1

Ćwiczenie 6

OZNACZANIE NIEORGANICZNEGO FOSFORANU

METODĄ FISKE-SUBBAROWA

Część doświadczalna obejmuje:

−

przygotowanie rozcieńczonych roztworów KH

2

PO

4

−

wykonanie oznaczeń

−

wykreślenie krzywej kalibracyjnej i wyliczenie średniego współczynnika kierunkowego

WPROWADZENIE

Ilościowe oznaczanie fosforanów metodą Fiske-Subbarowa oparte jest na reakcji jonów or-

tofosforanowych (V) z molibdenianem (VI) amonu w środowisku kwaśnym. Powstającą

w wyniku reakcji sól amonową kwasu czterotrójmolibdenianofosforowego poddaje się re-

dukcji kwasem 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowym (eikonogen). W wyniku tej reakcji, molib-

denian (VI) związany w soli kompleksowej ulega redukcji do niższych tlenków molibdenu

dając tzw. błękit molibdenowy (maksimum absorpcji przy 660nm).

PO

4

-3

(NH

4

)

3

P(Mo

3

O

10

)

4

(Mo

2

O

5

· MoO

3

)

błękit molibdenowy

Po wykonaniu reakcji barwnej przeprowadza się pomiar absorbancji przy długości fali

λ =

660 nm. Zawartość fosforanu w badanej próbie określa się na podstawie wyznaczonej

dla wzorcowych roztworów ortofosforanu (V) zależności ich absorbancji od stężenia.

WYKONANIE

Odczynniki:

1.

50mM bufor Tris-HCl, pH 8,6

2.

10% roztwór TCA

3.

5M H

2

SO

4

(NH

4

)

2

MoO

4

odczynnik redukujący
(eikonogen)

2

4.

2,5% roztwór molibdenianu (VI) amonu w 0,25 M H

2

SO

4

5.

0,25% eikonogen (kwas 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowy). Rozpuścić w wodzie 7,5 g

Na

2

S

2

O

5

i 1 g Na

2

SO

3

w kolbie miarowej na 100 ml, a następnie dodać 0,25 g eikonoge-

nu. Uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór przechowywany w ciemnej, szczelnie zamkniętej

butelce jest trwały przez kilka tygodni.

6.

40 mM roztwór KH

2

PO

4

.

Wyznaczanie krzywej standardowej:

1.

W 100 ml kolbce miarowej przygotować 40 mM roztwór wyjściowy KH

2

PO

4

w 50 mM

buforze Tris-HCl, pH 8,6, z którego następnie należy sporządzić roztwory o stężeniu: 0,4

mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM, 2,0 mM, 3,2 mM i 4,0 mM, używając do rozcieńczeń

50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6. Rozcieńczenia przygotować w 50 ml kolbkach miaro-

wych.

2.

Do 16 oznakowanych probówek odmierzyć po 0,9 ml 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6.

Do każdej probówki dodać po 0,1 ml roztworu fosforanu o odpowiednim stężeniu (dla

każdego stężenia wykonać dwie równoległe próby). Do prób zerowych (odniesienia)

zamiast fosforanu napipetować po 0,1 ml H

2

O destylowanej (Uwaga! Wymienić końców-

kę pipety przed pipetowaniem wody)

3.

Do każdej próby dodać kolejno: 0,5 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA), a

następnie po 0,4 ml mieszaniny zawierającej: 5M H

2

SO

4

, 2,5% molibdenian (VI) amonu,

wodę dest. zmieszanych w stosunku 1 :2 :1. Próby dokładnie wytrząsnąć, a następnie na-

pipetować po 0,1 ml eikonogenu. Próby, po wytrząśnięciu, wstawić na 10 minut do łaźni

wodnej o temperaturze 30

0

C w celu przyspieszenia reakcji powstawania błękitu molib-

denowego.

4.

Zmierzyć absorbancję prób wobec próby zerowej (odniesienia) przy λ = 660nm. Obli-

czyć wartości średnie absorbancji z dwóch powtórzeń. Wykreślić krzywą standardową,

odkładając absorbancję na osi rzędnych, a stężenie ortofosforanu w badanych próbach na

osi odciętych.

3

5.

Obliczyć zawartość fosforanu w kolejnych próbach (ilość powinna być podana w µµµµmo-

lach). Obliczyć wartości współczynnika kierunkowego (k), a następnie średniego współ-

czynnika kierunkowego:

Zagadnienia do przygotowania:

−

roztwory (stężenia procentowe, roztwory molowe, rozcieńczenia, przeliczenia)

−

kolorymetria

Literatura:

Ć

wiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN Warszawa, 2005

Obliczenia biochemiczne – Zgirski A, Gondko R, PWN Warszawa, 1998

k =

µmole KH

2

PO

4

w próbie

A

660nm