nego chorego syna lub poza chorym synem mia³a cho-
rego brata lub kuzyna, ale tylko w rodzinie swojej mat-
ki. Siostry matki i siostry chorego mog¹ byæ nosicielka-
mi uszkodzonego genu dystrofiny z 50% prawdopodo-
bieñstwem. Analiza dziedziczenia poszczególnych alle-
li tego genu z zastosowaniem technik genetyki moleku-
larnej u wszystkich cz³onków rodziny (analiza dziedzi-
czenia haplotypów) daje mo¿liwoœæ okreœlenia nosiciel-

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 758

Janusz G. Zimowski

stwa z prawdopodobieñstwem bliskim 100% lub
w szczególnych przypadkach z ca³kowit¹ pewnoœci¹.

Wyst¹pienie pojedynczego (izolowanego) przypadku

DMD/BMD w rodzinie oznacza, ¿e matka jest nosi-
cielk¹ z prawdopodobieñstwem 66%; pozosta³e 33%
przypadków izolowanych powstaje w wyniku nowej mu-
tacji. Istnieje te¿ niewielka grupa kobiet, które somatycz-
nie nie s¹ nosicielkami, lecz w linii komórek rozrodczych
posiadaj¹ klon zawieraj¹cy mutacjê. S¹ to przypadki mo-
zaikowatoœci germinalnej. Dowiadujemy siê o tym, nie-
stety, jedynie w przypadku urodzenia nastêpnego chore-
go syna – wbrew przewidywaniom opartym na analizie
DNA. Wykluczenie nosicielstwa zmutowanego allelu
u matki jednego chorego ch³opca mo¿e byæ obarczone
takim w³aœnie b³êdem. Badaniem uzupe³niaj¹cym, nie-
daj¹cym pewnoœci, jest oznaczenie poziomu aktywnoœci
kinazy kreatyny (CK) w surowicy krwi kobiety podejrza-
nej o nosicielstwo. U wiêkszoœci kobiet nosicielek muta-
cji obserwuje siê podwy¿szony poziom tego enzymu.

Diia

ossttyyk

a p

prre

atta

alln

a D

D//B

Zastosowanie reakcji PCR umo¿liwia w krótkim

czasie ustalenie p³ci p³odu. Stosuje siê w tym celu am-
plifikacjê fragmentu genu amelogeniny znajduj¹cego
siê w chromosomie X, i którego defektywna kopia
obecna jest w chromosomie Y. Reakcjê wykonuje siê

z u¿yciem DNA wyizolowanego z komórek trofoblastu
lub amniocytów. Namno¿one fragmenty DNA pocho-
dz¹ce z prawid³owej i defektywnej kopii genu s¹ odpo-
wiednio wielkoœci 500 pz i 350 pz. Obecnoœæ obu pro-
duktów wskazuje p³eæ mêsk¹ i jest sygna³em do dalszych
badañ. Wykrycie delecji genu dystrofiny u p³odu ozna-
cza prenataln¹ diagnozê DMD/BMD i mo¿e byæ wska-
zaniem do zakoñczenia ci¹¿y. Podobnie jest w przypad-
ku stwierdzenie haplotypu identycznego jak u probanta.
Zarówno poszukiwanie delecji, jak i analiza haplotypów
s¹ czasoch³onne, dlatego te¿ wskazane jest wczeœniejsze
zg³aszanie siê rodzin w celu wykonania molekularnej we-
ryfikacji diagnozy klinicznej, ustalenia nosicielstwa
i przygotowania siê do diagnozy prenatalnej.

brra

azz k

klliin

niicczzn

nyy rrd

dzze

niio

zza

niik

u m

miiê

êœœn

nii ((S

A))

Proksymalny rdzeniowy zanik miêœni (spinal mu-

scular atrophy – SMA) charakteryzuje siê zwyrodnie-
niem neuronów ruchowych rogów przednich rdzenia
krêgowego i niekiedy j¹der ruchowych nerwów czasz-
kowych. Choroba prowadzi do postêpuj¹cego niedo-
w³adu po³¹czonego z zanikiem miêœni.

Najczêstsza postaæ SMA, wystêpuj¹ca u dzieci

i m³odzie¿y, dziedziczy siê w sposób autosomalny rece-
sywny i wystêpuje z czêstoœci¹ 1 na 6 000–10 000 uro-
dzeñ [1]. Ocenia siê, ¿e co 40.–50. cz³owiek jest nosi-
cielem mutacji wywo³uj¹cej SMA.

Obraz kliniczny dzieciêcego i m³odzieñczego SMA

jest bardzo zró¿nicowany. W najciê¿szych przypadkach
objawy rozpoczynaj¹ siê jeszcze w okresie p³odowym,
w naj³agodniejszych pocz¹tek objawów przypada na
wiek doros³y. Kieruj¹c siê przede wszystkim kryterium
nasilenia objawów choroby, ale bior¹c równie¿ pod
uwagê wiek zachorowania, przyjêto (International SMA
Consortium) podzia³ choroby na 3 grupy [4]:
1) typ I – choroba Werdniga-Hoffmanna (postaæ

ostra) charakteryzuj¹ca siê ostrym, uogólnionym
os³abieniem miêœni, hipotoni¹ od momentu urodze-
nia i œmierci¹ zazwyczaj przed up³ywem 2. roku ¿y-
cia. Chorzy nigdy nie osi¹gaj¹ zdolnoœci samodziel-
nego siadania.

2) typ II – postaæ poœrednia charakteryzuj¹ca siê nieco

³agodniejszym przebiegiem. Dzieci siadaj¹ samo-
dzielnie, lecz nigdy nie staj¹ i nie chodz¹ bez pomocy.
Œmieræ nastêpuje na ogó³ miêdzy 2. a 6. rokiem ¿ycia.

3) typ III – choroba Kugelberga-Welander, postaæ

m³odzieñcza charakteryzuj¹ca siê os³abieniem miê-

RRyycc.. 11.. Poszukiwanie delecji w genie dystrofiny. Produkty

PCR-multiplex roz-

dzielone w 2% ¿elu agarozowym, w obecnoœci bromku etydyny. W œcie¿ce
oznaczonej 1 i 1’ produkty reakcji z u¿yciem DNA od zdrowego mê¿czyzny
(kontrola pozytywna), w œcie¿kach 2, 2’, 3 i 3’ DNA od dwóch osób chorych,
w œcie¿ce 4 i 4’ bez u¿ycia DNA (kontrola negatywna). Pr¹¿ki wielkoœci 439
pz, 360 pz, 307 pz, 212 pz, 155 pz i 119 pz odpowiadaj¹ odpowiednio
eksonom 49, 8, 45, 53, 42 i 55 (œcie¿ki 1–4) oraz pr¹¿ki wielkoœci 506 pz,
388 pz, 271 pz, 196 pz, 149 pz i 118 pz odpowiadaj¹ odpowiednio ekso-
nom 48, 51, 50, 4, 54 i 29 (œcie¿ki 1’–4’). Strza³ka obok zdjêcia ¿elu
oznacza kierunek migracji rozdzielanych fragmentów DNA. Brak pr¹¿ka jest
wynikiem delecji. Wykryto delecje – u pacjenta 2 eksonu 45, i u pacjenta
3 eksonów 49–54

51
50

œni proksymalnych i rozpoczynaj¹ca siê po 18. mies.
¿ycia. Chorzy chodz¹ samodzielnie. D³ugoœæ ¿ycia
mo¿e byæ nawet taka sama, jak w populacji ogólnej.

d³³o

o¿¿e

e m

olle

ulla

arrn

e rrd

dzze

niio

zza

niik

u m

miiê

êœœn

nii ((S

A))

Pod³o¿em molekularnym SMA s¹ mutacje wystê-

puj¹ce w genie SMN1 (survival of motor neuron gene 1)
po³o¿onym w obszarze SMA, w cytogenetycznym
pr¹¿ku 5q11.2–13.3. W tym samym obszarze znajdu-
je siê niemal identyczna kopia tego genu oznaczana
SMN2. U wiêkszoœci chorych z SMA (95% wszyst-
kich przypadków) wykrywa siê delecje obejmuj¹ce
obie kopie genu SMN1. Pozosta³e przypadki wywo³a-
ne s¹ mutacjami punktowymi lub s¹ heterozygotami
z³o¿onymi (na jednym chromosomie mutacja punkto-
wa, na drugim – delecja). W 45% przypadków ostrej
postaci SMA i w 18% przypadków postaci poœredniej
i ³agodnej wykrywane delecje obejmuj¹ równie¿ obie
kopie po³o¿onego obok SMN1 genu NAIP (neuronal
apoptosis inhibitory protein gene). W 5% grupie osób
zdrowych wykrywa siê delecje obu kopii genu SMN2.
Obecnie uwa¿a siê, ¿e zasadnicze znaczenie w patoge-
nezie SMA maj¹ mutacje w genie SMN1, a geny
SMN2 i NAIP mog¹ mieæ jedynie znaczenie modyfi-
kuj¹ce ekspresjê kliniczn¹ choroby.

alliizza

a D

A w

w cce

ellu

u w

wyyk

krryycciia

elle

eccjjii w

w g

niie

e S

Analiza sekwencji obu kopii genów SMN ujawni³a

5 jednonukleotydowych ró¿nic, po jednej w eksonach
7 i 8, pozosta³e 3 w intronach 6 i 7. Ró¿nice sekwencji
eksonów 7 zosta³y wykorzystane do odró¿nienia genów
SMN1 i SMN2 – odpowiednio brak lub obecnoœæ
miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
DraI. Wystêpuj¹ca w obu allelach osoby chorej homo-
zygotyczna delecja powoduje brak produktów reakcji
PCR amplifikacji eksonu 7 kopii genu SMN1, a zatem
wœród produktów PCR brak jest fragmentu nieulega-
j¹cego trawieniu. W obrazie elektroforetycznym brak
jest w takim przypadku najwiêkszego pr¹¿ka (ryc. 2.).

Diia

ossttyyk

a p

prre

atta

alln

a S

Diagnostyka prenatalna, podobnie jak molekularna

weryfikacja rozpoznania klinicznego, polega na poszu-

kiwaniu homodelecji genu SMN1 w DNA wyizolowa-
nym z komórek trofoblastu lub amniocytów.

PPiiœœm

miieennnniiccttw

woo

1. Hausmanowa-Petrusewicz I. Choroby miêœni. Wyd. III. Wy-

dawnictwo Naukowe PWN, 1993.

2. Suzuki A., Yoshida M., Hayashi K., i wsp. Molecular organiza-

tion at the glycoprotein-complex-binding site of dystrophin. Eur
J Biochem 1994; 220: 283-292.

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 759

Analiza DNA w chorobach nerwowo-miêœniowych na przyk³adzie dystrofii miêœniowej Duchenne’a-Beckera (DMD/BMD) i rdzeniowego zaniku miêœni (SMA)

SMN2 Ekson 7

ttrraaw

wiieen

niiee een

nzzyym

meem

m D

Drraall

eelleek

kttrrooffoorreezzaa

SMN1 Ekson 7

miejsce rozpoznawane

przez Dral

188 bp

25 bp

163 bp

188 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

188 bp
163 bp

25 bp

RRyycc.. 22.. Schemat poszukiwania delecji w genie SMN1. Analiza obejmuje:
amplifikacjê eksonów 7 genów SMN1 i SMN2, trawienie otrzymanych pro-
duktów enzymem restrykcyjnym DraI i ich elektroforetyczny rozdzia³. Elek-
troforetyczne œcie¿ki 1, 3, 4 i 6 – osoby zdrowe, 2 i 5 – osoby chore, 7 –
kontrola negatywna (bez DNA), 8 – standard wielkoœci (100 bp DNA Lad-
der GibkoBRL). Brak pr¹¿ka 188 bp jest przejawem delecji eksonu 7 genu
SMN1

3. Monaco A.P., Bertelson C.J., Liechti-Gallati S. i wsp. An expla-

nation for the phenotypic differences between patients bearing
partial deletions of the DMD locus. Genomics 1988; 2: 90-95.

4. Pearn J. Classification of spinal muscular atrophies. Lancet

1980; 1: 919-922.

5. Lefebvre S., Burglen L., Reboullet S. i wsp. Identification and

characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.
Cell 1995; 80: 155-165.

6. Burghes AHM. When is a deletion not a deletion? When it is

coverted. Am J Hum Genet 1997; 61: 9-15.

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 760

Janusz G. Zimowski

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 761

Analiza DNA w chorobach neurodegeneracyjnych
spowodowanych mutacjami dynamicznymi

Anna Su³ek

Zak³ad Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa

KURS NR 13 – WYK£AD 2

Mutacje dynamiczne powoduj¹ce zwielokrotnienie

liczby powtórzeñ mikrosatelitarnych s¹ przyczyn¹ wie-
lu chorób zwyrodnieniowych oœrodkowego uk³adu
nerwowego. Nale¿¹ do nich m.in. choroba Huntingto-
na (HD), grupa ataksji rdzeniowo-mó¿d¿kowych
(SCA), rdzeniowo-opuszkowy zanik miêœni (SBMA),
zespó³ ³amliwego chromosomu X i dystrofie mioto-
niczne (DM1 i DM2). Najczêœciej spotykane s¹ po-
wtórzenia trójnukleotydowe, które mog¹ byæ zlokalizo-
wane zarówno w koduj¹cych czêœciach genów (HD,
SCA 1, 2, 3, 6, 7, 17, SBMA), jak i w regionach nie-
ulegaj¹cych translacji (FRAX, DM, SCA8, SCA12).
Powtórzenia mikrosatelitarne s¹ polimorficzne pod
wzglêdem ich liczby, która wystêpuje w charaktery-
stycznym dla ka¿dego genu zakresie. Zwielokrotnienie
liczby powtórzeñ i przekroczenie tego zakresu le¿y
u podstaw tzw. mutacji dynamicznych oraz procesu
chorobowego. Zmiana liczby powtórzeñ trójnukleoty-
dowych polega zazwyczaj na ich zwiêkszeniu (amplifi-
kacji); niekiedy ulega jednak zmniejszeniu (kontrak-
cji). Dok³adny mechanizm zwiêkszania liczby powtó-
rzeñ trójnukleotydowych nie jest do koñca poznany.

Wiadomo, ¿e obszary DNA zawieraj¹ce trójnukle-

otydowe powtórzenia (CAG)

* (CTG)

oraz

(CGG)

* (CCG)

mog¹ tworzyæ trójniciowe, a nawet

czteroniciowe struktury zaburzaj¹ce procesy replikacji,
naprawy i rekombinacji DNA. Jedn¹ z hipotez t³uma-
cz¹cych znaczne zwiêkszanie liczby powtórzeñ trójnu-
kleotydowych jest tzw. œlizganie siê polimerazy DNA
podczas replikacji.

Dla ka¿dego z genów ustalono specyficzny, prawi-

d³owy zakres powtórzeñ CAG, w którym ci¹g CAG
jest stabilny, tzn. nie wykazuje tendencji do ekspansji.
Nie przekracza on z regu³y 40 powtórzeñ CAG. Jed-
nak allele z du¿¹, graniczn¹ liczb¹ powtórzeñ CAG
mog¹ traciæ stabilnoœæ i ulegaæ ekspansji, co jest rów-
noznaczne z powstawaniem mutacji de novo; zosta³o to
zaobserwowane w HD i SCA3.

Allele, w których zosta³a przekroczona granica pra-

wid³owego zakresu powtórzeñ mikrosatelitarnych, wy-
krywa siê u osób chorych. Przyczyn¹ dalszego zwiêk-
szania siê liczby powtórzeñ z pokolenia na pokolenie
jest ich niestabilnoœæ w gametogenezie. W wielopoko-
leniowych rodzinach z HD lub ataksj¹ rdzeniowo-
-mó¿d¿kow¹ mo¿e siê zdarzyæ, ¿e liczba powtórzeñ
CAG osi¹gnie nawet kilkaset, co jest powodem wyst¹-
pienia objawów chorobowych we wczesnym dzieciñ-
stwie i ciê¿kiego przebiegu choroby. Zjawisko to, cha-
rakterystyczne dla wiêkszoœci typów ataksji rdzeniowo-
-mó¿d¿kowych, choroby Huntingtona i dystrofii mio-
tonicznej, okreœla siê mianem antycypacji. Jest to wiêc
coraz wczeœniejszy pocz¹tek choroby oraz coraz ciê¿-
szy jej przebieg w kolejnych pokoleniach.

W niektórych genach obserwuje siê wystêpowanie

tzw. alleli poœrednich (intermediate alleles), w których
liczba powtórzeñ wykracza poza prawid³owy zakres,
ale nie powoduje jeszcze wyst¹pienia objawów choroby.
Allele poœrednie maj¹ jednak mniejsz¹ stabilnoœæ i ist-
nieje du¿e prawdopodobieñstwo, ¿e podczas kolejnej
transmisji ulegn¹ dalszemu wyd³u¿eniu, osi¹gaj¹c za-
kres chorobotwórczy.

Ataksje rdzeniowo-mó¿d¿kowe typu 1, 2, 3, 6, 7, 17

wraz z HD i SBMA nale¿¹ do poliglutaminopatii po-
wodowanych mutacjami dynamicznymi – ze zwiêksze-
niem liczby powtórzeñ CAG w otwartej ramce odczytu,
co prowadzi do wyd³u¿enia ci¹gu poliglutaminowego
w kodowanym przez dany gen bia³ku. Obszary oœrod-
kowego uk³adu nerwowego objête zmianami to przede
wszystkim g³êbokie warstwy kory mó¿d¿ku, j¹dra pod-
stawy mózgu, pnia mózgu, j¹dro zêbate, komórki Pur-
kinjego oraz rdzeniowe i opuszkowe neurony motorycz-
ne. Jednak¿e zwi¹zek pomiêdzy zwiêkszon¹ liczb¹ reszt
glutaminowych w bia³ku a zwyrodnieniem swoistych ko-
mórek nerwowych nie zosta³ do koñca wyjaœniony.

Procesy patogenetyczne, prowadz¹ce do neurode-

generacji, maj¹ prawdopodobnie zwi¹zek z przyjêciem

przez wyd³u¿one ³añcuchy poliglutaminowe konfor-
macji nietypowej dla bia³ek, w których siê znajduj¹.
Nie powoduje to ca³kowitej utraty aktywnoœci tych bia-
³ek, a raczej wp³ywa na zmianê ich funkcji i wi¹¿e siê
z tendencj¹ do tworzenia charakterystycznych inkluzji,
g³ównie w j¹drach neuronów. W inkluzjach tych
stwierdza siê tak¿e obecnoœæ ró¿nych innych bia³ek po-
za fragmentami poliglutaminowymi.

Diagnostyka molekularna chorób powodowanych

mutacjami dynamicznymi polega na analizie DNA
prowadz¹cej do ustalenia liczby powtórzeñ mikrosateli-
tarnych w genach zwi¹zanych z wystêpowaniem po-
szczególnych ww. chorób. Potwierdzenie diagnozy kli-
nicznej i okreœlenie typu choroby jest mo¿liwe, gdy wy-
ka¿e siê, ¿e liczba powtórzeñ mikrosatelitarnych w jed-
nym z badanych genów przekracza prawid³owy zakres.

Wskazaniem do analizy DNA u pacjentów z obja-

wami choroby powinien byæ pozytywny wywiad ro-
dzinny wskazuj¹cy na dominuj¹cy sposób dziedzicze-
nia lub recesywny sprzê¿ony z p³ci¹ w przypadku
SBMA i zazwyczaj póŸny wiek zachorowania. Dane
o pacjencie powinny obejmowaæ szczegó³owy wywiad
rodzinny oraz opis badania fizykalnego – ogólnego
i neurologicznego. Ze wzglêdu na podobieñstwo obja-
wów klinicznych, wystêpuj¹cych we wszystkich posta-
ciach ataksji rdzeniowo-mó¿d¿kowych (z wyj¹tkiem
SCA7), ustalenie dok³adnego rozpoznania jest mo¿li-
we wy³¹cznie na podstawie badañ molekularnych.

Obecnie badania DNA umo¿liwiaj¹ diagnostykê

HD, SBMA oraz 7 postaci autosomalnych dominuj¹-
cych ataksji rdzeniowo-mó¿d¿kowych: SCA1, SCA2,
SCA3, SCA6, SCA7, SCA12, SCA17, jak równie¿
dystrofii miotonicznej.

Analiza DNA oparta jest na wykorzystaniu reakcji

PCR z u¿yciem starterów specyficznych dla danego ge-
nu, zlokalizowanych tak, aby amplifikacja obejmowa³a
region zawieraj¹cy powtórzenia mikrosatelitarne. Do
wizualizacji wykorzystuje siê znaczniki radioizotopowe
lub fluorescencyjne. Nastêpnym etapem jest rozdzia³
elektroforetyczny otrzymanych produktów reakcji
w ¿elach poliakrylamidowych i ocena wielkoœci tych
produktów z odniesieniem do standardu wielkoœci.
Uzyskan¹ liczbê powtórzeñ porównuje siê z charakte-
rystycznym dla badanego genu prawid³owym zakre-
sem. W przypadku powtórzeñ mikrosatelitarnych zlo-
kalizowanych w niekoduj¹cych regionach genu obser-
wowany stopieñ niestabilnoœci mo¿e byæ znacznie wiêk-
szy i mutacje dynamiczne mog¹ prowadziæ do ekspan-
sji licz¹cych kilkaset, a nawet kilka tysiêcy powtórzeñ
(dotyczy to dystrofii miotonicznej). Wówczas klasyczna

reakcja PCR jest niewystarczaj¹ca i konieczne staje siê
zastosowanie modyfikowanych metod z u¿yciem starte-
rów, z których jeden jest specyficzny dla danego genu,
a drugi dla sekwencji mikrosatelitarnej. Ta metoda nie
umo¿liwia jednak okreœlenia liczby powtórzeñ, wiêc
w przypadkach, w których jest to niezbêdne, stosuje siê
technikê hybrydyzacji (Southern blot).

W chorobach o dziedziczeniu autosomalnym do-

minuj¹cym prawdopodobieñstwo zachorowania dzieci
chorego rodzica wynosi 50%. Wykorzystanie badañ
molekularnych w diagnozowaniu chorób neurodege-
neracyjnych ma du¿e znaczenie w poradnictwie gene-
tycznym. Pacjentowi i jego rodzinie mo¿na zapropo-
nowaæ nastêpuj¹ce rodzaje badañ:
• badanie diagnostyczne – poszukiwanie mutacji dy-

namicznych w genach zwi¹zanych z wystêpowaniem
klinicznych objawów choroby,

• badanie przedobjawowe – wykonywane na ¿yczenie

pe³noletnich osób z rodziny, w której wczeœniej na
podstawie badañ molekularnych u probanta ustalo-
no rozpoznanie choroby,

• badania prenatalne – analiza DNA p³odu, jeœli

u jednego z rodziców stwierdzono uprzednio wystê-
powanie ekspansji powtórzeñ mikrosatelitarnych.

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 762

Anna Su³ek

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 763

Zastosowanie techniki PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce nosicielstwa
rdzeniowego zaniku miêœni (SMA) oraz przypadków bez delecji w genie

SMN1

Maria Jêdrzejowska

Zespó³ Badawczy Chorób Nerwowo-Miêœniowych, Instytut Medycyny Doœwiadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa

KURS NR 13 – WYK£AD 3

Dosiebny dzieciêcy i m³odzieñczy rdzeniowy zanik

miêœni (spinal muscular atrophy – SMA) jest chorob¹ ge-
netycznie uwarunkowan¹, dziedziczon¹ jako cecha auto-
somalna recesywna. W przebiegu choroby dochodzi do
utraty motoneuronów rdzenia krêgowego, co w konse-
kwencji prowadzi do postêpuj¹cego niedow³adu i zani-
ku miêœni. Czêstoœæ wystêpowania SMA szacuje siê 1 na
7–10 tys. urodzeñ, co odpowiada czêstoœci nosicielstwa
zmutowanego genu od 1 na 42 do 1 na 50 osób.

Genem, którego mutacje determinuj¹ wyst¹pienie

objawów choroby, jest gen SMN1 (5q11.2) (survival of
motor neuron gene, gen warunkuj¹cy prze¿ycie motoneu-
ronów). W polskiej populacji chorych 96,6% tych mu-
tacji stanowi obualleliczna delecja eksonu 7 [1]. W ok.
2–3% przypadków za objawy choroby odpowiedzialne
s¹ mutacje punktowe, wystêpuj¹ce w uk³adzie heterozy-
gotycznym z delecj¹. W pozosta³ym odsetku pod³o¿e
genetyczne choroby nie jest znane.

W tym samym regionie chromosomu 5q wystêpuje

drugi, niemal identyczny gen SMN2. Jego obecnoœæ
³agodzi objawy SMA, z drugiej strony utrudnia ocenê
stanu nosicielstwa zmutowanego genu i identyfikacjê
przypadków zwi¹zanych z mutacjami punktowymi.

Jednorodnoœæ defektu molekularnego sprawi³a, ¿e ba-

danie obecnoœci delecji w genie SMN1 sta³o siê badaniem
podstawowym w diagnostyce SMA. W badaniu tym,
opartym na technice PCR i trawieniu enzymem restryk-
cyjnym, wykorzystana jest jednonukleotydowa ró¿nica
pomiêdzy genem SMN1 i SMN2 w sekwencji ekso-
nu 7 [2]. Badanie nie daje jednak mo¿liwoœci okreœlenia
liczby uszkodzonych alleli, a tym samym identyfikacji
osób z delecj¹ tylko na jednym allelu (nosicieli). Nie da-
je tak¿e mo¿liwoœci identyfikacji chorego z delecj¹ na
jednym allelu i mutacj¹ punktow¹ na drugim. W obu
przypadkach uzyskiwany wynik jest to¿samy z wyni-
kiem badania osoby zdrowej, która nie jest nosicielem

RRyycc.. 11.. Obraz elektroforezy na ¿elu agarozowym produktów amplifikacji eksonu 7 genu

SMN1, trawionych enzymem restrykcyjnym DraI: 1 – pacjent (widoczny je-

dynie fragment odpowiadaj¹cy kopii centromerowej genu), 2 – osoba zdrowa (obecna kopia genu

SMN1 i SMN2); identyczny wynik uzyskamy u nosiciela choroby

i u osoby chorej, której objawy wywo³ane s¹ obecnoœci¹ mutacji punktowej

SMN2

SMN1

SMN2

SMN1

1 2

2 3

3 M

(ryc. 1.). Podobieñstwo genów SMN1 i SMN2 utrud-
nia tak¿e interpretacjê wyników sekwencjonowania.
W trakcie namna¿ania matrycy amplifikuj¹ siê obie ko-
pie genu i obie s¹ równoczeœnie sekwencjonowane. Dla-
tego tak trudna jest identyfikacja mutacji punktowych.
Wymaga ona w³aœciwie stosowania RT-PCR, techniki
rzadko u¿ywanej w procedurach diagnostycznych.

Nowe mo¿liwoœci badania nosicielstwa pojawi³y siê

w momencie opracowania techniki iloœciowej – real-ti-
me PCR (PCR w czasie rzeczywistym) [3]. Dziêki
iloœciowej ocenie produktu reakcji PCR metoda ta sta-
je siê doskona³ym narzêdziem w ocenie dawki genu.
Podstawowym parametrem ocenianym w tej metodzie
jest C

(threshold cycle, cykl progowy) – cykl, w którym

reakcja PCR zachodzi w sposób liniowy, a tym samym
liczba powsta³ych w tym okresie cz¹steczek jest wprost
proporcjonalna do wyjœciowej liczby cz¹steczek. Po-
równuj¹c ró¿nicê C

badanego genu (SMN1) i genu

reporterowego o sta³ej znanej liczbie kopii (RN-asa)
do ró¿nicy C

genu wzorcowego (znana liczba kopii

SMN1) i genu reporterowego mo¿emy oceniæ dawkê
badanego genu (1 lub 2 kopie) (ryc. 2.).

Obecnoœæ dwukrotnie obni¿onej liczby kopii

SMN1 (jedna kopia) w porównaniu z kontrol¹ (dwie
kopie) œwiadczy o nosicielstwie SMA.

Metodykê powy¿szego badania przedstawiono na

³amach Neurologii i Neurochirurgii Polskiej w bie¿¹cym
roku [1].

Istotn¹ wad¹ iloœciowego PCR jest mo¿liwoœæ uzy-

skania wyniku fa³szywie ujemnego. Wed³ug badañ nie-
mieckich na ok. 2% alleli wystêpuj¹ 2 kopie genu
SMN1 (4). Jeœli zatem badana osoba bêdzie mia³a na
jednym allelu delecjê, a na drugim duplikacjê genu
SMN1, wynik badania iloœciowego oka¿e siê fa³szywie
ujemny. Badanie to nie daje tak¿e mo¿liwoœci identyfi-
kacji nosicielstwa mutacji punktowych. Przedstawione
problemy interpretacyjne obni¿aj¹ czu³oœæ metody ilo-
œciowej o ok. 5–6%.

Badania nosicielstwa w SMA prowadzone s¹

w Polsce od tego roku, w ramach badañ naukowych.
Istnieje wielka potrzeba, by badanie to przesz³o do
standardów diagnostycznych. Brak badania nosiciel-
stwa w rodzinach wysokiego ryzyka SMA rodzi bo-
wiem powa¿ne problemy w poradnictwie genetycz-
nym. W przypadku rodziców – niemal obligatoryj-
nych nosicieli, ryzyko powtórzenia choroby wynosi
25%. W przypadku zdrowego rodzeñstwa ryzyko wy-
st¹pienia choroby u ich potomstwa wynosi od 1:200 do
1:300 (w zale¿noœci od czêstoœci nosicielstwa w popu-
lacji – 1:34–1:50). Nie jest ono wysokie, ale wy¿sze
ni¿ populacyjne. Podwy¿szone ryzyko wyst¹pienia
choroby u potomstwa wp³ywa na decyzje prokreacyjne
rodzin. W przypadku aberracji chromosomowych ta-
kie ryzyko oceniane jest jako wskazanie do badania
prenatalnego. Wykluczenie nosicielstwa u cz³onków
rodzin czy u partnera nosiciela choroby u³atwia porad-

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 764

Maria Jêdrzejowska

RRyycc.. 22.. Wynik amplifikacji genu SMN1 metod¹

real-time PCR zdrowej kontroli i nosiciela. Ró¿nica jednego cyklu w

∆C

miêdzy badanymi osobami œwiadczy o dwu-

krotnie mniejszej iloœci produktu PCR w przypadku B, a zatem dwukrotnie mniejszej dawce genu, co jest równoznaczne ze stwierdzeniem stanu nosicielstwa

N--aazzaa

∆∆C

N--aazzaa

∆∆C

SMN1

SMN2

SMN1

niiee--n

noossiicciieell

nictwo genetyczne, a osoby z rodzin ryzyka nie staj¹
przed koniecznoœci¹ podejmowania trudnych decyzji
dotycz¹cych badañ prenatalnych. Badanie nosicielstwa
rozwi¹zuje tak¿e problem ma³¿eñstw, których dziecko
zmar³o z podejrzeniem SMA, a nie wykonano diagno-
styki molekularnej.

Technika real-time PCR mo¿e zostaæ wykorzystana

jako przesiewowa metoda poszukiwania mutacji punk-
towych u pacjentów niewykazuj¹cych homozygotycz-
nej delecji w genie SMN1. Uzyskiwany wynik badania
molekularnego opartego na technice PCR weryfikuje
96,6% przypadków SMA. W pozosta³ych przypad-
kach wynik jest nieinformatywny. Brak homozygotycz-
nej delecji nie potwierdza, ale i nie wyklucza choroby.
Za objawy mog¹ byæ odpowiedzialne mutacje punkto-
we, nieidentyfikowane w badaniu przesiewowym.
Stwierdzenie obni¿onej liczby kopii genu SMN1
u chorego bez obuallelicznej delecji sugeruje udzia³
mutacji punktowej w patogenezie choroby (uk³ad he-
terozygotyczny mutacji punktowej i delecji) i jest
wskazaniem do poszerzenia diagnostyki molekularnej.

PPiiœœm

miieennnniiccttw

woo

1. Jêdrzejowska M., Wiszniewski W., Zimowski J. i wsp. Applica-

tion of a rapid non-invasive technique in the molecular diagno-
sis of spinal muscular atrophy (SMA). Neurol Neurochir Pol
2005; 39: 89-94.

2. Van der Steege G., Grootscholten P., Van der Vlies P. i wsp.

PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal
recessive spinal muscular atrophy. Lancet 1995; 345: 985-986.

3. http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html
4. Feldkotter M., Schwarzer V., Wirth R. i wsp. Quantitative ana-

lyses of SMN1 and SMN2 based on real time light Cycler PCR:
fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity
of spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet 2002; 70: 358-368.

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 765

Zastosowanie techniki PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce nosicielstwa rdzeniowego zaniku miêœni (SMA) oraz przypadków bez delecji w genie

SMN1

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 766

Wykorzystanie metod analizy DNA w ataksji Friedreicha

Tomasz Mazurczak

, Dorota Hoffman-Zacharska

, Anna Su³ek

Klinika Neurologii, Epileptologii i Zaburzeñ Snu u Dzieci i M³odzie¿y, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

Pracownia Neurogenetyki, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

Zak³ad Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie

KURS NR 13 – WYK£AD 4

Ataksja Friedreicha (Friedreich ataxia, FRDA)

(MIM 229300) jest postêpuj¹c¹ chorob¹ wielouk³ado-
w¹, dziedzicz¹c¹ siê jako cecha autosomalna recesyw-
na. Choroba ujawnia siê zazwyczaj przed okresem doj-
rzewania. Jest jedn¹ z najczêstszych form ataksji dzie-
dzicznych. Czêstoœæ wystêpowania FRDA w populacji
kaukaskiej szacuje siê na 1:50 000, a czêstoœæ nosiciel-
stwa zmutowanego genu na 1:90 [1,3,4]. Kryteria dia-
gnostyczne FRDA obejmuj¹: ujawnienie siê choroby
przed 25. rokiem ¿ycia, bez³ad koñczyn i tu³owia, za-
nik odruchów g³êbokich w koñczynach dolnych, objaw
Babiñskiego, znaczne zwolnienie szybkoœci lub brak
przewodzenia we w³óknach czuciowych przy prawid³o-
wym przewodzeniu we w³óknach ruchowych koñczyn
górnych, zaburzenia mowy. Ponadto stwierdza siê
skrzywienie boczne krêgos³upa, zanik odruchów g³ê-
bokich w koñczynach górnych, kardiomiopatiê przero-
stow¹, nieprawid³owe EKG, zniekszta³cenie stóp, za-
nik nerwów wzrokowych, g³uchotê, zaniki miêœniowe,
zez obuoczny oraz cukrzycê [4]. Wyst¹pienie FRDA
zwi¹zane jest z mutacjami w obrêbie po³o¿onego na
chromosomie 9q13 genu FRDA1 (MIM 606829), ko-
duj¹cego frataksynê – bia³ko pe³ni¹ce istotn¹ rolê w re-
gulacji transportu jonów ¿elaza w mitochondrium.
U 96% pacjentów jest to tzw. mutacja dynamiczna –
ekspansja powtórzeñ GAA w pierwszym intronie ge-
nu, na obu jego allelach. W przypadku 4% pacjentów
s¹ to wspó³istniej¹ce z ekspansj¹ powtórzeñ mutacje
punktowe na drugim allelu genu [1,3]. Zró¿nicowanie
obrazu klinicznego u chorych z ekspansj¹ trypletów
[GAA]

w uk³adzie homozygotycznym jest wynikiem

polimorfizmu powtórzeñ w zakresie patogennym. Za-
kres powtórzeñ u pacjentów waha siê w granicach
66–1 700, przy czym w najczêœciej wystêpuj¹cej posta-
ci FRDA wynosi zazwyczaj 200–1 700. Rzadsze po-
stacie FRDA, ujawniaj¹ce siê w póŸniejszym okresie
¿ycia (po 25. roku ¿ycia) – LOFA/VLOFA (Late/Ve-

ry Late Onset Friedreich Ataxia) czy FARR (Friedreich
Ataxia with Retained Reflexes) – charakteryzuj¹ siê
mniejsz¹ liczb¹ powtórzeñ [1,3,4]. Poznanie defektu
molekularnego prowadz¹cego do wyst¹pienia FRDA
umo¿liwi³o opracowanie zasad diagnostyki molekular-
nej tej choroby. Ma to istotne znaczenie zarówno dla
weryfikacji rozpoznania klinicznego i opracowania
optymalnego programu terapeutycznego dla chorego,
jak równie¿ objêcia jego rodziny poradnictwem gene-
tycznym. Obecnie rutynowa diagnostyka FRDA opie-
ra siê na zastosowaniu reakcji ³añcuchowej polimerazy
(PCR), która jest uzupe³niana metod¹ hybrydyzacyj-
n¹. Stwierdzenie braku produktu w standardowej reak-
cji PCR wskazuje na obecnoœæ ekspansji na dwóch al-
lelach genu. Metoda ta nie pozwala jednak na rozró¿-
nienie homozygot dla alleli prawid³owych od heterozy-
gotycznych nosicieli. Do wykrywania obecnoœci d³u-
gich alleli stosuje siê metodê long PCR, która jednak
mo¿e prowadziæ do uzyskiwania wyników fa³szywie
dodatnich. Raport z Programu kontroli jakoœci diagnosty-
ki FRDA, który zosta³ przeprowadzony w 2002 r.
przez EMQN (European Molecular Genetics Quality
Network), wskazywa³ na b³¹d genotypowania heterozy-
got na poziomie 11,7%. Wyniki te potwierdzi³y ko-
niecznoœæ wprowadzenia dodatkowych procedur dia-
gnostycznych. Metod¹ z wyboru weryfikacji takich
wyników jest zastosowanie hybrydyzacji metod¹
Southerna, która jako technika pracoch³onna i d³ugo-
trwa³a, a przy niezbyt du¿ej liczbie pacjentów kosztow-
na, nie jest powszechnie stosowana. Opracowanie no-
wych technik PCR do analizy obszarów o du¿ej liczbie
powtórzeñ trójnukleotydowych TP-PCR (zastosowa-
nie primerów specyficznych do rejonów flankuj¹cych
powtórzenia GAA) znacznie usprawnia diagnostykê
rutynow¹ i pozwala na szybkie okreœlenie nosicielstwa
ekspansji u krewnych probanta z FRDA. Pozwala te¿
na wyodrêbnienie grupy pacjentów, u których mog¹

wystêpowaæ mutacje punktowe na jednym z alleli. Dla-
tego te¿ ta metoda zaczyna byæ wprowadzana jako ba-
danie uzupe³niaj¹ce, umo¿liwiaj¹ce szybkie i efektyw-
ne wyszukiwanie nosicieli ekspansji powtórzeñ
[GAA]

[2,5]. Celem prezentowanej pracy jest cha-

rakterystyka defektu molekularnego u pacjentów skie-
rowanych do Poradni Genetycznej i Kliniki Neurolo-
gii IMiDz z rozpoznaniem FRDA oraz ich krewnych.

PPiiœœm

miieennnniiccttw

woo

1. Campuzano V., Montermini L., Molto M.D. i wsp. Friedreich’s

ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA
triplet repeat expansion. Science 1996; 271: 1423-1427.

2. Ciotti P., DiMaria E., Bellone E. i wsp. Triplet repeat primed

PCR (TP PCR) in molecular diagnostic testing for Friedreich
ataxia. J Mol Diagn 2004; 6: 285-289.

3. De Michele G., Filla A. Cavalcanti F. The correlation of clini-

cal phenotype in Friedreich ataxia with the site of point mutation
in the FRDA gene. Neurogenetics 1998; 1: 253-257.

4. Harding A.E. Friedreich’s ataxia: a clinical and genetic study of

90 families with an analysis of early diagnostic criteria and intra-
familial clustering of clinical features. Brain 1981; 104: 589-620.

5. Schmitt M., Warner J., Barron L. i wsp. Detection of large

(GAA) n repeat expansions by fluorescent PCR. European So-
ciety for Human Genetics, 2000. Poster presentation.

NNeeuurroollooggiiaa ii NNeeuurroocchhiirruurrggiiaa PPoollsskkaa 2005; 39, 4 (supl. 3)

S 767

Wykorzystanie metod analizy DNA w ataksji Friedreicha

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Diagnoza kliniczna
Problemy z Psychologiczną Diagnozą kliniczną
DIAGNOSTYKA KLINICZNA
Wspólne enzymów wykorzystywanych w diagnostyce klinicznej obejmują, Lekarski WLK SUM, lekarski, bioc
Diagnoza kliniczna
DIAGNOSTYKA KLINICZNA, Wykłady-Ronikier, Ronikier1
DIAGNOSTYKA KLINICZNA, Wykłady-Ronikier
Rysunek dziecka jako element diagnostyki klinicznej, Materiały nieposegregowane, NAUKA DZIECKA
Diagnostyka kliniczna, Studia - Hodowla Zwierząt, Higiena, profilaktyka, dobrostan zwierząt
Serce i układ naczyniowy, UWM Weterynaria, Diagnostyka kliniczna i laboratoryjna
Moczenie nocne diagnoza kliniczna i metody leczenia
diagno 3 kolo krew Spużak, Studia, Diagnostyka kliniczna, sem. 1
Praktyk, UWM Weterynaria, Diagnostyka kliniczna i laboratoryjna
Zagadki tor Nieradki, UWM Weterynaria, Diagnostyka kliniczna i laboratoryjna
Diagnostyka kliniczna stawow kr Nieznany
KLIRENS KREATYNINY, Studia, Propedeutyka Diagnostyki Klinicznej

więcej podobnych podstron