Biologia Molekularna Komórki:

Współczesne metody stosowane w badaniach
komórek roślinnych i zwierzęcych na poziomie
komórkowym.

Pierwsze Mikroskopy

(Hooke)

1665

Chronologia badań

jądra komórki I

Wstępne przygotowanie materiału :

Przygotowanie szkiełek podstawowych :

Żelatyna, poli-lizyna, silan, Biobond itp..

Utrawlenie materiału :

fizyczne

chemiczne

Aldehyd glutarowy

Aldehyd glutarowy reaguje z wieloma grupami funkcyjnymi
w komórce doprowadzając do tworzenia licznych wiązań
krzyżowych. Poza grupami aminowymi, które jak
wiadomo występują w każdej cząsteczce aminokwasu,
zdolność do reakcji z aldehydem glutarowym wykazano
także dla grupy sulfhydrylowej cysteiny oraz azotu
obecnego w pierścieniu imidazolowym histydyny. Należy
zaznaczyć, że nie wszystkie grupy aminowe białek
dostępne są podczas reakcji z aldehydem glutarowym.
Stosunek związanych krzyżowo grup aminowych do
wolnych wynosi 2:1. Wykazano ponadto pozytywną
korelację pomiędzy efektywnością tworzenia wiązań
krzyżowych z udziałem aldehydu glutarowego a pH
środowiska.

Formaldehyd

Silnie wiąże się z białkami
Wykazano, iż formaldehyd znacznie słabiej wiąże lipidy
komórkowe.
W reakcji tej biorą udział prawdopodobnie nienasycone kwasy
tłuszczowe lipidów, a konkretnie podwójne wiązania.

Kwasy nukleinowe względnie silnie wiążą się z formaldehydem.
Cząsteczki utrwalacza reagują przypuszczalnie z grupami
aminowymi zasad azotowych obecnych w łańcuchu
polinukleotydowym, jak również z białkami związanymi z DNA,
głównie histonami. Utrwalanie węglowodanów przy użyciu
formaldehydu jest mało wydajne toteż niewiele wiadomo na temat
chemicznej natury tej reakcji.

CZTEROTLENEK OSMU (OsO4)

Czterotlenek osmu stosowany jest zazwyczaj po

wstępnym utrwalaniu w aldehydzie glutarowym lub

formaldehydzie (tzw. postfiksacja, utrwalanie wtórne).

Związek ten reaguje względnie szybko ze składnikami

komórki, które nie zostały wcześniej związane przez

aldehydy, przede wszystkim z nienasyconymi

łańcuchami kwasów tłuszczowych obecnych w lipidach

błonowych. Ponieważ osm jest metalem ciężkim, związany

przez lipidy nadaje kontrast dla większości błonowych

struktur komórkowych. Potwierdzono również zdolność

reakcji OsO4 z innymi grupami funkcyjnymi m.in.

aminowymi i sulfhydrylowymi, co wskazuje na
możliwość tworzenia wiązań krzyżowych białek z

udziałem tego związku.

SKŁADNIK CHEMICZNY

BIAŁKA

LIPIDY

KWASY

NUKLEIN

OWE

WĘGLOWO
DANY

UTRWALACZ

STOPIEŃ UTRWALENIA

GLUTARALDEHYD

+ + +

+

+

+ +

FORMALDEHYD

+ + +

+

+ +

+

CZTEROTLENEK

OSMU

+ +

+ + +

+ +

+

Tab. Efektywność glutaraldehydu, formaldehydu i czterotlenku

osmu

podczas utrwalania podstawowych składników chemicznych

komórki

+++ - bardzo silny, ++ - silny, + - słaby

Reakcje immunocytochemiczne:

Antygeny

białkowe,

polisacharydowe,

lipidowe,

kwasy

nukleinowe

Typy znaczników:

Enzymy – reakcja cytochemiczna np. alkaliczna fosfataza,
peroksydaza chrzanowa, B- galaktozydazę...

Biotyna-awidyna (streptawidyna)

Białka zawierające metale ciężkie – Ferrytyna (m.cz. ok. 600
000, zawiera 23% żelaza)

Pierwiastki promieniotwórcze

Typy znaczników:

System immuno –złotowy, -immunosrebrowy