Przykład metody FRAP= Fluorescence Recovery After

Photobleaching :

Figure 1. Monitoring the

fluorescence before photobleaching

Figure 2. Monitoring the

fluorescence after photobleaching

Figure 3. Monitoring the recovery

of fluorescence after

photobleaching

Figure 4. Graphical presentation of data collected
during a FRAP experiment. A baseline of
fluorescence is collected (1) before the
photobleaching occurs (arrow) so that the amount of
fluorescence is reduced significantly (2). Over time,
the amount of fluorescence in the photobleached
area increases as unbleached molecules diffuse into
this area (3). Later, there is a stabilization of the
amount of fluorescence recovery (4) and a flat line is
obtained. The percent recovery uses the formula: (Y/
X) x 100 = % recovery. In the diagram, the
percentage of fluorescence lost due to
photobleaching is X and the amount of fluorescence
that returned to the bleached area is Y. In practice,
the percent recovery almost never reaches 100%.
The lateral mobility is determined by the slope of the
curve (3). The steeper the curve, the faster the
recovery and therefore, the more mobile the
molecules.

Metoda FRAP

Wyniki analizy dynamiki pol II metodą FRAP :

Kinetyka pol – GFP

metoda FLIP

:

Przemieszczanie białek GFP-SMN między jądrem

a cytoplazmą

Zaobserwowano

spadek intensywności
sygnału GFP-SMN w
jądrze, w ciałach Cajala

Badanie dynamiki GFP-pol II metoodą iFRAP :

FRET –

FRET – F

F

luorescencyjny

luorescencyjny E

E

nergii

nergii T

T

ransfer

ransfer

Potrafimy już wykrywać białka w żywej komórce.

Jak obserwować DNA czy RNA w żywej komórce?

Metody pośrednie:

np. histonowe białka fuzyjne, fuzyjne białka SSB

Wklonowywanie fragmentów markerowych DNA

w określone miejsca w genomie

przykład: represor-laktozowy

Obecnie dostępne technologie do detekcji genów w
komórkach,

takie jak in situ hybrydyzacja czy in situ PCR

nie pozwalają na detekcje in vivo

ponieważ linearne sondy używane w tych próbach

muszą być odpłukane po hybrydyzacji

aby zmiejszyć różnice miedzy sygnałem a tłem.

FISH: od in situ do in vivo - Nowe perspektywy

Aby można to zrobić sonda musi rozpoznawać cel

(szukany gen lub transkrypt) z dużą wydajnością,

a następnie po hybrydyzacji stać się wykrywalna,

wykazywać dużą różnicę miedzy tłem a sygnałem

pozwalając rozróżnić pozytywne i fałszywie pozytywne
wyniki.

Próba musi również wnikać do komórek z dużą
wydajnością.

Pomiędzy obecnie dostępnymi technologiami do
detekcji

kwasów nukleinowych w żywch komórkach
najbardziej

obiecująca wydaje się technologia

Molecular

Beacons.

Lighting

the WA

Y

•MBs są nowymi sondami o kształcie główki od
szpilki

które emitują fluorescencje kiedy zhybrydyzują z

komplementarnym do nich DNA/RNA.

•Molecular beacons zostały niedawno odkryte

przez Tyagi i Kramera z Public Health Research
Institute,

New York, USA

Budowa Molecular Beacon

Perlette andTan 2001

specyficzna dlamRNA -actyny,

fluorescencyjne obrazy co 3-min

Actin mRNA

Tyagi and Alsmadi 2004

Tyagi and Alsmadi 2004

Nie do każdego fragmentu szukanego RNA należy konstruować sondę
typu MB

Wavelength-shifting molecular beacons

System 2x Molecular Beacon

Santangelo et al. 2004

Jak wprowadza się sondy typu Molecular beacon

do wnętrza komórki ?

1. Mikroiniekcja

2. Hybrydowe sondy MB

Ostatnie badania pozwoliły zidentyfikować
małe

regiony

w

niektórych

białkach

(9±16

aminokwasów)

nazwanych protein transduction domains
(PTDs) lub

cell penetrating peptides (CPPs) które które

powodują, że białka je posiadające mają
zdolność do

łatwego przenikania przez memnrany

Sondy typu PNA – Peptide Nucleic Acid

Trzy rodzaje sond typu PNA
posadających

różny

sposób

przyłączenia

peptydu do sondy typu
molecular beacon.

Konstructy PNA molecular beacon wnikają do wnętrza żywej
komórki w ciągu 30 min z prawie 100% wydajnością.

Nitin N. at al. 2004

Problem 1: hybrydy RNA/DNA

są potencjalnym celem dla

komórkowych RNAz

Rozwiązanie :
Sondy MB typu 2`-o-methyl RNA

Jakieś inne problemy?

Fluorescencyjnie znakowane 2`-o-methyl
RNA

Molenaar et al. 2001

Kiedy oligonukleotydowe sondy są wstrzykiwane do komórek
żeby pokazać rozkład RNA, są one szybko transportowane
i zatrzymywane na terenie jądra.

Rezultat trudno wykrywać mRNA w cytoplazmie żywych komórek.

Rozwiązanie – e.g. tRNA molecular beacons

Znakowane tRNAs, po wniknięciu do jądra
są następnie eksportowane do cytoplazmy.

Mhlanga M. et al. 2005

Fig c – obraz złożony pokazujący komórki po 30 min
of inkubacji. Czerwona fluorescencja - tRNA-MB
zielona fluorescencja zwykłych MB.

Mhlanga M. et al. 2006

Jak hybrydyzować do DNA w żywej komórce?

Główny problem denaturacja dwunicowego DNA

Hybrydizacja DNA i PNA Molecular Beacon do
jedno i dwuniciowego DNA

1. PNA otwieracze tworzą tripletowe struktury na

flankach szukanej sekwencji

2. Kiedy dsDNA jest otwarty sondy typu MB mogą

hybrydyzować do drugiej nici.

PNA denaturacja i Molecular Beacon`s in vivo fluorescencenccja
hybrydizacja do chromosomalnych telomerowych powtórzonych
sekwencji w żywej komórce

Tanke et al. 2006

Molecular Beacon:

nowe zastosowanie do detekcji białek w żywych
komórkach

Sekwencje przyłączające
się do białek SSB

Nowe spojrzenie na regulacje

ekspresji genetycznej

Reinicjacja transkrypcji

Transkrypcja jest procesem powtarzalnym, podczas którego
następuje synteza wielu identycznych kopii RNA z tego
samego genu

W ujęciu klasycznym w skrócie proces ten odbywa się w czterech etapach:
* rozpoznanie promotora genu, etapy *inicjacji, *elongacji i *terminacji transkrypcji

Pytania:
1. Kiedy gen zostanie już raz uruchomiony, czy następne cykle
transkrypcyjne przebiegają w ten sam sposób czy następuje
„przetarcie szlaku”?
2. Czy istnieją mechanizmy zatrzymujące przy genie maszynerię
transkrypcyjną po każdym cyklu?
3. Czy sam gen i jego otoczenie ulegają w takim przypadku
„imprintingowi transkrypcyjnemu”

Tworzenie PIK*

Mechanizm zależnej od matrycy reinicjacji transkrypcji

*PIK -

P

renic

j

acyjny

k

ompleks

Przyłączenie

polimerazy

RNA

Inicjacja, elongacja
i terminacja syntezy
RNA

(a)
Reinicjacja podstawowa

(b)
Reinicjacja typu PIK

(c)
Szybka reinicjacja

Oddysocjowanie
RNA

(b) W PIK reinicjacji podczas pierwszego
cyklu matryca jest modyfikowana.
Powstaje stabilny kompleks DNA-białka.
Zawiera on wszystkie lub tylko niektóre
czynniki transkrypcyjne (TF) niezbędne
do następnego cyklu transkrypcji.
Charakterystyczna dla wszystkich trzech
polimeraz eukariotycznych

(a)

Podstawowy

szlak

reinicjacji

transkrypcji. Wszystkie procesy i etapy
które odbywają się w pierwszej rundzie
transkrypcyjnej

muszą

zostać

powtórzone w każdym kolejnym cyklu.
Charakterystyczny

dla

polimeraz

bakteryjnych.

(c) W szybkiej reinicjacji polimeraza
może

prowadzić

wiele

cykli

transkrypcyjnych na tym samym genie
bez oddysocjowania przy każdym cyklu.
Występuje tylko dla polimerazy III

Mechanizm zależnej od białek reinicjacji transkrypcji

(model uproszczony nie zawiera czynników elongacyjnych i terminacyjnych)

Matryca DNA

Białkowe składniki

transkrypcyjne

Regeneracja

Transkrypcja

DNA, RNA

DNA, RNA

DNA, RNA

Modyfikacje
odwracalne

Inaktywacja

nieodwracalna

Bezpośrednia

reaktywacja

100 aktywnych genów 5S rDNA produkuje ~ 2000 kopii 5S
rRNA w ciągu minuty. Jeden cykl zachodzi co 3 sekundy.

Wydajność transkrypcji ~ 40 nukleotydów/sekunde.

Długość 5S rRNA ~ 120 nukleotydów.

Czas na reinicjacje pozostaje mniej niż pół sekundy!!!

5’ sekwencje flankujące A-blok B-blok Terminacja

Pol III

TFIIIC

TFIIIB

Transkrypcja

Szybka reinicjacja

Eukariotyczna polimeraza III